Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 54755-2011 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa" (утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 944-ст)

Food products. Methods for detection and quantity determination of Pseudomonas aeruginosa bacteria

Дата введения - 1 января 2013 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления бактерий вида Pseudomonas aeruginosa и методы определения их количества:

- метод наиболее вероятного числа (НВЧ);

- метод посева на агаризованные селективно-диагностические среды - подсчет колоний.

Метод определения НВЧ предусмотрен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта не более 1500 или в 1  жидкого продукта не более 150 клеток бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.

Метод определения количества посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта не менее 1500 или в 1  жидкого продукта не менее 150 КОЕ бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 7218-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ Р ИСО 11133-1-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории

ГОСТ Р ИСО 11133-2-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 54004-2010 Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29228-91 (ИСО 835-2-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети "Интернет" или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим, ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 бактерии вида Pseudomonas aeruginosa: Аэробные грамотрицательные бактерии, которые образуют типичные колонии на агаризованных селективно-диагностических средах за счет образования пигментов (пиоционина и флюоресцина), дают положительную реакцию на оксидазу, типичные по биохимическим признакам, если испытания проводятся в соответствии с методами, установленными в настоящем стандарте.

3.2 выявление бактерий вида Pseudomonas aeruginosa: Определение присутствия или отсутствия бактерий вида Pseudomonas aeruginosa в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом.

3.3 определение количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa:

3.3.1 Количество бактерий, содержащееся в 1  или 1 г продукта, определенное путем посева продукта и (или) его разведений на агаризованную селективно-диагностическую среду, подсчете после инкубирования при температуре 37°С типичных колоний и подтверждении по отношению к окраске по Граму, присутствию оксидазы, образованию пигментов и по биохимическим признакам принадлежности бактерий из этих колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa. Подтверждение проводят по методам, приведенным в настоящем стандарте.

3.3.2 Количество бактерий, содержащееся в 1  или 1 г продукта, определенное по методу НВЧ, указанному в настоящем стандарте.

4 Метод выявления и определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa по методу НВЧ

Сущность методов

Метод выявления и определения НВЧ бактерий вида Pseudomonas aeruginosa основан на высеве определенного количества продукта и (или) разведений пробы продукта в жидкую неселективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды для подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa.

4.1 Метод выявления бактерий вида Pseudomonas aeruginosa

4.1.1 Предварительное обогащение в неселективной среде

В триптон-соевый бульон, приготовленный по 6.1, или сердечно-мозговой бульон, приготовленный по 6.2, высевают анализируемую пробу, затем посевы инкубируют при температуре (371)°С в течение (242) ч.

4.1.2 Выделение типичных колоний

На поверхность агаризованной селективно-диагностической среды высевают культуру, полученную по 4.1.1, посевы инкубируют при температуре (371)°С.

Посевы просматривают через (242) ч для определения присутствия колоний, типичных для бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.

4.1.3 Подтверждение принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa

Типичные колонии, полученные по 4.1.2, пересевают на поверхность питательного агара для дальнейшего подтверждения принадлежности выделенных культур к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa.

4.1.4 Схема выявления бактерий вида Pseudomonas aeruginosa приведена в приложении А.

4.2 Определение количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa

4.2.1 Предварительное обогащение в неселективной среде

В каждую из трех колб с 90  одной из неселективных сред по 4.1.1 вносят по 10  продукта, если продукт жидкий, или вносят по 10  исходного разведения продукта, приготовленного по ГОСТ 26669, в случае, если анализируемый продукт другой консистенции.

В каждую из трех пробирок с 9  одной из неселективных сред по 4.1.1 вносят по 1  продукта, если исходный продукт жидкий, или вносят по 1  исходного разведения (указанного выше) продукта в случае, если анализируемый продукт другой консистенции.

В каждую из трех пробирок с 9  одной из неселективных сред по 4.1.1 вносят по 1  первого десятикратного разведения продукта, если исходный продукт жидкий, или вносят по 1  первого десятикратного исходного разведения продукта в случае, если анализируемый продукт другой консистенции.

Посевы инкубируют при температуре (371)°С в течение (242) ч.

Выбор объема пробы для анализа или ее разведения зависит от предполагаемой обсемененности продукта или от нормативных значений.

