Инструкция по микробиологическому контролю производства мороженого (утв. Минторгом СССР и Минмясомолпромом СССР 30 сентября, 14 декабря 1976 г.)

Инструкция по микробиологическому контролю производства мороженого
(утв. Минторгом СССР и Минмясомолпромом СССР 30 сентября, 14 декабря 1976 г.)

Основной задачей микробиологического контроля является обеспечение высокого качества продукции, выпускаемой предприятиями.

По результатам микробиологического контроля судят о санитарно-гигиеническом благополучии предприятия или имеющихся в этом отношении недостатках как в части условий производства (эффективность пастеризации смеси, качество мойки и дезинфекции оборудования и инвентаря и т.д.), так и в части качества готовой продукции.

Микробиологический контроль производства мороженого заключается в проверке качества поступающего сырья, материалов, припасов и готовой продукции, в выявлении возможных источников бактериального обсеменения мороженого по ходу технологического процесса, а также в проверке санитарно-гигиенических условий производства.

1. Подготовка к исследованию

1.1. Подготовка посуды и материалов

1.1.1. Вся новая посуда, предназначенная для микробиологических работ, кипятится в подкисленной воде (1-2% раствор соляной кислоты) в течение 15 минут.

Вымытую посуду стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при 160°С в течение 2 часов или паром в автоклаве при температуре 121°С в течение 20-30 минут с последующим высушиванием.

121°С = 1 ати, 116°С = 0,7 ати, 112°С = 0,5 ати.

Чашки Петри, пипетки и т.п. стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В верхнюю часть пипетки, которая берется в рот, предварительно вкладывают кусочки ваты. Колбы или пробирки закрывают ватными пробками и стерилизуют. Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.

Примечание. В случае определения редуктазной пробы разрешается пользоваться посудой, которую непосредственно перед испытанием кипятят в дистиллированной воде в течение 30 минут.

1.1.2. Посуда с питательными средами после подсчета на них кишечной палочки, дрожжей, плесеней обеззараживается перед мойкой путем стерилизации в автоклаве при 121°С в течение одного часа.

1.1.3. Изготовленные марлевые или ватные тампоны стерилизуют в отдельности завернутыми в бумагу или закрепляют на проволоке или деревянных палочках, пропущенных через ватную пробку, и вместе с пробкой вставляют в пробирки, тампоны не должны касаться раствора. Стерилизуют пробирки вместе с тампонами и 5 мл физиологического раствора при 121°С в течение 20 минут.

1.2. Питательные среды и реактивы

1.2.1. Физиологический раствор.

К 1 л водопроводной воды добавляют 8,5 г хлористого натрия, разливают раствор в чистые пробирки диаметром 18-20 мм по 10 мл, а в колбы - по 93 мл и стерилизуют при 121°С в течение 20 минут. После стерилизации в пробирках остается обычно по 9 мл физиологического раствора, а в колбах - по 90 мл, т.е. такое количество, которое необходимо при приготовлении разведений из посевного материала.

1.2.2. Стерильная вода.

Водопроводную или другую питьевую воду наливают в чистые пробирки или колбы и стерилизуют при 121°С в течение 20 минут.

1.2.3. Мясопептонный бульон.

Говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю, смешивают с двойным количеством водопроводной воды и выдерживают 12-24 часа при температуре 4-6°С. Для ускорения процессов экстракции питательных веществ содержимое кастрюли подогревают при 50°С в течение 1 часа и затем кипятят 30 минут. После кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный или ватно-марлевый фильтр. Фильтрат измеряют и добавляют к нему водопроводную воду до первоначального объема, 1% пептона и 0,5% поваренной соли.

Бульон обычно имеет кислую реакцию, поэтому его подщелачивают насыщенным раствором соды или 10%-ным раствором NaOH до pH 7,2-7,4. Чтобы бульон был прозрачным, к нему добавляют яичный белок (из расчета - белок одного яйца на 1 л), который предварительно взбивают с двойным количеством воды. Смесь нагревают в текучем пару 30 мин, белок при этом свертывается и увлекает с собой из жидкости взвешенную муть. Горячий бульон фильтруют через влажный двойной бумажный фильтр. Получается вполне прозрачная жидкость, которую разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют при 121°С в течение 20 минут.

1.2.4. Мясопептонный агар.

Для приготовления плотной среды к мясопептонному бульону прибавляют 1,5% агара, предварительно измельченного, замоченного и хорошо промытого водой, и нагревают его в автоклаве до 121°С (без выдержки). Среду в горячем состоянии фильтруют через вату, разливают в пробирки (по 10-12 мл) или колбы и стерилизуют при 121°С в течение 10 минут. Мясопептонный агар может быть заменен сухим питательным агаром, среду из которого готовят по прописи, прилагаемой к каждой порции сухой среды. При получении каждой новой партии сухого питательного агара качество приготовленной из него среды должно контролироваться. Результаты, получаемые при посеве продукции на среду, приготовленную из сухого питательного агара, должны быть близкими к результатам, получаемым при посеве того же образца продукции на мясопептонный агар.

В случае несовпадения результатов к сухому питательному агару добавляют 1/4-1/3 часть мясопептонного бульона для приближения состава среды к мясопептонному агару.

1.2.5. Сусловый агар.

Сусло для приготовления питательной среды должно содержать 6-8% сахара. В случае излишнего содержания сахара в сусле его разбавляют водой до указанной нормы.

Содержание сахара в сусле определяют специальным ареометром с делениями от 1000 до 2000, считая каждые 5 делений равным 1% сахара. Сусло должно иметь pH 4,5.

Сусло стерилизуют при 121°С в течение 10 минут. К суслу прибавляют 2% или 3% агара и плавят при 120°С без выдержки, затем фильтруют через вату, разливают по колбам или пробиркам и стерилизуют при 121°С в течение 10 мин.

