4. Специальная часть. Алгоритм проведения исследований по установлению МДК химических веществ в крови по критериям риска для здоровья при многосредовой экспозиции

4. Специальная часть. Алгоритм проведения исследований по установлению МДК химических веществ в крови по критериям риска для здоровья при многосредовой экспозиции

4.1. На первом этапе исследований определяется химическое вещество, подлежащее установлению МДК в крови детей. Для этого выполняется анализ данных, сформированных в соответствии с пп. 3.3.1 - 3.3.4.

4.2. На втором этапе осуществляется отбор детей, потенциально подверженных (основная группа) и неподверженных (контрольная группа) экспозиции исследуемого вещества (в соответствии с требованиями, представленными в разделе 3.4 настоящих методических рекомендаций) для изучения ответных реакций организма.

4.3. На третьем этапе осуществляется количественная оценка хронической экспозиции исследуемого вещества при поступлении в организм различными путями (пероральным, ингаляционным, накожным) в результате контакта с различными объектами внешней среды (вода, воздух, почва, продукты питания).

Оценка хронической экспозиции исследуемого вещества включает:

- идентификацию маршрутов воздействия, источников загрязнения, потенциальных путей распространения и точек воздействия;

- оценку воздействующих концентраций по результатам мониторинговых наблюдений качества объектов окружающей среды и/или результатов моделирования распространения исследуемого вещества. Оценивается среднегодовая концентрация (и ее верхние 95%-е доверительные границы), установленная по среднесуточным концентрациям. Для расчета, как правило, используются данные 3-летних наблюдений, но не менее чем за 1 год;

- моделирование распространения исследуемого вещества в атмосферном воздухе в соответствии с п. 3.2.4;

- расчет поступления исследуемого вещества в организм при конкретных путях воздействия.

4.3.1. Расчет суммарной средней суточной дозы, усредненной на годовую экспозицию, при различных путях поступления (ингаляционном, пероральном с питьевой водой, продуктами питания) исследуемого вещества в организм осуществляется с помощью стандартных значений факторов экспозиции и конкретных значений массы тела и возраста детей, входящих в основную и контрольную группу. Расчет выполняется по формулам, представленным в "Руководстве по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ, загрязняющих среду обитания" Р 2.1.10.1920-04, прилож. 3 [1].

4.3.2. Проводится сравнительный анализ среднесуточных доз исследуемого вещества для детей основной и контрольной групп. При этом устанавливается вклад каждого пути поступления в суммарную среднюю суточную дозу, определяется ведущий путь поступления и приоритетная среда экспозиции, поражаемые органы и системы при каждом пути поступления и при комплексном поступлении одновременно несколькими путями.

4.4. На четвертом этапе исследований выполняется количественная оценка содержания исследуемого вещества в крови детей основной и контрольной групп в течение 1 года (4-кратное исследование - 1 раз в 3 месяца).

4.4.1. Порядок забора и хранения проб биологического материала (кровь) для исследования:

- забор крови осуществляется процедурной медицинской сестрой, входящей в исследовательскую группу (п. 1.10.4), в специально оборудованном медицинском кабинете в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней";

- забор крови производится из локтевой вены (венозная) утром (натощак) в вакутейнер, содержащий антикоагулянт гепарин (зеленая крышка). Необходимо осторожно перемешать кровь с антикоагулянтом во избежание образования сгустков (не встряхивая). Проба маркируется с указанием идентификационного номера;

- объем крови, отобранной для количественной оценки содержания химического вещества, соответствует требованиям метода определения;

- пробы крови хранятся при температуре 0-4°С в течение 3-5 суток либо замораживаются (до -18°С) и хранятся 10-20 дней.

4.4.2. Химико-аналитическое исследование проб крови проводится в соответствии с действующими методическими документами, утвержденными органами государственного санитарно-эпидемиологического нормирования Российской Федерации:

- МУК 4.1.765-99 "Газохроматографический метод количественного определения ароматических (бензол, толуол, этилбензол, о-, м-, п-ксилол) углеводородов в биосредах (кровь)";

- МУК 4.1.767-99 "Газохроматографический метод количественного определения ароматических аминосоединений (анилин, N-метиланилин, о-толуидин, N,N-диметиланилин, N-этиланилин, К,К-диэтиланилин) в биосредах (кровь)";

- МУК 4.1.770-99 "Количественное определение формальдегида в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии";

- МУК 4.1.772-99 "Газохроматографическое определение концентраций метилового, этилового, изопропилового, пропилового, изобутилового и бутилового спиртов в крови";

