Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания Т-2 токсина в пищевых продуктах и продовольственном сырье (утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР от 29 декабря 1984 г. N 3184-84)

Т-2 токсин - 8-(3-метилбутирилокси)-4,15-диацетокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен-3-ол - микотоксин, продуцируемый различными видами микроскопических грибов рода Puearium. Наиболее распространенными продуцентами Т-2 токсина являются грибы Puearium sporotrichiella, которые рассматриваются как этиологический фактор тяжелых алиментарных токсикозов человека и сельскохозяйственных животных.

Т-2 токсин является одним из наиболее токсичных представителей группы трихотеценовых микотоксинов, токсическое действие которых характеризуется поражением кроветворных и иммунокомпетентных органов, развитием геморрагического синдрома, лейкопенией, анемией, поражением функций желудочно-кишечного тракта. Т-2 токсин обладает высокой острой токсичностью ( для различных видов млекопитающих от 3 до 10 мг/кг массы тела).

Опасность, которую трихотеценовые микотоксины могут представлять для здоровья человека, связана с повсеместной распространенностью грибов-продуцентов, преимущественно поражающих зерно и зернопродукты, и их высокой токсичностью. В связи в этим установлена ПДК на содержание Т-2 токсина в пищевых продуктах на уровне 0,1 мг/кг.

Т-2 токсин - белое кристаллическое вещество молекулярной массой 466, не имеет максимумов поглощения в УФ-спектре при длине волны более 210 нм, не обладает флуоресценцией. Т-2 токсин хорошо растворим в бензоле, ацетоне, этилацетате, спиртах, практически нерастворим в воде и гексане. Температура плавления Т-2 токсина 151-152°С.

Для обнаружения Т-2 токсина при тонкослойной хроматографии (ТСХ) используется его свойство флуоресцировать в длинноволновом УФ-свете (365 нм) после обработки спиртовым раствором серной кислоты с последующим нагреванием при 100-105°С. Этим методом можно обнаружить до 100 нг Т-2 токсина в пятне. Наиболее достоверным и высокочувствительным методом обнаружения и идентификации Т-2 токсина является газожидкостная хроматография (ГЖХ) его летучих производных с использованием детектора электронного захвата (ДЭЗ), который позволяет обнаруживать до 1-2 нг токсина в пике.

В основу предлагаемого метода определения Т-2 токсина положена ГЖХ трифторацетильного (ТФА) производного этого токсина с использованием ДЭЗ.

Предел обнаружения Т-2 токсина при ГЖХ с использованием ДЭЗ - до 1-2 нг во вколе, общий предел обнаружения метода - до 50 мкг/кг (0,05 мг/кг), относительное стандартное отклонение - 0,2-0,25.

Продолжительность анализа - 4 часа.

Метод включает следующие этапы:

- экстракцию Т-2 токсина из образца смесью ацетонитрил-4% водный раствор хлористого калия (9:1);

- очистку экстракта о помощью жидкость-жидкостной экстракции гексаном и бензолом и препаративной ТСХ;

- разделение, идентификацию и количественное определение Т-2 токсина в виде ТФА производного с помощью ГЖХ с использованием ДЭЗ.

Оборудование и материалы

1. Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6с по ТУ 64-1-2451-78.

2. Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76 (завод "Химлабприбор").

3. Кофемолка ЭКМ-ЗУ.

4. Хроматограф газовый серии "Цвет-100" с детектором постоянной скорости рекомбинации (Д3З); колонка стеклянная 1 м x 0,4 см с жидкой фазой OV-1 или OV-101 на Хроматоне N-супер ("Лахема", ЧССР); в качестве самописца - регистрирующий потенциометр КСП-4 модификации 41.130.90.909 или 41.140.90.910 с диапазоном измерений 1 мВ; газ-носитель и продувочный газ - азот особой чистоты.

5. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа ОЛД-41.

6. Магнитная мешалка любого типа.

7. Микрошприц МШ-10 на 10 мкл, микрошприц МШ-1 или "Газохром-101" на 1 мкл.

8. Камеры для ТСХ с притертыми крышками (например, стеклянные четырехугольные сосуды 195x195x200 завода "Дружная горка").

9. Пластины для ТСХ "Силуфол" размером 20x20 см (ЧССР).

10. Воронки делительные ВД-2-250 по ГОСТ 8613-75.

11. Колбы плоскодонные конические на 250 мл с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32 по ГОСТ 10394-72.

12. Колбы круглодонные на 250 мл с НШ 29, тип ККШ-250-29/32 по ГОСТ 10394-72.

13. Колбы грушевидные на 50 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-72.