Примечание. Сусловый агар может быть заменен средой Сабуро (см. 1.2.6) или картофельно-глюкозным агаром (см. 1.2.7).

Если при длительном хранении сусловый агар подсыхает, то перед употреблением в него следует добавить воды до первоначального объема и вновь простерилизовать.

1.2.6. Среда Сабуро.

К 1 л дистиллированной воды добавляют 18 г агара и оставляют на 30 минут для его набухания; добавляют 40 г глюкозы или мальтозы и 10 г пептона, нагревают до 120°С без выдержки; агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, среду разливают, стерилизуют при 115°С в течение 15 минут.

1.2.7. Картофельно-глюкозный агар.

Очищенный и нарезанный ломтиками картофель весом 200 г заливают 1 л дистиллированной воды и кипятят в течение часа. Отвар фильтруют, к фильтрату добавляют воду до первоначального объема, 2% глюкозы и 3% агара.

Среду разливают по пробиркам (по 10-12 мл) или в колбы и стерилизуют при 121°С в течение 10 минут.

При употреблении устанавливают pH 3,5 при помощи 10%-ного стерильного раствора безводной лимонной кислоты при 45°С.

Примечание. Для повышения элективности питательных сред, применяемых для учета дрожжей и плесеней, следует добавлять на 1 л среды 50000 ИЕ пенициллина и 40 мг стрептомицина или 350 мг неомицина. Растворы антибиотиков готовят на стерильной дистиллированной воде и добавляют в расплавленный и охлажденный агар непосредственно перед заливкой его в чашки Петри.

1.2.8. Среда Кесслер (модифицированная).

К 1 л водопроводной воды прибавляют 50 мл бычьей желчи (или желчи других сельскохозяйственных животных) и 10 г пептона; смесь кипятят 20-30 минут в водяной бане при помешивании, фильтруют через вату и затем прибавляют 2,5 г глюкозы. Доводят объем смеси водопроводной водой до 1 л; устанавливают реакцию среды (pH 7,4-7,6) и добавляют 2 мл 1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового. Среду разливают в пробирки с поплавками (5 мл) или в колбы (50 мл) и стерилизуют при 121°С в течение 10 минут. Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.

Примечание. Может быть использована сухая среда Кесслер, которую готовят по прилагаемой к ней прописи: 1,6 г порошка всыпать в 100 мл холодной водопроводной воды, тщательно размешать, кипятить при помешивании 20-30 мин в водяной бане и фильтровать через вату. Разлить в пробирки с поплавками и стерилизовать при 121°С в течение 10 мин.

1.2.9. Твердая среда Кесслер.

К жидкой среде Кесслер добавляют 0,8% агара и плавят. Затем среду разливают по 7-8 мл в пробирки и стерилизуют при 121°С в течение 10 мин.

1.2.10. Среда Эндо.

а) К 100 мл расплавленного мясопептонного агара (pH 7,6-7,8), соблюдая стерильность, добавляют 1 г "Ч" лактозы, растворенной в 5 мл стерильной воды и подогретой на водяной бане при 100°С в течение 5 минут.

б) В отдельную пробирку наливают 0,5 мл отфильтрованного 10%-ного спиртового раствора основного фуксина, к которому добавляют свежеприготовленный 10%-ного водный раствор сернокислого натрия до получения бледно-розового окрашивания.

К расплавленному лактозному агару добавляют, избегая вспенивания, раствор "б" и разливают в чашки Петри. Среда Эндо должна быть свежеприготовленной. Рекомендуется пользоваться также сухой готовой средой Эндо.

1.2.11. Среда Козера (модифицированная).

К 1 л дистиллированной воды добавляют 1,5 г фосфорнокислого натрий-аммония, 1,0 г фосфорнокислого однозамещенного калия, 0,2 г сернокислого магния, 2,5-3,0 г натрия лимоннокислого. Раствор стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 15 минут (pH среды 6,8-6,9), добавляют к нему 10 мл 0,5%-ного спиртового раствора бромтимолового синего и разливают в стерильные пробирки. Цвет среды после добавления индикатора - изумрудно-зеленый.

1.2.12. Реактивы для окраски по Граму.

Реактив 1. К 100 мл этилового спирта добавляют 0,5 г кристаллического фиолетового.

Реактив 2. К 96 мл 0,5%-ного спиртового раствора йодистого калия добавляют 2 мл 5%-ного спиртового раствора основного фуксина и 2 мл 5%-ного спиртового раствора йода.

Примечание. Растворение йодистого калия в спирте рекомендуется проводить в водяной бане при температуре 45-50°С при постоянном помешивании.

1.2.13. Раствор метиленового голубого.

Для приготовления насыщенного спиртового раствора смешивают 10 г метиленового голубого со 100 мл 96%-ного этилового спирта. Смесь ставят в термостат при температуре 37° на 24 часа, а затем фильтруют. Рабочий раствор метиленового голубого для редуктазной пробы готовят следующим образом: к 5 мл насыщенного спиртового раствора прибавляют 195 мл дистиллированной воды, смесь перемешивают.

Раствор метиленового голубого для окрашивания препарата: к 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового голубого прибавляют 100 мл 0,01% водного раствора КОН. Рабочий раствор метиленового голубого сохраняют в склянках из темного стекла до 7 суток, насыщенный раствор - до 3 месяцев. Можно использовать готовый раствор фиксанала.

1.2.14. Раствор резазурина.

100 мг резазурина растворяют в 200 мл прокипяченной и охлажденной дистиллированной воды. Этот раствор является основным и его используют для приготовления рабочего раствора. Срок хранения основного раствора резазурина не более 30 суток при температуре 8-10°С. Основной раствор используется для определения бактериальной обсемененности сырых сливок.

Рабочий раствор резазурина приготовляют из основного раствора разбавлением последнего прокипяченной и охлажденной дистиллированной водой в соотношении 1:2,5 (например, к 10 мл основного раствора прибавляют 25 мл воды).

