Методические указания МУК 4.1.787-99 "Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 23 октября 1999 г.)

Методические указания МУК 4.1.787-99
"Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 23 октября 1999 г.)

Дата введения: 1 января 2000 г.

Введены впервые

1. Назначение и область применения

Настоящие методические указания устанавливают способы подготовки проб продовольственного сырья и пищевых продуктов методом твердофазной экстракции для последующего хроматографического анализа микотоксинов и предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции учреждениями госсанэпидслужбы РФ, а также для предприятий и учреждений, осуществляющих контроль качества и исследования продовольственного сырья и продуктов питания в соответствии с СанПиН 2.3.2.560-96 "Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов" и аккредитованных в установленном порядке.

2. Способ подготовки проб

Подготовка проб включает следующие разделы:

- экстракция объекта испытания, предусматривающая получение единого экстракта, содержащего все микотоксины, нормируемые в данном объекте по СанПиН 2.3.2.560-96;

- (подготовка экстракта проб методом твердофазной экстракции, включающая предварительную очистку, концентрирование и окончательную очистку на концентрирующих патронах Диапак.

3. Требования безопасности

При работе с реагентами, растворителями и веществами необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

4. Условия выполнения подготовки проб

Процессы приготовления растворов и обработки проб проводят в нормальных условиях при температуре окружающего воздуха .

5. Афлатоксин (, зеараленон (ЗОН), дезоксиниваленол (ДОН) и Т-2 токсин (Т-2)

5.1. Оборудование, материалы, реактивы

Таблица 1

Оборудование, материалы, реактивы и растворы			ЗОН		ДОН	Т-2
	1 вар.	2 вар.	1 вар.	2 вар.
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78 или магнитная или механическая мешалка	+
Весы аналитические с погрешностью взвешивания г	+
Мельница типа "Циклон" QC-114	+
Испаритель ротационный (ИР-1М2, ТУ 25-1173.102-84 или др.)	+
Устройство для создания вакуума около - 0,7 мм рт. ст. (водоструйный насос, масляный вакуумный насос, медицинский отсасыватель)	+
Вакуумное устройство для подготовки проб (вакуумный манифолд), с приемниками проб вместимостью не менее 10	+
Устройство для упаривания проб в токе азота при нагревании около 40°С (желательно суховоздушная баня)	+	+	-	-	-	-
Концентрирующий патрон Диапак А-3, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"	+	+	+	+	+	+
Концентрирующий патрон Диапак АУ-3, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"	-	-	-	-	+	+
Концентрирующий патрон Диапак П-3, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"	+	+	+	+	-	-
Концентрирующий патрон Диапак Н, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"	+	-	+	-	+	+
Концентрирующий патрон Диапак С, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"	-	+	-	+	-	-
Пинцет медицинский, 15 см	+
Шпатель металлический или фарфоровая ложка	+
Колбы плоскодонные конические с пробками вместимостью 50 по ГОСТу 25336	+	+	+	+	-	-
Колбы плоскодонные конические (Эрленмейера) с пробками вместимостью 250 или 300 по ГОСТу 25336	+
Колба Бюхнера вместимостью 500	+
Воронка Бунзена вместимостью 200	+
Воронка делительная вместимостью 250 по ГОСТу 25336	+
Колбы остродонные с пробками по ГОСТу 25336 с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 5, 10 или 25	+
Колбы грушевидные с пробками по ГОСТу 25336 с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 10 и 25	+	+	+	+	-	-
Цилиндры мерные вместимостью 25, 50, 100 , 2 кл., по ГОСТу 1770	+
Микрошприц вместимостью 100 (или пипетка с делениями по ГОСТу 20292 исполнения 4 или 5, 1-го класса точности вместимостью 1 )	+
Бумага фильтровальная (плотная, узкопористая, медленно фильтрующая для тонких осадков, типа "синяя лента")	-	-	-	-	+	+
Вата медицинская нестерилизованная, х/б	+
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ОП-3 осч. по ТУ 6-09-14-2167-84, ректифицированный	+
Ацетон, осч, по ТУ 6-09-3513-75 ОП-2, ректифицированный	-	+	-	-	-	-
Бензол, хч, по ГОСТу 5955-75, выдержанный над , ректифицированный	+	+	+	+	-	-
Гептан, гексан, хч, по ТУ 6-09-3375-78 или петролейный эфир (фракция 70-100), хч, ректифицированный	+	+	+	+	-	-
Пропанол-2 (изопропиловый спирт), хч, по ТУ 6-09-402-75, ректифицированный	-	-	-	-	+	+
Уксусная кислота ледяная, хч, по ГОСТу 61-75	+	+	+	+	-	-
Хлороформ, медицинский, выдержанный над , ректифицированный	-	-	-	-	+	+
Хлористый метилен (дихлорметан), выдержанный над , ректифицированный	+	+	-	-	-	-
Эфир диэтиловый, выдержанный над NaOH, ректифицированный	-	+	-	-	-	-
Этилацетат (этиловый эфир уксусной кислоты), хч, по ГОСТу 22300-76, выдержанный над и ректифицированный	-	+	-	-	-	-
Сульфат натрия, безводный, хч, по ГОСТу 4166-76	+	+	+	+	-	-
Хлорид натрия, хч, по ГОСТу 4233-77	+
Вода дистиллированная	+
Экстрагент - 84% ацетонитрила в воде, 840 ацетонитрила доводятся до 1 литра водой либо получается путем ректифткации с водой водно-ацетонитрильной смеси (1:4)	+
33% бензола в ацетонитриле - смешать 30 бензола и 60 ацетонитрила (1:2)	+	+	+	+	-	-
20% ацетонитрила в бензоле - 20 ацетонитрила разбавить бензолом до 100	+	-	-	-	-	-
2% уксусной кислоты в бензоле - 2 уксусной кислоты разбавить бензолом до 100	-	-	+	-	-	-
5% уксусной кислоты в бензоле - 5 уксусной кислоты разбавить бензолом до 100	-	+	-	-	-	-
10% этилацетата в бензоле - 10 этилацетата разбавить бензолом до 100	-	+	-	+	-	-
25% гексана в эфире - 25 гексана разбавить диэтиловым эфиром до 100	-	+	-	-	-	-
10% ацетона в дихлорметане - 10 ацетона разбавить дихлорметаном до 100	-	+	-	-	-	-
20% ацетона в дихлорметане - 20 ацетона разбавить дихлорметаном до 100	-	-	-	-	+	-