14. Колбы мерные на 100 мл, тип 2-100-2 по ГОСТ 1770-74.

15. Цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой, тип 2-100 по ГОСТ 1770-74.

16. Распылитель стеклянный с грушей.

17. Т-2 токсин кристаллический, номер по каталогу Т 4887, фирма "Сигма", США (по поводу получения стандарта Т-2 токсина обращаться в Институт питания АМН СССР).

18. Ацетонитрил "ч" по ТУ 6-09-3534-74.

19. Ацетон "чда" по ГОСТ 2603-79.

20. Бензол "чда" по ГОСТ 5955-75.

21. Гексан "ч" по ТУ 6-09-3375-78.

22. Метанол "чда" по ГОСТ 6995-77.

23. Изопропиловый спирт (пропанол-2) "хч" по ТУ 6-09-402-75.

24. Кислота серная "чда" по ГОСТ 4204-77.

25. Калий хлористый "чда" по ГОСТ 4234-77.

26. Натрий сернокислый безводный "чда" по ГОСТ 4166-76.

27. Натрий углекислый "чда" по ГОСТ 83-79, свежепрокаленный.

28. Трифторуксусный ангидрид "ч" по ТУ 6-09-4135-75.

1. Экстракция

При отборе пробы для анализа следует руководствоваться требованиями ГОСТа 12430-66 "Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе". Отобранную пробу измельчают в течение 1-2 минут в кофемолке или лабораторной мельнице. Навеску 20 г измельченного продукта помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 мл, добавляют 10 мл 4% раствора хлористого калия и 90 мл ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр, отбирают 70 мл фильтрата (аликвота соответствует 14 г исходного образца).

2. Очистка экстракта

2.1. Жидкость - жидкостная экстракция

В делительную воронку на 250 или 500 мл переносят 70 мл фильтрата, добавляют 50 мл гексана (или гептана). После встряхивания и разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Нижний ацетонитрильный слой еще дважды встряхивают с 40 мл гексана, каждый раз отбирая верхний гексановый слой. Ацетонитрильный слой разбавляют 17 мл дистиллированной воды и экстрагируют 50 и 25 мл бензола. Верхние бензольные слои отделяют и сушат безводным сернокислым натрием (10-15 г) в течение 0,5 часа. Раствор фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в круглодонную колбу на 250 мл в НШ 29. Сернокислый натрий промывают 10 мл бензола и отфильтровывают бензол в ту же круглодонную колбу. Упаривают бензольный раствор на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 45-50°C досуха. Остаток растворяют в 200-300 мкл бензола и очищают с помощью препаративной ТСХ (раствор A).

2.2. Очистка с помощью препаративной ТСХ

Пластинку "Силуфол" (20x20 см) размечают в соответствии с рис. 1. В правом и левом нижних углах пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят по 5 мкл стандартного раствора Т-2 токсина в бензоле (по 500 нг Т-2 токсина). Параллельно нижнему краю пластинки на расстоянии 1,5 см от нижнего края равномерно наносят с помощью шприца на 10 мкл раствор A в виде прямой линии шириной не более 3 мм. После нанесения всего раствора A в круглодонную колбу добавляют еще 100-150 мкл бензола и наносят бензольную промывку на ту же прямую линию. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан - изопропиловый спирт (7:2). Развивают пластинку до достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 1,5 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают из камеры и высушивают. Разрезают пластинку по линиям А и Б. Узкие полоски пластинки с нанесенным раствором Т-2 токсина опрыскивают 20% раствором серной кислоты в метаноле. Пластинки выдерживают в сушильном шкафу при 105°C в течение 1-3 минут и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Пятна Т-2 токсина (бело-голубая флуоресценция, 0,6-0,7) обводят тонкой карандашной линией. Затем узкие полоски прикладывают к пластинке с нанесенным экстрактом и отмечают на этой пластинке зону, соответствующую хроматографической подвижности стандарта Т-2 токсина. Ширина зоны должна быть примерно на 7 мм (с каждой стороны) больше протяженности пятна стандарта Т-2 токсина в направлении развития хроматограммы; зону отмечают в виде 2 карандашных линий, параллельных нижнему краю пластинки. Силикагель из отмеченной зоны соскабливают с помощью скальпеля или шпателя в пробирку на 5 мл, приливают 4 мл смеси бензол - ацетон (1:1) и встряхивают. Суспензию силикагеля фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в грушевидную колбу на 50 мл с НШ 14,5. Силикагель повторно (2x4 мл) промывают смесью бензол - ацетон (1:1). Объединенные бензол - ацетоновые экстракты упаривают досуха на ротационном испарителе. Остаток переносят 200 мкл бензола в пробирку на 5 мл с НШ 14,5 (раствор B).