Рабочий раствор содержит 0,014% резазурина. Срок хранения рабочего раствора резазурина не более 7 суток при температуре не выше 8-10°С.

Резазурин, его основной и рабочий растворы хранят в банках, защищенных от света, или из темного стекла.

1.3. Подготовка помещений для микробиологических исследований

Посевы производят в боксе (в помещении для проведения микробиологических исследований).

При отсутствии специального бокса допускается проведение анализов в лабораторной комнате, в которой во время анализа должны быть закрыты форточки и дверь во избежание движения воздуха.

Дезинфекцию помещений проводят протиранием всех поверхностей хлорными или дезинфицирующими препаратами по соответствующей для каждого препарата инструкции. За 2-3 часа до начала работы включают бактерицидные лампы (пребывание людей в помещении с включенными бактерицидными лампами запрещается).

1.4. Отбор проб, подготовка их к анализу и приготовление разведений

Отбор проб молока и молочных продуктов для микробиологических исследований проводится в соответствии с ГОСТ 9225 и ГОСТ 3226-68 с регистрацией номера исследуемой партии в лабораторном журнале.

При отборе проб для микробиологических исследований на предприятиях работниками СЭС необходимо, чтобы микробиолог завода (хладокомбината) одновременно отбирал те же пробы и исследовал их.

1.4.1. Пробы для микробиологического анализа продуктов и материалов отбирают до отбора проб для физико-химических исследований.

Посуду с образцом закрывают стерильной ватной или притертой стеклянной пробкой и снабжают этикеткой, в которой указывают номер образца и партии, наименование продукта, дату отбора пробы и т.д.

Исследование образцов должно проводиться немедленно. В случае необходимости образцы сохраняют до начала исследования не более 4 часов при температуре не выше +6°.

1.4.2. Мороженое.

От нерасфасованного мороженого стерильной ложечкой или щупом отбирают образец массой 50 г.

От расфасованных продуктов отбирают 1-2 образца в упаковке.

Образцы развертывают, помещают в стерильную посуду с притертой или ватной пробкой.

В случае необходимости образцы сохраняют до начала исследования не более 4 часов при температуре не выше -2°С.

Перед исследованием посуду, в которой находится образец, нагревают в водяной бане при 40-45°С в течение 10-15 мин. Проба мороженого отбирается после его полного расплавления и удаления воздушных пузырьков. Из подготовленной пробы мороженого готовят необходимые разведения в стерильном физиологическом растворе или стерильной водопроводной воде с температурой 40-45°С. Для этого 1 мл расплавленного мороженого вносят в 9 мл физиологического раствора. Таким образом получают разведение продукта в 10 раз. Для получения разведения продукта в 100 раз новой пипеткой берут из разведения в 10 раз 1 мл и вносят в 9 мл стерильного физиологического раствора. Последующие разведения готовят таким же образом, каждый раз применяя новую пипетку.

1.4.3. Молоко и сливки.

При отборе проб молока для определения редуктазы руководствуются основными понятиями и общими правилами отбора проб по ГОСТ 13928-68 "Молоко и сливки изготовляемые. Отбор и подготовка их к анализу". Отбор проб для определения редуктазы производят после отбраковки молока, не подлежащего приемке по кислотности, согласно ГОСТ 13264-70 "Молоко коровье. Требования при заготовках".

Отбор проб молока и сливок в количестве около 50 мл производят после тщательного перемешивания стерильным пробоотборником или черпаком в стерильную посуду с пробкой.

Мутовку, черпак или пробоотборник обрабатывают путем хлорирования (200 мг активного хлора на 1 л воды).

Взятый образец должен тотчас же подвергаться исследованию. Если молоко и сливки исследуют не сразу, их хранят при температуре не выше +6°С, не более 4 часов с момента отбора пробы. Разведения для посева проводят согласно п. 1.4.1.

1.4.4. Масло.

Пробу отбирают стерильным щупом на расстоянии 3-5 см от края образца, направляя щуп к противоположной стороне и опуская примерно на 3/4 его длины. Из щупа отбирают стерильным шпателем около 20 г масла и помещают пробу в стерильную посуду.

При отборе проб масла из мелкой расфасовки берут навеску около 20 г (включая поверхностный слой). Образец помещают в посуду, расплавляя в водяной бане, нагретой до 40-45°С. Из расплавленного масла после тщательного перемешивания готовят необходимые для посева разведения согласно п. 1.4.1.

1.4.5. Сгущенное молоко или сливки с сахаром, какао или кофе со сгущенным молоком и сахаром.

От однородной партии продукта, расфасованного в банки, бочки, фляги, отбирают образец весом 50 г. Банки с продуктом перед анализом тщательно моют и вытирают. Перед вскрытием крышку банки, пробку бочки и часть днища вокруг пробки фломбируют. Содержимое банки перемешивают и делают навеску 10 г продукта в колбу с 90 мл стерильного физиологического раствора, подогретого до 45°С. Смесь тщательно перемешивают до полного растворения, получают разведение в 10 раз. Отсюда делают последующие разведения.

1.4.6. Сухое молоко, сухие сливки с сахаром и др. сухие молочные продукты.

Из мешка или бочки стерильной ложкой отбирают из разных мест пробу продукта в количестве 50 г и помещают в стерильную сухую тару. Если продукция расфасована в банки или коробки, то от каждой партии отбирают два образца в оригинальной упаковке. Затем отвешивают 10 г продукта на профламбированном часовом стекле или на стерильном куске пергамента. Навеску высыпают в колбу с 90 мл стерильного физиологического раствора, подогретого до 45°С, тщательно взбалтывают до полного растворения. Таким образом получают разведение продукта в 10 раз, откуда делают последующие разведения.

1.4.7. Сахар, сахарный сироп, стабилизаторы.

Проба отбирается в сухую стерильную посуду из разных мест одной партии. Для анализа навеску 10 г помещают в 90 мл стерильного физиологического раствора. Из этого разведения делают посев 1 мл и последующие разведения.