5.2. Способ подготовки проб

Определяемые микотоксины извлекают экстрагентом из пробы при соотношении масса пробы - объем экстрагента 1:5. При определении афлатоксина и зеараленона проводят очистку водно-ацетонитрильного экстракта на патроне Диапак А-3, концентрируют микотоксины на патроне Диапак П-3, высушивают от остатков воды и после упаривания и перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак Н (Диапак С - в случае кукурузы и продуктов из нее). Фракционным элюированием получают две фракции, содержащие афлатоксин и зеараленон, готовые к хроматографическому анализу.

При определении дезоксиниваленола и Т-2 токсина, проводят предварительную очистку водно-ацетонитрильного экстракта на патроне Диапак АУ-3 и концентрируют упариванием досуха. После перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак Н. Фракционным элюированием получают две фракции, содержащие дезоксиниваленол и Т-2 токсин, готовые к хроматографическому анализу.

Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения микотоксинов проводят анализ пробы методом стандартной добавки в исходный экстракт. Основные характеристики пробоподготовки методом твердофазной экстракции приведены в табл. 2.

Основные характеристики подготовки проб

Таблица 2

Микотоксин	Время пробоподготовки, мин	Степень извлечения, %	Относительное среднее квадратическое отклонение, %
Афлатоксин	120	75	20
Зеараленон	120	70	20
Дезоксиниваленол	90	85	10
Т-2 токсин	90	85	10

Для достижения указанной степени извлечения необходимо точно выполнять требования к квалификации органических растворителей, их подготовке и приготовлению растворов, перечисленных в п. 5.1. Алгоритм поиска возможных потерь целевых микотоксинов при подготовке проб приведен в прилож. 1 к настоящим методическим указаниям.

5.3. Подготовка концентрирующих патронов

Патроны Диапак представляют собой пластиковую колонку, содержащую 1 или 3 герметично упакованного сорбента.

5.3.1. Концентрирующий патрон Диапак А-3

Вскрыть выходную линию патрона Диапак А-3, сняв полимерную заглушку. Установить патрон в вертикальном положении узким концом вниз в подходящее устройство для вакуумирования и сбора элюата. Осторожно открыть полимерную крышку патрона, сформировать ровный горизонтальный верхний слой сорбента легким постукиванием по патрону и зафиксировать его с помощью небольшого ватного тампона. Подключить вакуум к устройству для вакуумирования и обеспечить подачу вакуума к патрону.