- МУК 4.1.777-99 "Определение содержания цинка, никеля, меди и хрома в крови методом атомной абсорбции";

- МУК 4.1.2103-06 "Определение массовой концентрации ванадия в пробах крови методом атомно-адсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией";

- МУК 4.1.2106-06 "Определение массовой концентрации марганца, свинца, магния в пробах крови методом атомно-адсорбционной спектрометрии";

- МУК 4.1.2108-06 "Определение массовой концентрации фенола в биосредах (кровь) газохроматографическим методом";

- МУК 4.1.2111-06 "Измерение массовой концентрации формальдегида, ацетальдегида, пропионового альдегида, масляного альдегида и ацетона в пробах крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии";

- МУК 4.1.2112-06 "Определение массовой концентрации хлороформа, 1,2-дихлорэтана, тетрахлорметана, хлорбензола в биосредах (кровь) газохроматографическим методом";

- МУК 4.1.2115-06 "Определение массовой концентрации хлороформа, 1,2-дихлорэтана, тетрахлорметана в биосредах (кровь) методом газохроматографического анализа равновесного пара";

- МУК 4.1.2116-06 "Измерение массовой концентрации стирола в пробах крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии";

- МУК 4.1.2106-06 "Определение массовой концентрации марганца, свинца, магния в пробах крови методом атомно-адсорбционной спектрометрии".

4.4.3. Полученная величина концентрации исследуемого вещества в крови (за исключением ксенобиотиков) детей основной и контрольной групп сопоставляется с референтной концентрацией, рекомендованной по результатам исследований ведущих отечественных и зарубежных центров [2]. Сравнение количественных величин в случае нормального распределения показателей проводится с использованием двухвыборочного критерия Стьюдента (t) с уровнем значимости 0,05.

Критерием адекватности выбора неэкспонированной группы детей (контрольной) является отсутствие достоверных различий концентрации исследуемого вещества в крови с референтным уровнем (или фоновым региональным уровнем в случае геохимически обусловленных территориальных особенностей содержания в объектах среды обитания).

Критерием адекватности выбора экспонированной группы детей (основной) является наличие достоверных различий средней концентрации исследуемого вещества в их крови и крови детей контрольной группы.

4.4.4. Информация о полученных значениях концентрации вещества в крови по каждому наблюдению (основной и контрольной группы) фиксируется в твердых копиях и на электронных носителях в виде информационной базы данных.

4.5. На пятом этапе проводится обоснование маркера экспозиции. Для обоснования маркера экспозиции должна быть установлена связь между экспозицией (средней годовой концентрацией вещества в приоритетной среде воздействия) и средней годовой концентрацией вещества в крови. Критерием обоснования маркера экспозиции является наличие достоверной связи с экспозицией.

Связь устанавливается методом математического моделирования зависимости концентрации анализируемого вещества в крови детей (основная и контрольная группа) от концентрации (или средней суточной дозы) при различных путях поступления в организм, в первую очередь ведущем.

Математическая модель, описывающая анализируемую зависимость в условиях низких доз/концентраций, представляет собой линейное уравнение вида:

, где (3)

D - средняя годовая концентрация (или доза) исследуемого вещества, , (или ;

x - средняя годовая концентрация исследуемого вещества в крови, ;

- параметры модели, характеризующие начальный уровень концентрации вещества в крови и скорость абсорбции.

Расчет параметров модели и проверку адекватности осуществляют стандартной процедурой линейного регрессионного анализа. Для проверки статистических гипотез относительно коэффициентов регрессии в случае нормального распределения показателей используется критерий Стьюдента. Проверка адекватности осуществляется при помощи дисперсионного анализа с использованием критерия Фишера с уровнем значимости 0,05.

При установлении адекватной модели, отражающей исследуемую зависимость, концентрация вещества в крови принимается в качестве маркера хронической экспозиции.

4.6. На шестом этапе проводится исследование и количественная оценка ответных реакций организма на хроническую экспозицию исследуемого химического вещества.

Ответные реакции организма на хроническую экспозицию исследуемого вещества могут быть выявлены в виде:

- повышенной заболеваемости поражаемых органов и систем экспонированной группы детей относительно неэкспонированной группы детей;

- отклонения гематологических, биохимических, иммунологических показателей относительно возрастной физиологической нормы и показателей контрольной группы.

Анализ заболеваемости проводится по данным обращаемости за медицинской помощью в поликлинику по месту проживания за период, предшествующий исследованию (не менее 1 года).