1.4.8. Фрукты, ягоды, орехи и др.

Проба отбирается в стерильную сухую посуду. Для анализа навеску 10 г помещают в 90 мл стерильной воды или физиологического раствора и встряхивают. Из этого разведения делают посев 1 мл на соответствующие среды и последующие разведения.

1.4.9. Глазурь, крем, пралине и другие полуфабрикаты.

Проба для анализа отбирается в количестве около 20 г в стерильную посуду и расплавляется на водяной бане при 40-45°С. Из расплавленного продукта после тщательного перемешивания отбирают 1 мл и помещают в 9 мл физиологического раствора, подогретого до 40-45°С. Отсюда делают последующие разведения согласно п. 1.4.1.

2. Методы исследования

Контроль сырья и готовой продукции (определения общего количества бактерий, определение бактерий группы кишечной палочки, просмотр микроскопических препаратов) проводится по ГОСТ 9225-68. Негостированные методы используются для внутриведомственного контроля.

2.1. Определение общего количества бактерий

2.1.1. Общее количество бактерий в исследуемом материале определяется в 1 мл или 1 г продукта, или в 1 мл смыва при посеве на чашки Петри. Перед посевом делают надписи на крышке чашки с указанием объекта исследования, разведения и даты анализа.

Из каждого разведения 1 мл (в соответствии с табл. 1) вносится в чашку Петри и заливается расплавленным и остуженным до 45°С мясопептонным агаром.

Таблица 1

Наименование продукта	Общее количество бактерий	Бактерии группы кишечной палочки
	засеваемые разведения	засеваемые объемы, мл	кол-во пробирок, засеваемых из каждого объема
Молоко и сливки сырые	от 1:10000 до 1:1000000	от 0,1 до 0,00001	1
Молоко и сливки пастеризованные	от 1:10 до 1:1000	1; 0,1	3
Масло	от 1:100 до 1:10000	от 1 до 0,01	1
Мороженое	от 1:100 до 1:10000	0,1	3
Молоко сгущенное с сахаром, какао и кофе со сгущенным молоком	от 1:10 до 1:1000	0,1	3
Молоко сухое, сухие сливки с сахаром и без сахара и другие сухие молочные продукты	от 1:100 до 1:1000	0,1	1

Сразу после заливки агаром содержимое чашки следует тщательно перемешать путем легкого вращательного движения для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри перевертывают крышками вниз и ставят для выращивания в термостат при температуре 37°С на 48 часов.

2.1.2. Подсчитывают количество выросших в каждой чашке колоний. При этом для подсчета берут те чашки, количество колоний в которых не более 300.

В отдельных случаях при большом числе колоний, дно чашки Петри делят на 4 и более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний в 2-4 секторах, находят среднее арифметическое число колоний для них, которое умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.

Число колоний, выросших на каждой чашке, пересчитывают на 1 г или 1 мл продукта с учетом разведения. Окончательным результатом будет среднее арифметическое от результатов подсчета колоний в отдельных чашках.

2.2. Проба на редуктазу с применением метиленового голубого (органический краситель)

2.2.1. В процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду, наряду с другими окислительно-восстановительными ферментами, анаэробные дегидразы (редуктазы). Существует некоторое соответствие между общим количеством бактерий в молоке и содержанием в нем редуктаз, что дает возможность использовать редуктазную пробу как косвенный показатель бактериальной обсемененности сырого молока.

2.2.2. В пробирки (180х20 мм) наливают по 1 мл рабочего раствора метиленового голубого и по 20 мл исследуемого молока, нагретого до 38-40°С, закрывают резиновыми пробками, смешивают путем медленного 3-кратного переворачивания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник, водяную баню или термостат при температуре 38-40°С (уровень воды в бане должен быть выше уровня в пробирке). Момент погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа. Наблюдение за изменением окраски ведут через 20 минут, 2 часа и 5 час. 30 мин.

Окончанием анализа считается момент обесцвечивания окраски молока, при этом остающийся небольшой кольцеобразный окрашенный слой вверху (около 1 см) или небольшое окрашивание части внизу пробирки в расчет не принимаются. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают.

2.2.3. По времени обесцвечивания содержимого пробирки определяют бактериальную обсемененность и класс молока в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2

Класс	Оценка качества молока	Продолжительность обесцвечивания	Количество бактерий в 1 мл молока
I	Хорошее	свыше 5 ч 30 мин	менее 500 тыс.
II	Удовлетворительное	свыше 2 до 5 ч 30 мин	от 500 тыс. до 4 млн
III	Плохое	свыше 20 мин до 2 ч	от 4 млн до 20 млн
IV	Очень плохое	20 мин и менее	более 20 млн и выше

2.3. Проба на редуктазу с применением резазурина

В этой пробе для определения содержания в молоке (сливках) редуктаз используют свойство резазурина быстро изменять свою окраску при восстановлении. Оценку качества молока при пробе с резазурином получают в течение одного часа, а молоко с особо высокой бактериальной обсемененностью может быть выявлено через 20 минут.

В пробирки наливают 1 мл рабочего раствора резазурина и 10 мл исследуемого молока, закрывают резиновыми пробками, смешивают путем медленного трехкратного перевертывания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник или водяную баню. Вода должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Температура воды в редуктазнике после погружения пробирок с молоком должна поддерживаться в течение всего времени в пределах 38-40°С. Пробирки с молоком и резазурином на протяжении анализа должны быть защищены от прямых солнечных лучей.

Примечание. Анализ сливок проводят так же, как и анализ молока, но добавляют 1 мл основного раствора резазурина.

Время погружения пробирок в баню считают началом анализа. Показания снимают через 20 минут и через 1 час, не встряхивая и не переворачивая пробирки. Молоко, обесцвечивающееся через 20 минут, относят к IV классу, и оно дальнейшему исследованию не подлежит.