Концентрирующий патрон Диапак А-3 одноразового применения и регенерации не подлежит.

5.3.2. Концентрирующий патрон Диапак АУ-3

Подготовка концентрирующего патрона Диапак АУ-3 проводится аналогично п. 5.3.1.

Концентрирующий патрон Диапак АУ-3 одноразового применения и регенерации не подлежит.

5.3.3. Концентрирующий патрон Диапак П-3

Установить патрон Диапак П-3 вертикально в подходящее устройство для вакуумирования и открыть верхнюю крышку. Суспендировать сорбент при перемешивании стеклянной палочкой в 10 бензола, дать отстояться сорбенту и пропустить при слабом вакууме, не допуская попадания воздуха на сорбент, последовательно по 10 бензола и ацетона.

Сохранив слой ацетона около 2 см, ввести пористый полимерный фильтр (имеется в комплекте) и уплотнить его палочкой по верхнему слою сорбента. Затем пропустить оставшийся ацетон и последовательно по 10 экстрагента и смеси экстрагент-вода (1:1), не допуская попадания воздуха на сорбент со скоростью 2-3 капли в секунду.

Сохранив слой последнего элюента около 2 см, отключить вакуум и заглушить патрон сначала верхней крышкой, а затем (после прекращения скапывания) и нижней заглушкой. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение рабочего дня, а при случайном пересыхании приводится в рабочее состояние прокачиванием 10 смеси экстрагент-вода (1:1).

Концентрирующий патрон Диапак П-3 многоразового применения и подлежит регенерации по схеме, как указано выше, после проведения пробоподготовки.

5.3.4. Концентрирующий патрон Диапак Н

Снять с патрона Диапак Н заглушки, пропустить через него с помощью шприца 5 бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25°С.

Концентрирующий патрон Диапак Н многоразового применения и подлежит регенерации по следующим схемам после проведения пробоподготовки:

- после подготовки пробы ДТ - последовательно пропустить через патрон по 5 этилового спирта, ацетона и бензола;

- после подготовки пробы АЗ - последовательно пропустить через патрон по 5 ацетона и бензола.

5.3.5. Концентрирующий патрон Диапак С

Снять с патрона Диапак С заглушки, пропустить через него с помощью шприца 5 бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25°С.

Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.

5.4. Экстракция микотоксинов

5.4.1. Зерно и зернопродукты

25 г размолотой пробы перенести в коническую колбу и залить 125 экстрагента. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. Экстракт отфильтровать через бумажный фильтр "синяя лента".

5.4.2. Орехи и семена масличных культур

25 г размолотой пробы перенести в колбу Эрленмейера, добавить 125 экстрагента и 40 гексана. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. После перемешивания внести в экстракт 1 г хлорида натрия и продолжить перемешивание в течение 5 мин. Отфильтровать через бумажный фильтр "синяя лента". Отфильтрованный экстракт перенести в делительную воронку и после расслоения раствора собрать нижний водно-ацетонитрильный слой. Ацетонитрильный экстракт обезжирить 25 гексана в делительной воронке вместимостью 250 .

Экстракт перенести в делительную воронку, добавить еще 25 гептана и интенсивно перемешать. После расслоения собрать нижний водно-ацетонитрильный экстракт.

5.4.3. Масло растительное

25 г масла перенести в колбу Эрленмейера, добавить 40 гексана и 125 экстрагента. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. После перемешивания в экстракт внести 0,2 г хлористого натрия и продолжить перемешивание в течение 3-5 мин. Экстракт перенести в делительную воронку и после расслоения смеси собрать нижний водно-ацетонитрильный слой. Ацетонитрильный экстракт обезжирить 25 гексана или гептана или петролейного эфира в делительной воронке вместимостью 250 .

Экстракт перенести в делительную воронку, добавить еще 25 гептана и интенсивно перемешать. После расслоения собрать нижний водно-ацетонитрильный экстракт.

5.5. Очистка и концентрирование проб

5.5.1. Очистка и концентрирование пробы при определении афлатоксина и зеараленона

5.5.1.1. Предварительная очистка и концентрирование пробы

25 обезжиренного экстракта пропустить через патрон Диапак А-3 со скоростью капли в секунду и отобрать 20 элюата.