4.2.2 Выделение типичных колоний, подтверждение принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa

Выделение типичных колоний, подтверждение принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa проводят по 4.1.2 и 4.1.3.

4.2.3 Схема определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa по методу НВЧ приведена в приложении А.

4.2.4 Наиболее вероятное число бактерий вида Pseudomonas aeruginosa в 1  или 1 г пробы продукта (НВЧ) рассчитывают исходя из числа посевов, в которых подтверждено присутствие этих бактерий. Определение наиболее вероятного числа бактерий вида Pseudomonas aeruginosa проводят в соответствии с приложением Б (таблица Б.1).

5 Метод определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa посевом на агаризованные селективно-диагностические среды - подсчет колоний

Сущность метода

Метод определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa посевом на агаризованные селективно-диагностические среды основан на высеве определенного количества продукта и/или его разведений на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, инкубировании посевов, подсчете типичных колоний, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa.

Разновидностью метода посева на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды является посев методом мембранной фильтрации.

5.1 Метод посева на агаризованные селективно-диагностические среды

5.1.1 На подсушенную поверхность агаризованной селективно-диагностической среды двух чашек Петри наносят 0,1 - 0,2  продукта, если продукт жидкий, или исходной суспензии в случае, если анализируемый продукт другой консистенции.

Две другие чашки Петри используют для исходной суспензии и/или десятикратных разведений продукта.

Внесенный в чашки Петри продукт или его исходные разведения распределяют по поверхности селективно-диагностической агаризованной питательной среды стерильным шпателем.

Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре (371)°С в течение (242) ч.

5.1.2 После инкубирования посевов отбирают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 типичных колоний. Подсчитывают на отобранных чашках Петри количество выросших типичных колоний.

При посеве методом мембранной фильтрации на них подсчитывают колонии даже в том случае, если их менее 15.

Выбирают по пять типичных колоний каждого типа для пересева на поверхность питательного агара для дальнейшего подтверждения принадлежности выросших культур к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa. Если число выросших колоний менее 5, то отбирают все выросшие колонии.

5.1.3 Число колоний на 1  или на 1 г продукта рассчитывают по ГОСТ 26670, исходя из числа подтвержденных типичных колоний, выросших на чашках Петри.

6 Питательные среды и реактивы

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред и реактивов, должны быть аналитического качества, а вода дистиллированной.

6.1 Среда для неселективного обогащения: Триптон-соевый бульон

6.1.1 Состав

Гидролизат казеина,г	17,0
Папаиновый перевар соевой муки, г	3,0
Натрий хлористый, г	5,0
Калия гидрофосфат, г	2,5
Глюкоза, г	2,5
Вода,	1000

6.1.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Нагревают среду на слабом огне до кипения, кипятят до полного растворения компонентов. Устанавливают рН так, чтобы он составлял (7,30,2) ед. рН при температуре 25°С. Разливают среду по колбам или пробиркам и стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при температуре (1211)°С.

6.2 Среда для неселективного обогащения: Сердечно-мозговой бульон

6.2.1 Состав

Настой мозга теленка, г	200,0
Настой мясной (из говядины), г	250,0
Протеозопептон, г	10,0
Натрий хлористый, г	5,0
Натрия гидрофосфат, г	2,5
Глюкоза, г	2,0
Вода,	550

6.2.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Нагревают среду на слабом огне до полного растворения компонентов. Устанавливают рН так, чтобы он составлял (7,30,2) ед. рН при температуре 25°С. Разливают среду по колбам или пробиркам и стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при температуре (1211)°С.

6.3 Основа агара с цетримидом

6.3.1 Состав

Перевар панкреатический желатина, г	20,0
Магния хлорид, г	1,4
Калия сульфат, г	10,0
Цетримид*, г	0,3
Агар, г	15,0
Вода,	1000
. . . . . . . . . . * Цетримид - четвертичное аммониевое соединение, обладающее антимикробной активностью.

6.3.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде, содержащей 10  глицерина. Нагревают среду на слабом огне до полного растворения компонентов, охлаждают до температуры (45 - 55)°С. Устанавливают рН так, чтобы он составлял (7,20,2) ед. рН при температуре 25°С, после чего среду стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при температуре (1211)°С.