Перечень лабораторных тестов должен включать показатели, характеризующие специфические и неспецифические ответные реакции организма с учетом риска заболевания критических органов и систем при возможных путях поступления исследуемого вещества.

4.6.1. Исследование лабораторных показателей проводится с использованием современных методов. Примерный перечень ожидаемых видов нарушений здоровья, гематологических, биохимических, иммунологических показателей ответных реакций и методов их исследования в зависимости от фактора экспозиции и путей поступления, представлен в прилож. 5, 6.

4.6.2. Порядок забора, подготовки и хранения проб биологического материала (цельной крови, сыворотки крови, мочи, слюны, желчи) для лабораторного исследования.

4.6.2.1. Забор крови осуществляется процедурной медицинской сестрой в специально оборудованном медицинском кабинете в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней". Забор крови производится из локтевой вены (венозная) утром (натощак) в вакутейнер, содержащий гепарин (зеленая крышка) для получения плазмы крови; в вакутейнер без антикоагулянта (сиреневая крышка) - для получения сыворотки крови. Необходимо осторожно перемешать кровь с антикоагулянтом во избежание образования сгустков (не встряхивая). Проба маркируется с указанием идентификационного номера. Пробы крови хранятся при температуре 0-4°С в течение 3-5 суток либо замораживаются (до -18°С) и хранятся 10-20 дней.

4.6.2.2. Порядок получения сыворотки крови.

После забора крови необходимо осторожно однократно перевернуть пробирку для более полного контакта крови с активатором свертывания. Процесс свертывания крови происходит в течение 20-30 мин или 7-10 мин для пробирок с оранжевой крышкой при комнатной температуре и вертикальном положении пробирки. После окончания свертывания крови центрифугировать пробирку со свернувшейся кровью не менее 10 мин с ускорением 1 500 G (примерно 3 000 об./мин) для максимального выдавливания сыворотки из сгустка. При необходимости допускается центрифугирование с ускорением 4 000 G с крышечкой и до 12 00 G без крышечки.

После центрифугирования и полной ретракции сгустка сыворотка располагается над сгустком, но в контакте с ним. Сохраняется опасность загрязнения сыворотки составляющими сгустка при неосторожном обращении с пробиркой (встряхивание, опрокидывание и пр.).

Для лучшего очищения сыворотки и более полного разграничения сыворотки и сгустка применяются специальные пробирки, содержащие биологически инертный олефиновый гель. Последний представляет собой тиксотропный кополимер, изменяющий свою вязкость в зависимости от приложенной к нему силы центрифугирования, поэтому после центрифугирования гель в виде тонкой полоски занимает промежуточное положение и служит разделительным барьером. Стабильность такого барьера гарантирована в течение 5-7 дней при хранении пробирки с кровью при комнатной температуре.

Оптимальный срок сохранности образца крови в данных пробирках составляет при комнатной температуре 6 ч, при хранении в условиях холодильника (4°С) - 24 ч. Повторное центрифугирование пробирок, особенно с гелем, не допускается.

4.6.2.3. Сбор мочи осуществляется (утренняя порция) в контейнер для сбора мочи объемом не менее 50 . Проба маркируется с указанием идентификационного номера. Срок хранения в условиях холодильника (4°С) 2 ч.

4.6.2.4. Сбор слюны осуществляется с помощью стерильного тампона, состоящего из абсорбирующего материала (хлопка), в стерильную сухую пробирку согласно ГОСТ Р 53079.4-08. Проба маркируется с указанием идентификационного номера. Пробы слюны хранятся в условиях морозильной камеры (замораживаются до -18°С) до 20-30 дней.

4.6.2.5. Сбор желчи осуществляют при выполнении процедуры дуоденального зондирования. Желчь собирают в ряд пробирок в течение 5 мин. Для анализа исследуют порцию В и С. Пробы маркируются с указанием идентификационного номера.

4.6.3. Порядок проведения исследований, требования к квалификации персонала, оснащению средствами измерений и вспомогательным оборудованием, применяемые методики должны соответствовать требованиям нормативных правовых и методических документов по проведению лабораторных исследований у человека, утвержденных в установленном порядке, действующих на территории Российской Федерации.

4.6.4. Информация о полученных значениях исследованных лабораторных показателей ответных реакций у детей основной и контрольной групп фиксируется в твердых копиях и на электронных носителях в виде информационной базы данных.

4.6.5. Оценка отклонений показателей ответных реакций организма детей основной группы проводится при сравнительном анализе со значением показателя в контрольной группе; детей контрольной группы - с возрастной физиологической нормой. Сравнение количественных величин в случае нормального распределения показателей проводится с использованием двухвыборочного критерия Стьюдента (t) с уровнем значимости 0,05.