Полученный элюат объемом 20 разбавить равным объемом воды. Полученный раствор пропустить через патрон Диапак П-3 со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего патрон промыть 5 воды и продуть воздухом в течение 1 мин.

Целевую фракцию элюировать с патрона Диапак П-3 последовательно 7 ацетонитрила и 7 33%-ного бензола в ацетонитриле - со скоростью 1-2 капли в секунду. Собранный элюат пропустить через слой безводного сульфата натрия (10 г) самотеком. Колбу ополоснуть 2 33%-ного бензола в ацетонитриле и содержимое перенести на тот же слой безводного сульфата натрия. Промыть сульфат натрия 3 33%-ного бензола в ацетонитриле. Высушенный фильтрат упарить до суха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С и немедленно перерастворить в 0,5 бензола.

5.5.1.2. Окончательная очистка на патроне Диапак Н (вариант 1)

Бензольный раствор нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак Н. Колбу, содержавшую сухой остаток, обмыть еще 2 раза по 0,5 бензола и последовательно нанести растворы на патрон Диапак Н. Все смывы с патрона отбросить.

Зеараленон элюировать с патрона Диапак Н 4 2%-ной уксусной кислоты в бензоле и упарить досуха (до исчезновения запаха уксусной кислоты) на ротационном испарителе при температуре не выше 50°С (Проба З). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.

Затем элюировать афлатоксин 5 20%-ного ацетонитрила в бензоле с патрона и упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40°С (Проба А). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ афлатоксина , , - 4 г.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ зеараленона, , - 4 г.

5.5.1.3. Окончательная очистка на патроне Диапак С (вариант 2)

Рекомендуется для кукурузы и продуктов из нее.

Бензольный раствор нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак С. Колбу, содержавшую сухой остаток, обмыть еще 2 раза по 0,5 бензола и нанести растворы на патрон Диапак С при достижении верхнего фильтра патрона уровнем предыдущей порции раствора. Все смывы с патрона отбросить.

Зеараленон элюировать с патрона Диапак С 6 10%-ного этилацетата в бензоле и упарить досуха (до исчезновения запаха бензола) на ротационном испарителе при температуре не выше 50°С (Проба 3). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.

Затем через патрон Диапак С последовательно пропустить 3 5%-ной уксусной кислоты в бензоле и 4 25%-ного гексана в эфире. Все элюаты отбросить. Афлатоксин элюировать с патрона 6 10%-ного ацетона в дихлорметане. Элюат упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40°С (Проба А). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ афлатоксина , , - 4 г.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ зеараленона, , - 4 г.

5.5.2. Очистка и концентрирование пробы при определении дезоксиниваленола и Т-2 токсина

5.5.2.1. Предварительная очистка и концентрирование пробы

20 экстракта пропустить через патрон Диапак АУ-3 со скоростью капли в секунду. Элюат собрать. Патрон промыть 5 экстрагента и отфильтровать объединенные элюаты в сердцевидную колбу, фильтр промыть 2 ацетонитрила, собирая промывочную жидкость в ту же колбу. Упарить досуха на ротационном испарителе при температуре около . Упаривание повторить 2-3 раза с добавлением в колбу пропанола-2 или ацетонитрила до исчезновения капель воды на стенках колбы (Проба ДТ).

5.5.2.2. Окончательная очистка на патроне Диапак Н

Пробу ДТ растворить в 0,5 хлороформа и нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак Н. Колбу обмыть еще 2 раза по 0,5 хлороформа и последовательно нанести растворы на тот же патрон, начав сбор фракций, содержащих Т-2 токсин, в отгонную колбу. Завершить элюирование Т-2 токсина 2 хлороформа в ту же колбу. Элюат упарить досуха на ротационном испарителе при температуре и перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению Т-2 токсина (Проба Т).

Дезоксиниваленол элюировать с патрона в другую отгонную колбу 6 20%-ного ацетона в хлороформе. Элюат упарить досуха на ротационном испарителе при температуре и перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению дезоксиниваленола (Проба Д).

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ дезоксиниваленола, , - 4 г.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ Т-2 токсина, , - 4 г.