Пробирки с таким молоком удаляют из редуктазника. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают. Оставшиеся пробирки однократно переворачивают и оставляют в редуктазнике или водяной бане до конца анализа.

В зависимости от времени обесцвечивания и изменения окраски молоко (сливки) относят к одному из четырех классов в соответствии с таблицей 3.

Таблица 3

Класс	Оценка качества молока (сливок)	Продолжительность изменения цвета	Окраска молока (сливок)	Количество бактерий в 1 мл молока (сливок)
I	Хорошее	Через 1 ч	Сине-стальная	Менее 500 тыс.
II	Удовлетворительное	Через 1 ч	Сиреневая или сине-фиолетовая	От 500 тыс. до 4 млн
III	Плохое	Через 1 ч	Розовая или белая	От 4 млн до 20 млн
IV	Очень плохое	До 20 мин	Белая	От 20 млн и более

2.4. Определение бактерий группы кишечной палочки

2.4.1. Для характеристики санитарно-гигиенических условий производства и готовой продукции определяют степень обсеменения исследуемых объектов бактериями группы кишечной палочки, т.е. бродильный титр и коли-титр. Бродильный титр - это наименьшее количество продукта, выраженное в граммах или миллилитрах, в котором обнаружена хотя бы одна бактерия группы кишечной палочки, т.е. разлагающая глюкозу на кислоту и газ при 43°С в течение 24 часов (первая бродильная проба в среде Кесслер). Коли-титр - это наименьшее количество продукта, выраженное в граммах или миллилитрах, в котором обнаружена кишечная палочка (после идентификации).

2.4.2. Посев в среду Кесслер (первая бродильная проба) производят из разведений продуктов в объемах, указанных в таблице 1.

По 1 мл из указанных разведений продукта засевают в пробирки со средой Кесслер. Пробирки с посевом помещают в термостат при температуре 43°С на 18-24 часа. При исследовании мороженого пробирки с посевами выдерживают при 43°С в течение 48 часов. Затем пробирки с посевами просматривают и устанавливают бродильный титр.

Примечание. При внутризаводском микробиологическом контроле сырья, полуфабрикатов, готовой продукции допускается ограничивать исследование на наличие бактерий группы кишечной палочки определением только бродильного титра (по первой бродильной пробе). При отсутствии газообразования продукт считают не загрязненным кишечной палочкой.

2.4.3. При контроле продуктов, нормированных по содержанию кишечной палочки, из пробирок с посевами в среду Кесслер, в которых обнаружено газообразование, проводят выделение чистой культуры кишечной палочки и ее идентификацию.

2.4.4. Идентификацию кишечной палочки проводят следующим образом. Из пробирок с газообразованием производят высев на среду Эндо с таким расчетом, чтобы получить отдельные колонии, для чего берут петлей минимальное количество посевного материала и производят посев штрихом. Перед посевом дно чашки с подсушенной средой Эндо делят на 4 сектора. Посев из каждой пробирки с газообразованием со средой Кесслер производят на отдельный сектор. Чашки с посевами помещают (крышками вниз) в термостат с температурой 37°С на 18-24 ч.

Примечание. Если газообразование обнаружено в пробирках с большим разведением и отсутствует в пробирках с предыдущим разведением, то на среду Эндо высевают материал из всех пробирок с предыдущим разведением.

При отсутствии на среде Эндо колоний, типичных для бактерии группы кишечной палочки (красных, нередко с металлическим блеском, розовых, бледно-розовых), продукт считают не загрязненным кишечной палочкой. При наличии на среде Эндо колоний, типичных для бактерий группы кишечной палочки, а также бесцветных, проводят их изучение.

При систематическом обнаружении бесцветных колоний на чашках с агаром Эндо в условиях работы лабораторий, расположенных на территории предприятия, во избежание пропуска патогенных бактерий кишечной группы следует обращаться в лаборатории санитарно-эпидемиологических станций.

2.4.5. Из изолированных колоний, характерных для бактерий группы кишечной палочки, делают препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют.

Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей каплю дистиллированной воды, в которую вносят петлей небольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. При приготовлении препарата из жидкой культуры на стекло наносят каплю ее. Затем вносят также петлей каплю реактива 1 (см. п. 1.2.13). Смесь распределяют на участке примерно в 1 , подсушивают при комнатной температуре и фиксируют, медленно проводя один раз через пламя горелки.

На одном стекле можно готовить 6-8 мазков, отделяя их один от другого линиями, проведенными с лицевой стороны стекла. Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.

После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2 так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания 0,5-1 мин. После окрашивания препарат быстро ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат высушивают фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Граму (грамположительные), будут темно-фиолетового цвета, микробы, не красящиеся по Граму (грамотрицательные), будут красного цвета. Бактерии группы кишечной палочки - короткие грамотрицательные палочки.

2.4.6. Посев на среду Козера.

Из одной и той же колонии грамотрицательных палочек с каждого сектора среды Эндо производят высевы петлей на среду Козера. Пробирки с посевами на среде Козера помещают в термостат при температуре 37°С на 18-24 час.

2.4.7. Отсутствие роста на среде Козера указывает на наличие цитрат-отрицательных разновидностей бактерий группы кишечной палочки.

Изменение оливково-зеленого цвета среды Козера на васильковый свидетельствует о том, что обнаруженные бактерии кишечной палочки относятся к цитрат-положительным разновидностям, которые не учитывают. В результате идентификации учитывают все разновидности кишечной палочки, не окрашивающиеся по Граму и вызывающие брожение с образованием кислоты и газа в среде Кесслер при 43°С; не учитывают разновидности, дающие рост на цитратной среде Козера.

2.4.8. Вычисление коли-титра для мороженого (см. табл. 4).

Таблица 4

Вариант	Наличие кишечной палочки, мл			Вычисленный коли-титр, мл
	0,1	0,1	0,1
а	-	-	-	>0,3
б	+	-	-	0,3
в	+	+	-	<0,3
	+	+	+

а) Если кишечная палочка не обнаружена ни в одной из трех засеянных пробирок по 0,1 мл, считают коли-титр более 0,3 мл.

б) Если кишечная палочка обнаружена в одной из трех засеянных пробирок по 0,1 мл, считают коли-титр 0,3 мл.

в) Если кишечная палочка обнаружена в двух или трех засеянных пробирках по 0,1 мл, считают коли-титр менее 0,3 мл.

Если кишечная палочка обнаружена в нескольких засеянных объемах, то за коли-титр принимают количество продукта в наибольшем разведении, давшем рост кишечной палочки.

2.5. Определение бактерий кишечной палочки с помощью индикаторных бумажек, выпускаемых Рижским заводом "Реагент"

2.5.1. Молоко исследуют непосредственно (без разведения) и после предварительного разведения в физиологическом растворе или воде в соответствии с рекомендациями ГОСТа 9225-68 "Методы микробиологического исследования".

Мороженое и масло исследуют только после разведения, так как жир препятствует выявлению бактерий группы кишечной палочки на индикаторной бумажке.

Смывы с оборудования проверяют непосредственно (без разведения).

2.5.2. Индикаторные бумажки (в полиэтиленовых пакетах) хранят в бумажных пакетах из светонепроницаемой бумаги, а при работе предохраняют от действия солнечного света.

Индикаторные бумажки должны иметь белый или слегка кремовый цвет.

Розовый цвет бумажек указывает на их засвеченность. Такие бумажки для употребления не пригодны. Перед употреблением вынимают полиэтиленовый пакет с индикаторной бумажкой из бумажного пакета и с одной стороны разрезают его профламбированными ножницами.

Индикаторную бумажку вынимают из пакета за перфорированный конец и смачивают в исследуемом молоке (смыве с оборудования) или в разведении (молока или продуктов) путем однократного погружения, которое длится три секунды.

Излишек влаги удаляют путем прикосновения конца бумажки к стенке сосуда.

При такой обработке бумажка впитывает 0,5 мл жидкости. Затем индикаторную бумажку вновь помещают в полиэтиленовый пакет, перфорированный конец бумажки удаляют.

2.5.3. После вкладывания бумажки в пакет следует тщательно прогладить его, чтобы полиэтиленовая пленка с обеих сторон плотно прилегла к смоченной бумажке и весь воздух был удален из пакета.

Разрезанный конец пакета зажимают между двумя пластинками и запаивают на пламени горелки.

Индикаторную бумажку (в полиэтиленовом пакете) помещают в термостат при температуре 43°С на 12-18 часов.

Индикаторные бумажки в термостате должны находиться в строго горизонтальном положении, чтобы не имело стекание жидкости.

2.5.4. После выдержки производят подсчет красных пятен на обеих сторонах бумажки.

Примечание. Если невозможно провести учет бактерий группы кишечной палочки сразу по извлечении индикаторной бумажки из термостата, ее можно сохранять в холодильнике (4-6°С) до следующего дня.

Содержание бактерий группы кишечной палочки в молоке и смеси мороженого (в 1 мл или 1 грамме) определяют умножением количества подсчитанных пятен на соответствующее разведение и удваиванием полученного результата. При учете кишечной палочки в смыве с оборудования количество пятен умножают на количество мл смывной воды (4-5) и на 2 и получают ответ о содержании кишечной палочки на исследуемой поверхности оборудования.

2.5.5. Этот наиболее ускоренный метод выявления бактерий группы кишечной палочки можно использовать для повседневного санитарно-гигиенического контроля оборудования, а также контроля готовой продукции, не нормированной по содержанию бактерий группы кишечной палочки.

Соотношение между бродильным титром и количеством бактерий группы кишечной палочки, определяемое с помощью индикаторных бумажек, приводится ниже.

Бродильный титр (в среде Кесслер)	Количество бактерий группы кишечной палочки (по индикаторной бумажке)
3	менее 10
0,3	10
менее 0,3	более 10

2.6. Определение бактерий группы кишечной палочки на плотной среде Кесслер (при контроле не нормированных по кишечной палочке продуктов и смывов с оборудования)

2.6.1. В пробирку с расплавленной и охлажденной до 40-45°С плотной средой Кесслер вносят стерильной пипеткой 1 мл разведения продукта, а при взятии смыва - весь смывной раствор вместе с тампоном.

Затем путем встряхивания пробирки хорошо размешивают среду с внесенным посевным материалом, дают ей застыть, после чего пробирку помещают в термостат или водяную баню с температурой 43°С на 18-24 часа.

2.6.2. В случае наличия небольшого количества кишечной палочки в плотной среде Кесслер появляются трещины, при большом количестве кишечной палочки в среде образуются пузырьки газа и агар разрывается.

2.7. Определение количества плесеней и дрожжей

Анализ производят посевом выбранных разведений исследуемого материала в чашки Петри с сусловым агаром или средой Сабуро, или картофельно-глюкозным агаром. Чашки выдерживают при комнатной температуре (20-23°С) в течение 3-5 суток. Подсчитывают отдельно колонии дрожжей и плесеней.

2.8. Методы контроля санитарно-гигиенического состояния производства

2.8.1. Контроль качества мойки и дезинфекция аппаратуры и оборудования.

Контроль аппаратуры и оборудования осуществляется после мойки и дезинфекции (хлорирования или пропаривания) непосредственно перед началом работы.

Смывы берут стерильными увлажненными ватными и марлевыми тампонами или салфетками.

Стерильные ватные тампоны на стеклянных или металлических палочках, вставленных в пробирки с ватными пробками, заготавливают заранее. В день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливают по 5 мл стерильного физиологического раствора или воды. Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют наклонением пробирки или опусканием тампона вниз. При взятии смыва салфетками их захватывают стерильным пинцетом, увлажняют стерильной водой из пробирки и после протирания исследуемого объекта помещают в ту же пробирку.

Смывы с крупного оборудования отбирают при помощи металлического трафарета с ручкой, середина которого вырезана в форме квадрата площадью 100 (10х10). Трафарет обжигают и накладывают на исследуемую поверхность. После взятия пробы пробирку с тампоном вновь вставляют в пробирку так, чтобы тампон погрузился в физиологический раствор; пробирку встряхивают. Затем 1 мл физиологического раствора из пробирок высевают на мясопептонный агар для определения общего количества бактерий, а оставшееся количество вместе с тампоном засевают в 5 мл среды Кесслер для определения наличия бактерий группы кишечной палочки. Посевы выдерживают в термостате при 43°С в течение 18-24 часов для определения бактерий группы кишечной палочки и при 37°С в течение 48 часов для определения общего количества.

Бактерии группы кишечной палочки в смывах должны отсутствовать.

Для отбора проб из трубопровода диаметром 50 мм с поверхности 100 в него вводят стерильный, смоченный физиологическим раствором тампон вглубь на 6,5 см, а при диаметре 36 мм - на 9 см. После ввода тампона в трубопровод на требуемую глубину его продвигают к выходу, делая вращательные движения.

Особое внимание необходимо уделять соблюдению периодичности и контролю качества мойки танков, поскольку они могут явиться источником вторичного обсеменения пастеризованной смеси для мороженого. Мойка танка проводится после каждого опорожения его.

2.8.2. Цеховой инвентарь.

Для оценки качества мойки цехового инвентаря пробы отбирают в тот момент, когда инвентарь подготовлен к работе. Качество мойки оценивают по наличию брожения в жидкой среде Кесслер и общему количеству бактерий.

Пробы на анализ отбирают следующим образом:

а) мелкий инвентарь (мешалки, мутовки, ковши) - мазок берут ватным или марлевым тампоном со всей поверхности предмета;

б) столы, лотки, формы, гильзы и т.п. - мазок берут ватным или марлевым тампоном при помощи трафарета со 100 поверхности стенки и дна в отдельности. Общее количество бактерий и наличие бактерий группы кишечной палочки определяют в соответствии с п. 2.1.1, п. 2.4.2.

2.8.3. Руки работников.

Анализ чистоты рук производят (без предварительного предупреждения) перед началом производственного процесса и только у тех работников, которые непосредственно соприкасаются с чистым оборудованием или продукцией.

Для взятия смывов с рук рабочих пользуются также марлевым или ватным тампоном. Перед анализом пробирку наклоняют, тампон смачивают стерильным физиологическим раствором, вынимают вместе с ватной пробкой и тщательно обтирают им обе руки и пальцы каждого рабочего. Пробу с тампоном вновь вставляют в пробирку так, чтобы тампон погрузился в физиологический раствор. Затем всю смывную жидкость вместе с тампоном из пробирки высевают в 5 мл среды Кесслер. Посевы выдерживают при 43°С в течение 18-24 часов.

2.8.4. Контроль хлорирования рук.

Отдельные участки рук протирают ватным тампоном, смоченным йодкрахмальным раствором, который готовят, смешивая в равных соотношениях 6% раствора Kj и 4% раствора крахмала (4 г растворимого крахмала и 96 мл дистиллированной воды перемешивают, доводя до кипения, и охлаждают до 20°С).

Такую пробу производят в 2-3 местах руки. Если на тампоне и поверхности рук в местах соприкосновения с тампоном появляется сине-бурое окрашивание, это свидетельствует о наличии ионов хлора, т.е. руки были обработаны раствором хлорной извести. Следы окрашивания удаляют тампоном, смоченным 3%-ным раствором гипосульфита натрия.

2.8.5. Воздух.

При проведении анализа открытые чашки Петри с мясопептонным агаром (для определения общего количества бактерий); со средой Сабуро или сусловым агаром (для определения количества дрожжей и плесеней) размещают во время работы в производственных помещениях.

Чашки выдерживают 5 минут, затем закрывают и производят анализ по указанным методикам (п. 3.6).

2.8.6. Вода.

Отбор проб воды, хранение, транспортировка их и исследование воды производится по ГОСТ 18963-73.

2.8.7. Материалы производства.

Стаканчики бумажные и полистироловые, коробочки для тортов и фасовки мороженого, ламинированная бумага, кашированная фольга, лакированный целлофан, этикетки из пергамента, марля, лавсан, палочки для эскимо.

Для определения чистоты указанных материалов стерильным тампоном делают смыв со 100 (стаканчики - со всей внутренней поверхности) и помещают в 5 мл стерильной воды, а затем 1 мл смыва высевают в чашку Петри и заливают сусло-агаром для определения плесеней; остальной смыв вместе с тампоном засевают в пробирку с 5 мл жидкой среды Кесслер для определения наличия бактерий группы кишечной палочки. Оценка результатов производится по микробиологическим показателям в соответствии с Приложением 6.

3. Организация микробиологического контроля на предприятиях

3.1. Контроль сырья и технологического процесса

3.1.1. Сырое молоко и сливки, поступившие на предприятие, исследуют по редуктазной пробе; в пастеризованных сливках, кроме того, определяют наличие бактерий группы кишечной палочки. Редуктазная проба отбирается 1 раз в декаду в соответствии с ГОСТ 13928-68.

3.1.2. Для выявления и устранения источников обсеменения проводят микробиологический анализ на всех стадиях технологического процесса производства мороженого (табл. 5).

Таблица 5

Исследуемые объекты	Название анализа	Место отбора проб	Периодичность контроля
Сырье для мороженого
Молоко сырое	Редуктазная проба	Выборочно	2-3 раза в месяц
Сливки сырые	-"-	-"-	-"-
Молоко и сливки пастеризованные	Бродильный титр	-"-	-"-
Масло коровье: сладкосливочное, несоленое, высшего сорта, любительское сливочное	Общее количество бактерий, количество протеолитических бактерий, количество дрожжей и плесеней, бродильный титр	-"-	1-2 раза в месяц
Сахар, сахарный сироп, стабилизаторы	Наличие дрожжей и плесеней	Выборочно	1-2 раза в месяц
Плоды, ягоды, плодово-ягодные пюре, соки, сиропы	Общее количество бактерий, бродильный титр, дрожжи и плесени	-"-	-"-
Глазурь, крем, пралине и др. полуфабрикаты	Общее количество бактерий, бродильный титр	-"-	2 раза в месяц
Контроль производства
Смесь мороженого до пастеризации	Общее количество бактерий, бродильный титр	Из смесительной ванны	Не реже 1 раза в месяц
Смесь мороженого после пастеризации	Общее количество бактерий, бродильный титр, проверка термограмм	Из пастеризатора	Не реже 1 раза в месяц и в случае повышения бакобсемененности готового продукта - до наведения порядка
Смесь мороженого после охлаждения	Общее количество бактерий, бродильный титр	С охладителя	Не реже 1 раза в месяц
Смесь мороженого после хранения	Общее количество бактерий, бродильный титр	Из танка	-"-
Готовый продукт	Общее количество бактерий, коли-титр	После расфасовки	Ежедневно

Кроме того, ежедневно осуществляют проверку правильности термического режима пастеризации смеси по термограммам каждого пастеризационного аппарата и при наличии отклонений от принятого режима выясняют причины и сообщают об этом техническому руководству предприятия для принятия мер. (См. Инструкцию по обслуживанию и контролю средств автоматизации пластинчатых пастеризационно-охладительных установок на предприятиях молочной промышленности).

Общее количество бактерий в 1 мл смеси для мороженого, отобранной после секции охлаждения пастеризатора, не должно превышать 10 тыс./мл. Бактерии группы кишечной палочки должны отсутствовать в 10 мл смеси (при засеве в 50 мл среды Кесслер).

Микробиологические показатели для оценки мороженого и масла указаны в Приложениях 1 и 2.

3.2. Контроль санитарно-гигиенического состояния производства и рук работников

3.2.1. В большинстве случаев при ежедневном контроле качества мойки посуды и оборудования можно ограничиться одним анализом на присутствие бактерий группы кишечной палочки путем посева (не реже трех раз в месяц) на среду Кесслер. Оценка чистоты мойки будет считаться неудовлетворительной при появлении газа и удовлетворительной - при его отсутствии.

Если к чистоте оборудования предъявляются особые требования и при его контроле в среде Кесслер, как правило, не наблюдается брожения, качество мойки оценивают по общему количеству бактерий в смывах.

Санитарно-гигиенический контроль состояния производства должен быть организован таким образом, чтобы можно было оценить качество мойки и дезинфекции, проводимой каждым отдельным работником. Поэтому необходимо не реже трех раз в месяц контролировать чистоту мойки оборудования и оценивать работу каждого работника на этом участке.

Примерные бактериологические показатели для оценки санитарно-гигиенического состояния производства помещены в Приложении 3.

3.2.2. Чистоту рук работников контролируют не реже трех раз в месяц.

Оценка чистоты мойки рук будет считаться неудовлетворительной при появлении в пробирке газа и удовлетворительной - при его отсутствии. Работники здравпункта должны ежедневно осматривать руки рабочих на гнойничковые заболевания. Результаты осмотра заносятся в журнал.

С помощью йодкрахмальной пробы контролируют чистоту и дезинфекцию рук рабочих, которые непосредственно соприкасаются с продукцией.

3.3. Контроль воды и воздуха

3.3.1. Анализ воды на всех заводах проводится не реже одного раза в квартал при пользовании городским водопроводом и одного раза в месяц - при наличии собственного источника водоснабжения.

Согласно действующему ГОСТ 2874-73 в 1 мл питьевой воды не должно содержаться более 100 бактерий, а титр кишечной палочки должен быть не ниже 300.

3.3.2. В воздухе заводских помещений определяют общее количество бактерий, количество дрожжей и плесеней не реже 1 раза в месяц.

В воздухе закалочных камер и камер хранения мороженого определяют количество плесеней 1 раз в квартал.

Примерные микробиологические показатели оценки воздуха указаны в Приложениях 4 и 5.

3.4. Контроль качества материалов

Материалы, применяемые на производстве, подвергают микробиологическому контролю на общее количество микроорганизмов, бактерий группы кишечной палочки по бродильному титру не реже 2-4 раз в год или чаще, если при контроле технологических процессов и готовой продукции выявляется необходимость проверить, не являются ли материалы источником микробиологического обсеменения.

Исследование палочек для эскимо и упаковочных материалов проводят не реже 1 раза в 10 дней.

В необходимых случаях производят дополнительное микробиологическое обследование на специфическую для данного вида материалов микрофлору (например, дрожжи, плесени).

Примерные показатели для оценки результатов микробиологического контроля материалов даны в Приложении 6.

4. Лабораторная документация

Все данные микробиологического контроля производства записывают в журналы (Приложения 7, 8, 9).

Лабораторные журналы должны быть прошнурованы, страницы пронумерованы и скреплены печатью. Записи в журналах должны вестись четко, чернилами.

Журналы находятся на ответственном хранении у микробиолога в течение года, после чего сдаются в заводской архив.

Результаты микробиологических анализов лаборатория доводит до сведения администрации и рабочих с указанием мероприятий по повышению санитарно-гигиенического режима (Приложение 10).

Заместитель министра мясной и молочной промышленности СССР

Ю.С. Соколов

Заместитель министра торговли СССР

С.А. Трифонов

Согласовано

Заместитель Главного государственного санитарного врача СССР

А.И. Заиченко

3 сентября 1976 г.

Начальник Упрмолпрома Минмясомолпрома СССР

В.Н. Сергеев

9 декабря 1976 г.

Начальник Главпродторга Минторга СССР

С.Д. Алешин

29 сентября 1976 г.