4.7. На седьмом этапе проводится обоснование маркеров эффекта при хроническом воздействии исследуемого химического вещества.

4.7.1. Обоснование маркеров эффекта проводится на основании установления и оценки зависимости вероятности отклонения исследуемых лабораторных показателей ответных реакций у детей основной группы относительно аналогичного показателя у детей контрольной группы от концентрации исследуемого вещества в крови.

4.7.2. Для установления данной зависимости необходимо последовательное выполнение следующих шагов.

Шаг 1. Формирование таблицы данных согласованных значений концентрации вещества в крови и лабораторного показателя ответных реакций для каждого наблюдения.

Шаг 2. Расчет вероятности отклонения лабораторного показателя от аналогичного показателя в контрольной группе в зависимости от концентрации вещества в крови.

Шаг 3. Оценка параметров математической модели.

Шаг 4. Экспертная оценка установленных зависимостей.

4.7.3. Формирование таблицы данных согласованных значений концентраций исследуемого вещества в крови и значений лабораторных показателей ответных реакций для каждого наблюдения (1...n) производится по шаблону, представленному в табл.1.

Таблица 1

Шаблон таблицы согласованных данных по каждому наблюдению

Номер наблюдения	Концентрация исследуемого вещества в крови	Значение лабораторного показателя ответной реакции организма
1
2
3

4.7.4. Расчет вероятности отклонения лабораторного показателя от показателя в контроле в зависимости от концентрации вещества в крови для каждого наблюдения в таблице данных проводится с использованием технологии "скользящего окна". Для этого для каждого значения концентрации исследуемого вещества в крови производится расчет вероятности отклонения лабораторного показателя от значения в контроле , вычисленной для диапазона ("скользящего окна"):

, где (4)

- ширина "скользящего окна", которая определяется из соотношения:

, где (5)

N - общее число исследований для всей совокупности.

Оценка вероятности отклонения лабораторного показателя от контроля производится по классической формуле вероятности:

, где (6)

- число исследований по i-му лабораторному показателю, отклоняющихся от значения в контроле для диапазона ;

- общее число исследований по i-му лабораторному показателю для диапазона .

Графическая иллюстрация процесса оценки вероятности отклонения лабораторного показателя от значения в контроле с использованием скользящего окна" представлена на рис. 1.

4.7.5. Оценка параметров зависимости вероятности отклонения лабораторного показателя относительно контроля от концентрации исследуемого вещества в крови проводится методом построения логистической регрессионной модели:

, где (7)

p - вероятность отклонения лабораторного показателя от значения в контроле;

x - концентрация исследуемого вещества в крови, ;

- параметры математической модели.

Для построения модели из таблицы данных используется информация по концентрациям вещества в крови по каждому наблюдению и соответствующим им значениям вероятностей.

Определение параметров математической модели производится методом наименьших квадратов с применением пакетов программ по статистическому анализу данных (Statistica, SPSS, SAS и др.).

4.7.6. Оценка обоснованности использования лабораторного показателя в качестве маркера эффекта при повышении концентрации исследуемого вещества в крови проводится на основании проверки адекватности модели наблюдаемым данным и экспертной оценки полученной зависимости. Оценка адекватности модели проводится на основе однофакторного дисперсионного анализа по критерию Фишера. При построении математических моделей осуществляется определение 95%-х доверительных границ.

Лабораторный показатель будет являться маркером эффекта при воздействии маркера экспозиции при наличии установленной достоверно значимой зависимости (требование адекватности модели), величине коэффициента корреляции не меньше, чем 0,3 и положительной экспертной оценки полученной зависимости. На основании полученных зависимостей устанавливается перечень маркеров эффектов, который используется в дальнейшем для установления недействующих (реперных) уровней содержания вещества в крови.

4.8. На восьмом этапе проводится расчет реперных концентраций исследуемого вещества в крови для каждого маркера эффекта при хронической многосредовой экспозиции. Расчет реперной концентрации исследуемого вещества в крови детей включает последовательное выполнение следующих шагов:

Шаг 1. Формирование таблицы данных согласованных значений концентрации вещества в крови и маркеров эффекта для каждого наблюдения.

Формирование таблицы данных согласованных значений концентраций исследуемого вещества в крови и значений маркеров эффекта для каждого наблюдения (1...n) производится по шаблону, представленному в табл. 2.