6. Афлатоксин

6.1. Оборудование, материалы, реактивы

Испаритель ротационный ИР-1М2 или устройство для упаривания проб в токе азота при нагревании около 40°С	ТУ 25-1173.102-84 или др.
Центрифуга типа ЦЛН-2, или аналогичная	ТУ 5-375-4171-73
Устройство для создания вакуума около - 0,7 мм рт. ст. (водоструйный насос, масляный вакуумный насос, медицинский отсасыватель)
Вакуумное устройство для подготовки проб (вакуумный манифолд), с приемниками проб вместимостью не менее 10
Концентрирующий патрон Диапак С16М, ЗАО "БиоХимМак СТ"	ТУ 4215-002-05451931-94
Концентрирующий патрон Диапак С, ЗАО "БиоХимМак СТ"	ТУ 4215-002-05451931-94
Пинцет медицинский, 15 см
Шприц вместимостью 10 или 20 типа Луер
Колбы плоскодонные конические с пробками, вместимостью 50	ГОСТ 25336
Колбы остродонные с пробками, с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 10 или 25	ГОСТ 25336
Колбы грушевидные с пробками, с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 25	ГОСТ 25336
Цилиндры мерные вместимостью 50 , 2 кл., или пробирка градуированная вместимостью 15 или 20	ГОСТ 1770
Микрошприц вместимостью 100 или пипетка с делениями исполнения 4 или 5, 1-го класса точности вместимостью 1	ГОСТ 20292

ГАРАНТ:

Постановлением Госстандарта СССР от 27 декабря 1991 г. N 2234 взамен ГОСТ 20292-74 в части общих требований к градуированным пипеткам с 1 января 1994 г. введен ГОСТ 29227-91

Постановлением Госстандарта СССР от 29 декабря 1991 г. N 2344 взамен ГОСТ 20292-74 в части бюреток с временем ожидания с 1 января 1994 г. введен в действие ГОСТ 29253-91

Вата медицинская нестерилизованная, х/б
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ОП-3, осч, ректифицированный или Ацетонитрил, 1 сорт, кооператив "Криохром", г. Санкт-Петербург	ТУ 6-09-14-2167-84
Ацетон, осч, ОП-2, ректифицированный	ТУ 6-09-3513-75
Гептан, гексан, хч, или петролейный эфир (марки 70-100), ректифицированный	ТУ 6-09-3375-78
Кислота лимонная, 1-водная, чда	ГОСТ 3652-29
Хлорид натрия, хч	ГОСТ 4233-66
Хлороформ медицинский, выдержанный над , ректифицированный
Сульфат натрия, безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Вода дистиллированная

20% ацетона в хлороформе - к 20 ацетона добавить хлороформ до 100 общего объема или 5% метанола в хлороформе - к 20 хлороформа добавить 5 метанола, объем раствора довести хлороформом до 100 .

6.2. Способ подготовки проб

Афлатоксин извлекают из пробы жидкого молока пропусканием ее через патрон Диапак С16М. Затем фракцию, содержащую афлатоксин , элюируют хлороформом с патрона и, после высушивания и упаривания, проводят окончательную очистку на патроне Диапак С. Подготовленная проба готова к хроматографическому анализу.

Афлатоксин из кисломолочных напитков и сметаны экстрагируют хлороформом в присутствии хлорида натрия и лимонной кислоты в соответствии с МУ N 4082-86*(1) и, после высушивания и упаривания, проводят окончательную очистку на патроне Диапак С.

Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения микотоксинов проводят анализ методом стандартной добавки в исходный экстракт.

Время проведения пробоподготовки - 60 мин. Степень извлечения*(2) - 80%. Относительное среднее квадратическое отклонение - 10%.

6.3. Подготовка концентрирующих патронов

6.3.1. Концентрирующий патрон Диапак С16М

Снять с патрона Диапак С16М заглушки и пропустить через него с помощью шприца последовательно по 5 ацетонитрила и воды. За глушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25°С.

Концентрирующий патрон Диапак С16М одноразового применения и регенерации не подлежит.

6.3.2. Концентрирующий патрон Диапак С

Снять с патрона Диапак С заглушки и пропустить через него с помощью шприца 5 бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25°С.

Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.

6.4. Подготовка проб молочных продуктов к анализу

6.4.1. Подготовка, концентрирование и очистка проб молока

Пробу молока 50 центрифугировать на подходящем оборудовании в течение 5 мин при 1000 об./мин. Для определения афлатоксина отобрать 20 супернатанта, избегая попадания жира.

Сухое молоко растворяется в соответствии с инструкцией или соответствующим ТУ и обрабатывается, как описано выше.

20 подогретой до 40°С подготовленной пробы молока пропустить через предварительно подготовленный патрон Диапак С16М со скоростью 3 капли в секунду. Затем патрон промыть 5 дистиллированной воды и высушить продуванием воздуха в течение 1 мин. Элюаты отбросить. Патрон промыть 10 гексана и вновь высушить воздухом в течение 1 мин.

Афлатоксин элюировать 6 хлороформа. Собранный элюат пропустить самотеком через слой безводного сульфата натрия (3 ). Колбу обмыть 1 хлороформа и содержимое перенести на тот же слой безводного сульфата натрия. Хлороформные растворы собрать (Экстракт М).

6.4.2. Подготовка проб сметаны и кисломолочных продуктов

В коническую колбу вместимостью 250 помещают навеску 20,0 г сметаны или 40 кисломолочного напитка. Затем туда же вносят 10,0 водного раствора 2 г хлорида натрия и 0,24 г лимонной кислоты и 100 хлороформа (все составные части предварительно подогревают до температуры ). Содержимое колбы встряхивают мин, переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют 15 мин при об./мин. Отделяют нижний хлороформный слой, высушивают над 10 г безводного сульфата натрия, отфильтровывают, измеряют объем фильтрата () и упаривают до (Экстракт М).

6.5. Окончательная очистка пробы

Экстракт М нанести на патрон Диапак С со скоростью капли в секунду. Промыть сульфат натрия 1 хлороформа и раствор нанести на патрон Диапак С при достижении верхнего фильтра патрона уровнем предыдущей порции раствора.

Афлатоксин элюировать с патрона 10 20%-ного ацетона в хлороформе или 7 5%-ного метанола в хлороформе. Элюат собрать и упарить досуха на ротационном испарителе или в слабом токе азота при температуре не выше 40°С. Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению (Проба М).

Эквивалент массы пробы молока, взятой на анализ афлатоксина , , - 20 г.

Эквивалент массы пробы сухого молока рассчитывается по формуле:

, где (6.1)

- эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;

m - масса пробы сухого молока, г;

V - объем воды для растворения пробы сухого молока, .

Эквивалент массы пробы сметаны или кисломолочных напитков, взятой на анализ, рассчитывается по формуле:

, где (6.2)

- эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;

- объем фильтрата, ;

- масса (объем) пробы сметаны или кисломолочных напитков, г ().

7. Патулин

7.1. Оборудование, материалы, реактивы

Испаритель ротационный ИР-1М2	ТУ 25-1173.102-84 или др.
Центрифуга типа ЦЛН-2, или аналогичная	ТУ 5-375-4171-73
Устройство для создания вакуума около - 0,7 мм рт. ст. (водоструйный насос, масляный вакуумный насос, медицинский отсасыватель)
Вакуумное устройство для подготовки проб (вакуумный манифолд), с приемниками проб вместимостью не менее 10
Устройство для упаривания проб в токе азота при нагревании около 40°С (желательно суховоздушная баня)
Концентрирующий патрон Диапак П-3, ЗАО "БиоХимМак СТ"	ТУ 4215-002-05451931-94
Концентрирующий патрон Диапак С, ЗАО "БиоХимМак СТ"	ТУ 4215-002-05451931-94
Пинцет медицинский, 15 см
Колбы плоскодонные конические с пробками вместимостью 50	ГОСТ 25336
Колбы остродонные с пробками с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 5, 10 или 25	ГОСТ 25336
Колбы грушевидные с пробками с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 25	ГОСТ 25336
Пробирка градуированная вместимостью 15 или 20	ГОСТ 1770
Цилиндры мерные вместимостью 10 и 50 , 2 кл.	ГОСТ 1770
Микрошприц вместимостью 100 (или пипетка с делениями исполнения 4 или 5, 1-го класса точности вместимостью 1 )	ГОСТ 20292
Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ
Вата медицинская нестерилизованная, х/б
Ацетат цинка 2-водный, чда	ГОСТ 5823
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ОП-3 осч, ректифицированный	ТУ 6-09-14-2167-84
Ацетон, осч, ректифицированный, ОП-2	ТУ 6-09-3513-75
Бензол, хч, ректифицированный	ГОСТ 5955-75
Гексацианоферрат II калия (калий железистосинеродистый) 3-водный, хч	ГОСТ 4207
Гептан, гексан, хч, или петролейный эфир (фракция 70-100), хч, ректифицированный	ТУ 6-09-3375-78
Хлороформ, медицинский, выдержанный над , ректифицированный
Этилацетат (этиловый эфир уксусной кислоты), хч, выдержанный над и ректифицированный	ГОСТ 22300-76
Карбонат натрия, хч	ГОСТ 83-79
Сульфат натрия, безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Вода бидистиллированная

1,5% карбоната натрия - 1,5 г карбоната натрия растворить в 100 воды.

