Методические указания МУК 4.1.1609-03 "По спектрофотометрическому измерению концентрации целлюлазы в воздухе рабочей зоны" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 29 июня 2003 г.)

Методические указания МУК 4.1.1609-03
"По спектрофотометрическому измерению концентрации целлюлазы в воздухе рабочей зоны"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 29 июня 2003 г.)

Дата введения: с момента утверждения

Ферментный препарат целлюлаза, (К 3.2.1.4--1,4-глюкан-4-глюканогидролаза).

М.м. 65000.

Целлюлаза - порошок сероватого цвета со слабым запахом дрожжей.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

Обладает общетоксическим действием. Малотоксична при различных путях воздействия на организм. При ингаляции пыль целлюлазы вызывает раздражение верхних дыхательных путей.

ПДК в воздухе рабочей зоны - 2 (аэрозоль).

Характеристика метода

Метод основан на количественном определении восстанавливающих эквивалентов, в основном целлобиозы, образующихся при гидролизе целлюлозы целлюлазой; используется способность калия железосинеродистого менять свой цвет при окислительно-восстановительной реакции с восстанавливающими эквивалентами. Измерение производят при длине волны 390-420 нм (оптимальная длина волны 405 нм). Субстратом для целлюлазы служит бумага для физико-химических анализов, представляющая собой практически чистую целлюлозу. Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр АФА-ВП-10.

Нижний предел измерения содержания целлюлазы в анализируемой пробе 3.2 мкг.

Нижний предел измерения концентрации в воздухе (при отборе 16 л воздуха) - 1.0 .

Диапазон измеряемых концентраций 1-10 .

Суммарная погрешность измерения не превышает %.

Время выполнения измерения, включая отбор проб, не более 1.5 часов.

Определению мешают хондрозин, мелибиоза, мальтоза, лактоза, ксилобиоза, гиалобиуроновая кислота, мурамовая кислота.

Приборы, аппаратура, посуда

- Колориметр фотоэлектрический лабораторный (фотоэлектроколориметр) по ГОСТ 12083, обеспечивающий измерения в интервалах длин волн 390-420 нм (оптимум 405 нм).

- Весы лабораторные ВЛР-200, ГОСТ 24104-88Е.

- Аспирационное устройство, модель 822, ТУ 64-1-862-72.

- Фильтродержатель, ТУ 96-72-05-77.

- Фильтры АФА-ВП-10, ТУ 95-743-80.

- Баня водяная с температурой терморегулирования °С.

- Термостат или ультратермостат, обеспечивающий температуру нагрева °С.

- Секундомер, ГОСТ 5072-79.

- Стаканчики СВ-19/9 и 24/10, ГОСТ 25336-82Е.

- Стаканы вместимостью 25 мл, ГОСТ 25336-82Е.

- Колбы 50, 100, 200, 500, 1000 мл, ГОСТ 1770-74Е.

- Пипетки 1 и 10 мл, ГОСТ 29227-91.

- Пробирки П1-14-120 ХС или П1-16-150, ГОСТ 25336-82Е.

Реактивы, растворы и материалы

- Целлюлаза, целлюлолитическая активность 1000 ед.г, ТУ 9231-008-05800805-93.

- Бумага для медицинских и физико-химических анализов в качестве субстрата, ТУ 13-7308001-778-89.

- D-глюкоза, ГОСТ 6086-79.

- Ацетатный буферный раствор, рН 4.7, готовый, ГОСТ 4919.2

- Натрий углекислый, ГОСТ 83-79.

- Калий железосинеродистый, ГОСТ 4206-75.

- Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

Все реактивы должны быть марки х.ч. или ч.д.а.

Подготовка к измерению

1. Приготовление стандартного раствора целлюлазы, 16 мкг/мл.

8.0 мг целлюлазы помещают в стеклянный стаканчик, тщательно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой. Окончательно полученный раствор разводят в 10 раз. Стандартный раствор готовят в день проведения анализа.

2. Приготовление растворов целлюлазы для построения градуировочного графика.

Для градуировочного графика растворы приготовляют согласно табл.