Таблица 2

Шаблон таблицы согласованных данных по каждому наблюдению

Номер наблюдения	Концентрация исследуемого вещества в крови	Значение маркера эффекта
1
2
3

Шаг 2. Расчет показателя отношения шансов для каждой концентрации химического вещества в крови.

Показатель отношения шансов (OR) позволяет оценить наличие и силу связи между маркером экспозиции и маркером эффекта. В качестве критерия наличия связи принимается условие OR 1 [3]. Отношение шансов рассчитывается по стандартной формуле с использованием алгоритма, представленного в табл. 3:

, где (8)

a - количество наблюдений с повышенным содержанием исследуемого химического вещества в крови и наличием отклонения лабораторного показателя от физиологической нормы (группа наблюдений);

b - количество наблюдений с повышенным содержанием исследуемого химического вещества в крови и отсутствием отклонения лабораторного показателя (группа наблюдений);

с - количество наблюдений с отсутствием повышенного содержания исследуемого химического вещества в крови и наличием отклонения лабораторного показателя от физиологической нормы (контрольная группа);

d - количество наблюдений с отсутствием повышенного содержания исследуемого химического вещества в крови и отсутствием отклонения лабораторного показателя (контрольная группа).

Таблица 3

Алгоритм вычисления показателя отношения шансов

Концентрация вещества в крови относительно верхней границы допустимого уровня в крови	Отклонение лабораторного показателя		Сумма
	есть	нет
Есть повышенная концентрация в крови (группа наблюдения)	a	b	a + b
Нет повышенной концентрации в крови (контрольная группа)	c	d	c + d

Для расчета показателя отношения шансов для каждого наблюдения в таблице данных производится условное деление выборки на две части: ниже текущего уровня концентрации исследуемого вещества в крови и выше текущего уровня концентрации исследуемого вещества в крови соответственно и . Для обоих интервалов рассчитывается величина, характеризующая вероятность отклонения маркера эффекта от значения в контроле ( и соответственно) как отношение числа наблюдений, отличающихся от контроля, к общему числу наблюдений. Схематично технология деления выборки на две части представлена на рис. 2.

Отношение шансов для каждой концентрации исследуемого вещества в крови определяется из соотношения:

, где (9)

i - индекс, отражающий номер наблюдения.

Достоверность рассчитанного показателя отношения шансов оценивается по 95%-му доверительному интервалу (DI), в пределах которого находится истинное значение показателя отношения шансов. Связь является достоверно установленной при нижней границе доверительного интервала больше 1 (единица - это критерий отсутствия различий между сравниваемыми группами).

Шаг 3. Построение модели зависимости показателя отношения шансов от концентрации исследуемого вещества в крови и оценка ее параметров.

Оценка параметров зависимости показателя отношения шансов от концентрации исследуемого вещества в крови проводится методом построения регрессионной модели в виде экспоненциальной функции:

, где (10)

- параметры модели, определяемые методом регрессионного анализа.

Построение модели осуществляется на основании данных о концентрации исследуемого вещества в крови с годовым периодом осреднения и соответствующем значении отношения шансов отклонения маркера эффекта относительно значения показателя в контроле по каждому наблюдению.

Определение параметров математической модели производится методом наименьших квадратов с применением пакетов программ по статистическому анализу данных (Statistica, SPSS, SAS и др.). Проверка адекватности модели осуществляется дисперсионным анализом с использованием критерия Фишера с уровнем значимости 0,05.

Шаг 4. Расчет реперного уровня содержания исследуемого вещества в крови.

Расчет реперной кондентрации исследуемого вещества в крови для каждого маркера эффекта проводится исходя из условия OR=1, по формуле:

(11)

Оценка адекватности модели проводится на основе однофакторного дисперсионного анализа по критерию Фишера. При построении математических моделей осуществляется определение 95%-х доверительных границ точечных оценок реперных концентраций исследуемого вещества в крови. При этом в качестве реперной концентрации исследуемого вещества в крови принимается значение верхней 95%-й доверительной границы для каждого маркера эффекта.

Для определения максимально допустимой концентрации исследуемого вещества в крови детей используется принцип "лимитирующего показателя", то есть из имеющегося ряда 95%-х верхних доверительных границ реперных среднегодовых концентраций вещества в крови для каждого маркера эффекта определяется наименьшая, которая рекомендуется в качестве максимально допустимой концентрации для условий многосредовой хронической экспозиции:

, где (12)

- значение максимально допустимого уровня содержания исследуемого вещества в крови по отношению к j-му маркеру эффекта.

Данная концентрация может быть рекомендована в качестве максимально допустимой концентрации химического вещества в крови при многосредовой хронической экспозиции.