3. Обнаружение, идентификация и определение содержания Т-2 токсина

3.1. Приготовление стандартного раствора Т-2 токсина

Навеску 10 мг кристаллического Т-2 токсина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки бензолом. Концентрация Т-2 токсина в стандартном растворе составляет 100 нг/мкл или 100 мкг/мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре не выше +5°C. Срок годности стандартного раствора - до 2 лет.

3.2. Получение ТФА производных

а) получение ТФА производного стандарта Т-2 токсина

В мерную пробирку на 5 мл в НШ 14,5 добавляют 50 мкл стандартного раствора Т-2 токсина в бензоле, добавляют 250 мкл бензола, 30-50 мг свежепрокаленного углекислого натрия и 50 мкл трифторуксусного ангидрида. Пробирку плотно закрывают стеклянной притертой пробкой и перемешивают при 20-25°C в течение 0,5 часа на магнитной мешалке (в пробирку предварительно помещают "гвоздик" для перемешивания - кусочек металлической канцелярской скрепки длиной 3-4 мм, запаянный в стеклянный капилляр). Содержимое пробирки разбавляют бензолом до 1 мл и фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в другую пробирку на 5 мл с НШ 14,5, углекислый натрий на фильтре промывают 0,5 мл бензола. Объединенные бензольные фильтраты упаривают досуха в слабой струе азота (при отсутствии баллона с азотом можно упарить досуха на ротационном испарителе). Остаток растворяют в 200 мкл бензола и анализируют с помощью ГЖХ.

б) получение ТФА производных экстракта

К 300 мкл бензольного раствора очищенного экстракта (раствор Б) добавляют углекислый натрий и трифторуксусный ангидрид и проводят получение ТФА производных аналогично п. 3.2.а.

3.3. ГЖХ анализ ТФА производных

Условия ГЖХ анализа: температура колонки - 200°, температура испарителя - 235°, температура термостата детектора - 270°, скорость газа-носителя - 90-100 мл/мин., скорость продувочного газа - 190-200 мл/мин., шкала чувствительности - А (на блоке ИМТ).

В газовый хроматограф с помощью микрошприца на 1 мкл последовательно вносят 0,2 и 0,5 мкл (соответствуют 5 и 12,5 нг Т-2 токсина) раствора ТФА-производного стандарта Т-2 токсина в 200 мкл бензола (п. 3.2.а). В каждом случае регистрируют время удерживания (в данных условиях порядка 5-6 минут) и определяют площадь пика ТФА производного Т-2 токсина . Площадь пика определяют умножением высоты пика на ширину пика на половине его высоты. Затем в газовый хроматограф вносят 0,5-1,0 мкл раствора ТФА производного экстракта (п. 3.2.б). При наличии пика, соответствующего по времени удерживания ТФА производному Т-2 токсина, определяют площадь .

Содержание Т-2 токсина в исходном образце определяют по формуле:

(мкг/кг), где

- площадь пика ТФА производного Т-2 токсина в экстракте, в ;

- площадь пика ТФА производного стандарта Т-2 токсина, в ;

- масса стандарта Т-2 токсина, внесенная в хроматограф, в нг (5 или 12,5 нг);

M - масса исходного образца, в г (20 г);

- объем экстрагирующего растворителя, в мл (100 мл);

- объем фильтрата, взятый для анализа, в мл (70 мл);

- объем бензольного раствора ТФА производного экстракта, в мкл (200 мкл);

- объем бензольного раствора ТФА производного экстракта, внесенный в хроматограф, в мкл.

Заполненная карта направляется по адресу:
109240, Москва, Устьинский проезд, 2/14
Институт питания АМН СССР, научно-организационный отдел.

_____________________

(полное наименование

_____________________

организации, где

_____________________

заполняется карта)

                          КАРТА ОБРАТНОЙ СВЯЗИ

  К  "Методическим указаниям по обнаружению, идентификаии и определению

  содержания Т-2 токсина в пищевых продуктах и продовольственном сырье"

1. Принято в внедрению в практику санэпидслужб (где и когда) ____________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

2. Полученный положительный эффект  (проведены анализы  на содержание Т-2

токсина, получены конкретные данные) ____________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

3. Материалы  не могут быть использованы  по следующим причинам  (указать

причины) ________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

4. Ваши замечания и пожелания ___________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

                                          Подпись

                                          Должность

Заместитель Главного государственного санитарного врача СССР

Ковшило В.Е.