Таблица

NN п/п	Объем стандартного раствора целлюлазы, мл	Объем дистиллята, мл	Концентрация целлюлазы, мкг/мл	Содержание целлюлазы в объеме пробы (2 мл), взятой для анализа, мкг
1	2	3	4	5
1	0.0	10.0	0.0	0.0
2	1.0	9.0	1.6	3.2
3	1.5	8.5	2.4	4.8
4	2.5	7.5	4.0	8.0
5	5.0	5.0	8.0	16.0
6	7.5	2.5	12.0	24.0
7	10.0	0.0	16.0	32.0

3. Приготовление раствора калия железосинеродистого, 0.60 мг/мл.

6.00 г углекислого натрия растворяют в 200 мл дистиллированной воды и переносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл.

Затем в эту же колбу добавляют 0.60 г калия железосинеродистого. Объем доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Раствор хранят при комнатной температуре в темном месте в течение 2-х месяцев.

Проведение измерений и построение градуировочного графика

1. Гидролиз целлюлазы.

Полоску бумаги массой 100.0 мг складывают гармошкой, помещают в пробирку и заливают 2 мл готового ацетатного буферного раствора. Пробирку помещают на водяную баню с температурой °С и прогревают в течение 10 мин. Затем в пробирку добавляют 2 мл пробы, содержащей известное количество целлюлазы (концентрации целлюлазы указаны в таблице), и гидролизуют в течение 15 минут (точно).

Аналогично приготавливают холостую пробу, где вместо раствора, содержащего целлюлазу, добавляют 2 мл дистиллята.

2. Проведение цветной реакции.

После этого из пробирок, содержащих опытную и холостую пробы, в другие пробирки отбирают по 0.2 мл реакционной смеси, приливают по 6 мл раствора калия железосинеродистого, смесь прогревают при температуре 100°С в течение 10 мин на водяной бане, затем охлаждают до комнатной температуры.

3. Проведение оптических измерений.

Оптическую плотность определяют на ФЭКе при длине волны

405 нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 5.0 мм.

Колориметрирование опытной и холостой проб ведут на фоне дистиллированной воды: определяют соответствующие оптические плотности - и .

4. Построение градуировочного графика для целлюлазы.

Строят график, где по оси абсцисс располагают содержание фермента в пробе (5-я графа таблицы), взятой для анализа, а по оси ординат - разность - ; график строят по средним значениям разности оптической плотности для каждой концентрации. На каждую концентрацию производят по 5 параллельных определений.

Проверку калибровочного графика проводят при смене реактивов, оборудования или приборов, и не реже, чем 1 раз в месяц.

Определение концентрации целлюлазы в воздухе рабочей зоны

Отбор проб воздуха.

Для определения 0.5 ПДК целлюлазы необходимо отобрать 16 л воздуха. Пробы воздуха с объемным расходом 5 л/мин отбирают на фильтры АФА-ВП-10. Срок хранения отобранных проб в холодильнике до 1 суток.

Экстракция целлюлазы с фильтра.

Фильтр с отобранной пробой, содержащей целлюлазу из воздуха рабочей зоны, помещают в стакан и приливают 5.0 мл дистиллированной воды. Периодически встряхивая, выдерживают раствор в течение 5 мин и сливают в пробирку. Аналогичным образом проводят повторную экстракцию с фильтра и объединяют растворы. Общий объем элюата составляет 10.0 мл.

Измерения проводят точно так же, как и при установлении градуировочного графика, отбирая для анализа 2 мл из общего объема элюата. Находят - , соответствующие данному образцу воздуха.

Если значения оптической плотности выходят за пределы рабочей зоны градуировочного графика целлюлазы (Д = 0.060...0.600), то опыт необходимо повторить с раствором, имеющим большее или меньшее содержание ферментного препарата.

Обработка результатов

Определение содержания целлюлазы в анализируемой пробе.

Количественное определение содержания целлюлазы в объеме пробы, взятой для анализа (2 мл), проводят по предварительно построенному калибровочному графику, определяя соответствие полученной разности - содержанию целлюлазы в пробе (5-я графа таблицы).

Вычисление концентрации целлюлазы в воздухе рабочей зоны.

Концентрацию целлюлазы в воздухе () вычисляют по формуле:

, где:

а - содержание целлюлазы в объеме пробы, взятом для анализа (мкг);

б - объем анализируемой пробы (мл);

в - общий объем элюата с воздушного фильтра (мл);

V - объем воздуха (л), отобранный для анализа и приведенный к стандартным условиям (см. Приложение 1).

Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации - Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко