Межгосударственный стандарт ГОСТ 31748-2012 (ISO 16050:2003) "Продукты пищевые. Определение афлатоксина В1 и общего содержания афлатоксинов В1, В2, G1 и G2 в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1760-ст)

Foodstuffs. Determination of aflatoxin B1 and the total content of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in cereals, nuts and derived products. High-performance liquid chromatographic method

Дата введения 1 июля 2013 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой, с очисткой на иммуноафинной колонке и послеколоночной дериватизацией, для определения афлатоксинов в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки.

Предел количественного определения афлатоксина и суммы афлатоксинов , , и - 8 мкг/кг.

Данный метод применим в отношении кукурузы с содержанием 24,5 мкг/кг, арахисового масла с содержанием 8,4 мкг/кг и сырых арахисовых орехов с содержанием 16 мкг/кг общей суммы афлатоксинов.

Метод допускается использовать для масличных культур, сушеных фруктов и продуктов их переработки.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ISO 5725-1-2003* Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ ISO 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ 4159-79 Реактивы. Йод. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия

ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 22524-77 Пикнометры стеклянные. Технические условия

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сущность метода

Анализируемый образец экстрагируют смесью метанола и воды. Экстракт образца фильтруют, разбавляют водой и вводят в колонку для аффинной хроматографии, содержащую антитела, специфичные для афлатоксинов , , и . Афлатоксины выделяют, очищают и концентрируют на колонке, после чего отделяют от антител при помощи метанола. Афлатоксины определяют количественно при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой с определением флуоресценции и послеколоночной дериватизацией.

4 Реактивы

При отсутствии специальных указаний используют реактивы только признанных аналитических марок квалификации х.ч. или ч.д.а.

4.1 Вода, не ниже 1-й степени, по [1].

Вода не должна содержать органические примеси.

4.2 Хлорид натрия по ГОСТ 4233.

4.3 Иод кристаллический по ГОСТ 4159.

4.4 Афлатоксин, кристаллический или в виде пленочной ампулы.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Афлатоксины канцерогенны для человека. Следует принимать во внимание заявление, сделанное Международными агентствами по исследованиям в области рака (ВОЗ) (см. [2], [3]).

Необходимо надлежащим образом предохранять лабораторию, в которой проводятся анализы, от дневного света. Для этого закрывают окна фольгой, поглощающей ультрафиолетовое излучение. Допускается использовать в комбинации с затемненным освещением (когда отсутствует прямое солнечное освещение) занавески или шторы в комбинации с искусственным освещением.

4.5 Ацетонитрил, степень чистоты для ВЭЖХ.

4.6 Метанол по ГОСТ 6995, степень чистоты ВЭЖХ.

4.7 Толуол по ГОСТ 5789.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Толуол огнеопасен и токсичен. Приготовление стандартов с использованием данного растворителя следует проводить в вытяжном шкафу. Операции за пределами вытяжного шкафа, такие как измерение эталонов методом УФ спектрометрии, следует проводить с использованием эталонов в закрытых контейнерах.

4.8 Смесь толуол/ацетонитрил

Смешивают 98 объемных частей толуола (4.7) с двумя объемными частями ацетонитрила (4.5) (см. предупреждение в 4.7).

4.9 Растворитель для экстракции

Смешивают семь объемных частей метанола (4.6) с тремя объемными частями воды (4.1).

Другие смеси - растворители для экстракции, которые совместимы с подвижной фазой, могут также использоваться, если покажут себя более эффективными или будут рекомендованы производителем иммуноаффинной колонки.

4.10 Подвижная фаза

Смешивают три объемные части воды (4.1) с одной объемной частью ацетонитрила (4.5) и одной объемной частью метанола (4.6). Перед использованием проводят дегазацию раствора.

4.11 Реагент для послеколоночной дериватизации

Растворяют 100 мг йода (4.3) в 2  метанола (4.6). Добавляют 200  воды (4.1), перемешивают в течение 1 ч, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.8). Раствор готовят на неделю использования и хранят в темноте или в склянке из коричневого стекла. Перед использованием раствор встряхивают в течение 10 мин.

4.12 Основные стандартные растворы афлатоксинов , , и

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Растворы, содержащие афлатоксины, предохраняют от действия света (хранят в темноте, используют алюминиевую фольгу или затемненную стеклянную посуду).

Афлатоксины , , и растворяют по отдельности в смеси толуол/ацетонитрил (4.8), для получения индивидуальных растворов с массовой концентрацией вещества 10 .

Для определения точной концентрации афлатоксина в каждом исходном растворе регистрируют спектр поглощения при длинах волн от 330 до 370 нм в кварцевых кюветах толщиной 1 см (5.7), используя спектрометр (5.6).

Рассчитывают концентрацию каждого афлатоксина , , используя уравнение (1):

,

(1)

где - оптическая плотность, определяемая в максимуме спектра поглощения;

- молекулярная масса каждого афлатоксина, г/моль;

- коэффициент молярного поглощения каждого афлатоксина в смеси толуол/ацетонитрил.

Примечание - Это значение определено для раствора, который содержит с = 1  афлатоксина и находится в кюветах с длиной оптического пути d = 1 см. Коэффициент молярного поглощения () применяют без единиц измерения, допускается применять уравнение , ему соответствует единица измерений: ;

d - длина оптического пути кюветы, см.

и приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Молекулярные массы и коэффициенты молярного поглощения афлатоксинов , , и

Афлатоксин	, г/моль
	312	19300
	314	20400
	328	16600
	330	17900
Примечание - В качестве растворителя используется смесь толуола и ацетонитрила (4.8)

4.13 Основной стандартный раствор смеси афлатоксинов

Готовят исходный раствор, содержащий 500  афлатоксина , 125  афлатоксина , 250  афлатоксина и 125  афлатоксина в смеси толуол/ацетонитрил (4.8). При необходимости хранения раствора взвешивают колбу. Колбу плотно оборачивают алюминиевой фольгой и хранят при температуре около 4°С. Непосредственно перед использованием колбу взвешивают снова и отмечают любые изменения в массе после хранения.

Примечание - Обычное воздействие УФ излучения во время измерения оптической плотности не приводит к заметной конверсии с образованием продуктов фотолиза.

4.14 Градуировочный раствор смеси афлатоксинов

Каждую порцию основного стандартного раствора смеси афлатоксинов (4.13), как это указано в таблице 2, переносят в четыре мерные колбы вместимостью 2  (5.5). Растворы выпаривают до сухого остатка в токе азота при комнатной температуре. В каждую колбу добавляют 1  метанола (4.6). Растворяют в нем сухой остаток, разбавляют раствор до метки водой (4.1) и перемешивают. Растворы готовят непосредственно в день использования.

Таблица 2 - Приготовление стандартных растворов

Стандартный раствор	Объем, отобранный из исходного раствора, мкл	Концентрация афлатоксина,
1	60	15,0	3,75	7,50	3,75
2	40	10,0	2,50	5,00	2,50
3	20	5,00	1,25	2,50	1,25
4	10	2,50	0,625	1,25	0,625
Примечание - Указанные значения приведены в качестве ориентиров. Точные значения массовой концентрации растворов вычисляют исходя из значений, рассчитанных по формуле (1) - см. 4.12

4.15 Серная кислота, по ГОСТ 4204, раствор c () = 2 .

5 Оборудование

Лабораторную стеклянную посуду, которая контактирует с водными растворами афлатоксинов в серной кислоте (4.15), погружают в воду на несколько часов, затем тщательно промывают (например, три раза) водой, чтобы удалить все следы кислоты. Отсутствие кислоты проверяют с помощью индикаторной бумаги.

Примечание - Данная обработка является необходимой, так как использование стеклянной посуды, промытой не кислотой, может привести к потере афлатоксинов. На практике данная обработка необходима для круглодонных колб, мерных колб, мерных цилиндров, склянок или пробирок, используемых для градуировочных растворов и конечных экстрактов (особенно автоматических пипеток), а также пастеровских пипеток, если они используются для переноса градуировочных растворов или экстрактов.

Обычное лабораторное оборудование и, в частности, то, которое приводится ниже.

5.1 Иммуноаффинная (IA) колонка

IA колонка содержит антитела, предназначенные для афлатоксинов , , и . Колонка должна иметь минимальную емкость не менее 100 нг афлатоксина и должна давать выход не менее 80% для афлатоксинов , и и не менее 60% для афлатоксина при внесении в колонку 15  градуировочного раствора, содержащего 5 нг каждого афлатоксина в смеси метанол/вода [одна часть метанола (4.6) и три - четыре части воды (4.1) по объему]. Колонка должна быть оборудована подходящей емкостью для растворителя (например, шприцем с переходной насадкой).

5.2 Блендер, с баком смесителя на 500  и крышкой.

Рекомендуется использование высокоскоростного блендера.

5.3 Рифленая фильтровальная бумага, например, диаметром 24 см.

5.4 Фильтровальная бумага из стеклянного микроволокна, например, диаметром 11 см.

5.5 Мерные колбы по ГОСТ 1770, вместимостью 2  или пикнометры по ГОСТ 22524.

Примечание - При использовании пикнометров рекомендуется измерять фактическое значение вместимости и использовать его при обработке результатов измерений в качестве величины [см. формулу (3)]

5.6 Спектрофотометр, предназначенный для измерения оптической плотности в диапазоне длин волн от 200 до 400 нм.

5.7 Кюветы из кварцевого стекла толщиной 1 см, не имеющие существенного поглощения в диапазоне длин волн от 300 до 370 нм.

5.8 Мембранный фильтр для водных растворов, изготовленный из политетрафторэтилена, диаметром 4 мм и размером пор 0,45 мкм.

5.9 Оборудование для ВЭЖХ

5.9.1 Насос ВЭЖХ, способный производить скорость потока 1 .

5.9.2 Система ввода (инжектор), со шприцевой загрузкой и петлей 50 мкл или эквивалентным.

5.9.3 Аналитическая разделяющая колонка с обращенной фазой, например , которая обеспечивает разрешение пиков афлатоксинов , , и до базовой линии от всех остальных пиков и которая имеет следующие характеристики:

- длина: 250 мм;

- внутренний диаметр: 4,6 мм;

- размер сферических частиц: 5 мкм.

Допускается использование колонки меньшей длины.

5.9.4 Система послеколоночной дериватизации, состоящая из безпульсационного насоса и тройника, имеющего очень малый мертвый объем, системы труб из политетрафторэтилена или нержавеющей стали длиной от 3000 до 5000 мм и внутренним диаметром 0,5 мм, а также водяной бани или послеколоночного реактора для реакции с участием йода.

5.10 Флуоресцентный детектор, пригодный для работы при длине волны возбуждения 365 нм и излучении при длине волны эмиссии 435 нм (для фильтровых приборов длина волны регистрации излучения > 400 нм), с пределом детектирования не более 0,05 нг афлатоксина в объеме ввода (в данном случае он равен 50 мкл).

6 Методика испытания

6.1 Общие замечания

Растворы проб и стандартные растворы для определения с помощью ВЭЖХ должны содержать одинаковый растворитель или смесь растворителей.

6.2 Экстракция

Взвешивают 25 г гомогенизированной пробы, с точностью 0,1 г в сосуде блендера (см. 5.2). Добавляют 5 г хлорида натрия (см. 4.2) и 125  растворителя для экстракции (см. 4.10) и гомогенизируют с помощью перемешивающего устройства в течение 2 мин при высокой скорости. Контролируют, чтобы время и скорость перемешивания не оказывали негативного влияния на эффективность экстракции. Смесь фильтруют через рифленую фильтровальную бумагу (см. 5.3) ().

Отбирают пипеткой 15  () фильтрата в коническую колбу подходящего размера со стеклянной пробкой. Добавляют 30  воды, закрывают колбу пробкой и перемешивают. Перед проведением аффинной колоночной хроматографии разбавленный экстракт фильтруют через фильтровальную бумагу из стеклянного микроволокна (5.4). Фильтрат () должен быть прозрачным. Если это не так, проводят повторную фильтрацию. Незамедлительно следуют процедурам в соответствии с 6.3.

Для получения прозрачного раствора можно также использовать центрифугу.

6.3 Очистка

Готовят IA колонку (см. 5.1) и осуществляют процедуру очистки в соответствии с инструкциями производителя. Отбирают пипеткой 15  () второго фильтрата () в емкость для растворителя IA колонки. Пропускают его через разделяющую колонку, затем промывают колонку, как это описано в инструкциях производителя, и удаляют элюаты. Начинают проводить элюирование афлатоксинов. Собирают этанольный или ацетонитрильный элюат (в зависимости от продукта или инструкций производителя) в мерной колбе вместимостью 2  (см. 5.5) (или другого объема, установленного производителем). Разбавляют до метки водой (). Перемешивают и действуют в соответствии с 6.4.

Методы ввода в IA колонки, промывания и элюирования немного отличаются в зависимости от производителя колонки, и необходимо четко следовать конкретным инструкциям, прилагаемым к колонкам.

Примечание - В целом, процедуры включают экстракцию образца смесью метанола и воды, фильтрацию или центрифугирование, возможное разбавление образца раствором фосфатного буфера или водой, загрузку под давлением в предварительно промытую колонку, промывку колонки дистиллированной водой и элюирование афлатоксинов метанолом или ацетонитрилом (в зависимости от продукта и инструкций производителя).

Допускается использовать традиционные колонки с силикагелем или колонки твердофазной экстракции. В этих случаях также необходимо четко следовать инструкциям производителя. Если растворитель, применяемый для элюирования афлатоксинов, не совместим с подвижной фазой, то элюат необходимо выпарить до сухого остатка в токе азота при температуре ниже 40°С. Остаток необходимо растворить в подвижной фазе и разбавить до 2  или до того объема, который установлен производителем.

Необходимо предусмотреть, чтобы максимальная емкость колонки не была превышена.

6.4 Условия работы при выполнении ВЭЖХ

Выход разделительной колонки подсоединяют к одному ответвлению тройника системы послеколоночной дериватизации (5.9.4) с помощью короткого фрагмента системы труб с внутренним диаметром, например, 0,25 мм. Ко второму ответвлению тройника подсоединяют выход насоса, который поставляет реагент для послеколоночной дериватизации. Один конец витка труб из политетрафторэтилена или нержавеющей стали (см. 5.9.4) присоединяют к третьему ответвлению тройника и другой конец присоединяют к детектору (см. 5.10). Используя термостат или водяную баню, поддерживают температуру реакционного змеевика на уровне 70°С.

В случае использования колонки, указанной в 5.9.3, подходящими являются следующие параметры:

- скорость потока подвижной фазы (колонка): 1,0 ;

- скорость потока послеколоночного реагента: 0,3 ;

- впрыскиваемый объем: 50 мкл.

Дают всей системе функционировать 10 - 20 мин для ее стабилизации. Если используется интегратор, настраивают регулировку чувствительности флуоресцентного детектора или интегратора, чтобы получить соответствующий сигнал: шум 5:1 для 0,125 нг афлатоксина в 50 мкл. Если используется регистрирующий прибор с ленточной диаграммой, настраивают регулировку флуоресцентного детектора таким образом, чтобы получить для 0,125 нг афлатоксина в 50 мкл от 30% до 40% шкалы регистрирующего прибора.

6.5 Идентификация

Проводят идентификацию каждого пика афлатоксина на хроматограмме образца путем сравнения значений времени удерживания со значениями