6.4 Агар для выделения псевдомонад

6.4.1 Состав

Перевар панкреатический желатина, г	20,0
Магния хлорид, г	1,4
Калия сульфат, г	10,0
Иргасан (триклозан)*, г	0,025
Агар, г	13,6
Вода,	1000
. . . . . . . . . . * Триклозан - хлорсодержащее средство производное фенола.

6.4.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде, содержащей 10  глицерина. Нагревают среду на слабом огне до полного растворения компонентов, охлаждают до температуры (45 - 55)°С. Устанавливают рН так, чтобы он составлял (7,20,2) ед. рН при температуре 25°С, после чего среду стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при температуре (1211)°С.

6.5 Среда Гисса с мальтозой

Среду готовят по ГОСТ 10444.1 или по инструкции на этикетке.

6.6 ГРМ-агар (сухой питательный агар на основе гидролизата рыбной муки для культивирования микроорганизмов)

Среду готовят по инструкции на этикетке.

6.7 Мясо-пептонный агар

Среду готовят по ГОСТ 10444.1.

6.8 Нитратная среда

6.8.1 Состав

Бульон мясо-пептонный, Калий азотнокислый, г

1 1,0

6.8.2 Приготовление

В 1 мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, растворяют при нагревании 1,0 г азотнокислого калия. При приготовлении агаризованной среды в нее дополнительно добавляют 12 гагара.

Среду разливают по 5 - 6  в пробирки и стерилизуют при температуре (1211)°С в течение 15 мин. Агаризованную среду после стерилизации оставляют в наклонном положении для получения скошенной поверхности.

6.9 Реактив для определения оксидазы

6.9.1 Состав

N, N, N', N'-тетраметил-n-фенилендиаминдигидрохлорид, г Вода,

1,0 100

6.9.2 Приготовление

Растворяют реактив в холодной воде температурой (10 - 15)°С.

Реактив готовят непосредственно перед использованием.

Допускается использовать имеющиеся в продаже диски или полоски. При этом следуют рекомендациям изготовителя.

6.10 Для увеличения количества высеваемой анализируемой пробы продукта допускается использование неселективных сред двойной концентрации. При приготовлении жидких сред двойной концентрации количество ингредиентов или дегидратированной основы среды увеличивается в два раза, а количество воды остается без изменения.

6.11 Растворы и реактивы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.

6.12 Раствор сульфаниловой кислоты

6.12.1 Состав

Кислота сульфаниловая, г Кислота уксусная 30%-ная,

0,8 до 100

6.12.2 Приготовление

0,8 г сульфаниловой кислоты переносят, смывая раствором уксусной кислоты с объемной долей 30%, в мерную колбу вместимостью 100 . Объем доводят до метки тем же раствором уксусной кислоты. Раствор фильтруют через бумажный фильтр и хранят при температуре (42)°С в тщательно закупоренных сосудах из темного стекла не более 2 мес.

6.13 Раствор 1-нафтола

6.13.1 Состав

1-нафтол, г Кислота уксусная 30%-ная,

0,5 до 100

6.13.2 Приготовление

0,5 г 1-нафтола переносят, смывая раствором уксусной кислоты с объемной долей 30%, в мерную колбу вместимостью 100 . Объем доводят до метки тем же раствором уксусной кислоты. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

6.14 Раствор уксусной кислоты

6.14.1 Состав

Кислота уксусная ледяная, Вода,

30 до 100

6.14.2 Приготовление

30  ледяной уксусной кислоты вносят в мерную посуду вместимостью 100 . Объем доводят до метки дистиллированной водой.

Раствор готовят непосредственно перед использованием.

6.15 Допускается использование готовых и дегидратированных питательных сред, в т.ч. хромогенных, отечественного и импортного производства, зарегистрированных в установленном порядке.

Приготовление и применение питательных сред - в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 11133-1 и ГОСТ Р ИСО 11133-2.

7 Аппаратура, посуда, материалы и реактивы

Приемлемой альтернативой посуды многоразового применения является одноразовая посуда, если она отвечает соответствующим требованиям.

7.1 Оборудование лабораторное для микробиологических исследований - по ГОСТ Р ИСО 7218, ГОСТ 10444.1.

7.2 Аппарат для сухой стерилизации (стерилизационный сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав) с регулирующими устройствами для поддержания заданной температуры с допустимой погрешностью не более 1°С.

7.3 Термостат, поддерживающий температуру (371)°С.

7.4 Баня водяная, поддерживающая заданную температуру от 44°С до 47°С с погрешностью 0,5°С.

7.5 Прибор для мембранной фильтрации растворов.

7.6 Весы по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания: реактивов 0,1 мг, продукта 0,1 г.

7.7 Пробирки и колбы разной вместимости по ГОСТ 25336. Допускается использование флаконов или бутылок с нетоксичными металлическими или пластиковыми завинчивающимися крышками.

7.8 Микроскоп биологический, обеспечивающий просмотр в проходящем свете, с увеличением .

7.9 Петля платиново-иридиевая бактериологическая размером диаметра петли около 3 мм.

7.10 рН-метр с диапазоном измерений рН от 0 ед. рН до 14 ед. рН, погрешность измерений 0,01 ед. рН при температуре (20 - 25)°С.

7.11 Стекла предметные по ГОСТ 9284.

7.12 Стекла покровные по ГОСТ 6672.

7.13 Пипетки градуированные или автоматические, вместимостью от 1 до 10  по ГОСТ 29228.

7.14 Чашки Петри нормального размера (диаметр 100 мм) и/или большого размера (диаметр 150 мм) по ГОСТ 25336.

7.15 Штамм контрольный бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.

7.16 Мальтоза.

7.17 Перевар желатина панкреатический.

7.18 Настой мясной.

7.19 Настой мозга теленка.

7.20 Протеозопептон.

7.21 Гидролизат казеина ферментативный.

7.22 Триклозан.

7.23 Цетримид.

7.24 Перевар соевой муки папаиновый.

7.25 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов и материалов по качеству не хуже указанных выше.

8 Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб - по ГОСТ Р 54004, ГОСТ 26669.

Для испытания подготавливают представительную пробу, не поврежденную и не измененную при транспортировании и хранении.

9 Проведение испытания

9.1 Метод выявления бактерий вида Pseudomonas aeruginosa

9.1.1 Проба для анализа и исходное разведение

Приготовление исходного разведения пробы для анализа - по ГОСТ 26669.

9.1.2 Предварительное обогащение в неселективной среде

В зависимости от требуемых пределов выявления х жидкой пробы или х исходной суспензии, если анализируемый продукт другой консистенции, переносят в колбу или пробирку, содержащие среду по 6.1 или 6.2. Количество высеваемого продукта и количество питательной среды должно быть в соотношении 1:10.

Посевы инкубируют при температуре (371)°С в течение (242) ч.

При испытании высококислотных продуктов для предотвращения резкого снижения кислотности питательных сред (на 0,5 ед. рН и более) рН питательных сред после внесения в них продукта или его исходного разведения доводят до допустимых значений при помощи стерильного раствора гидроокиси натрия, приготовленного по ГОСТ 10444.1, или при приготовлении питательных сред рН устанавливают выше заданного с учетом его последующего снижения при внесении продукта. Объем добавляемого стерильного раствора гидроокиси натрия или величину, на которую необходимо увеличить рН при приготовлении питательных сред, устанавливают опытным путем.

Допускается доводить рН до нейтрального значения при помощи стерильного раствора гидроокиси натрия непосредственно в высококислотном продукте.

9.1.3 Выделение типичных колоний

Используя петлю, пересевают культуры из пробирок с неселективной питательной средой с признаками роста на поверхность одной из селективно-диагностических сред, приготовленных по 6.3 или 6.4.

Посевы инкубируют при температуре (371)°С в течение (242) ч.

9.1.4 Выбор типичных колоний для подтверждения

После инкубирования посевов по 9.1.3 отмечают рост типичных колоний.

На агаре с цетримидом бактерии вида Pseudomonas aeruginosa образуют колонии голубого, сине-зеленого, желто-зеленого цвета или могут быть непигментированными.

На агаре с триклозаном бактерии вида Pseudomonas aeruginosa образуют колонии синие, сине-зеленые, желто-зеленые или зеленые.

Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa на селективно-диагностических средах образуют колонии разного размера, часто с неровными краями.

Из каждой чашки, на которой обнаружены типичные колонии, выбирают по пять хорошо изолированных колоний каждого типа, отличающиеся по морфол