15% этилацетата в бензоле - 15 этилацетата разбавить бензолом до 100 .

30% этилацетата в бензоле - 30 этилацетата разбавить бензолом до 100 .

Раствор Карреза I - 15,0 г гексацианоферрата II калия растворить в 100 воды.

Раствор Карреза II - 30,0 г ацетата цинка растворить в 100 воды.

7.2. Способ подготовки проб

Микотоксин патулин извлекают из проб осветленных соков и напитков пропусканием их через патрон Диапак П-3. Затем патулин элюирут этилацетатом с патрона и после обработки раствором , высушивания, упаривания и перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак С.

Соки и напитки с мякотью и консистентные продукты разводят водой, осветляют растворами Карреза в соответствии с ГОСТом 28038-89*(3), фильтруют и экстрагируют патулин пропусканием фильтрата через патрон Диапак П-3. Затем патулин элюирут этилацетатом с патрона и после обработки раствором , высушивания, упаривания и перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак С.

Подготовленные пробы готовы к хроматографическому анализу.

Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения патулина проводят анализ методом стандартной добавки в пробу.

Время проведения пробоподготовки - 90 мин. Степень извлечения*(4) - 60%. Относительное среднее квадратическое отклонение - 10%.

7.3. Подготовка концентрирующих патронов

7.3.1. Концентрирующий патрон Диапак П-3

Установить патрон Диапак П-3 вертикально в подходящее устройство для вакуумирования и открыть верхнюю крышку. Суспендировать сорбент при перемешивании стеклянной палочкой в 10 бензола, дать отстояться сорбенту и пропустить при слабом вакууме, не допуская попадания воздуха, последовательно по 10 бензола и ацетона.

Сохранив слой ацетона около 2 см, ввести пористый полимерный фильтр (имеется в комплекте) и уплотнить его палочкой по верхнему слою сорбента. Затем пропустить оставшийся ацетон и последовательно по 10 экстрагента (см. п. 5.1) и смеси экстрагент-вода (1:1), не допуская попадания воздуха на сорбент со скоростью 2-3 капли в секунду.

Сохранив слой последнего элюента около 2 см, отключить вакуум и заглушить патрон сначала верхней крышкой, а затем (после прекращения скапывания) и нижней заглушкой. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение рабочего дня, а при случайном пересыхании приводится в рабочее состояние прокачиванием 10 смеси экстрагент-вода (1:1).

Перед проведением пробоподготовки через патрон Диапак П-3 пропустить 10 воды.

Концентрирующий патрон Диапак П-3 многоразового применения и подлежит регенерации после проведения пробоподготовки по схеме его подготовки, как указано выше.

7.3.2. Концентрирующий патрон Диапак С

Снять с патрона Диапак С заглушки и пропустить через него с помощью шприца 5 бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25°С.

Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.

7.4. Подготовка проб к анализу

7.4.1. Подготовка осветленных соков и напитков

Отфильтровать пробу через плотный бумажный фильтр до получения 20 фильтрата (Фильтрат П).

7.4.2. Подготовка соков и напитков с мякотью и консистентных продуктов

Навеску пробы массой 10,0 г поместить в стеклянный стакан, смешать с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 . В мерную колбу внести 6,0 раствора Карреза I и 6,0 раствора Карреза II. Содержание колбы довести дистиллированной водой до метки, тщательно перемешать и отфильтровать в мерный цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Измерить объем фильтрата (Фильтрат П).

7.5. Концентрирование и очистка пробы

7.5.1. Концентрирование пробы на патроне Диапак П-3

Весь объем Фильтрата П нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак П-3 со скоростью 1-2 капли в секунду. Промыть патрон 5 бидистиллированной воды. Все смывы отбросить.

Патулин элюировать с патрона 10 этилацетата в колбу или мерную пробирку с пришлифованной пробкой, содержащую 5 1,5%-ного карбоната натрия, закрыть пробкой, интенсивно перемешать и дать отстояться. Декантировать верхний этилацетатный слой, высушить его безводным сульфатом натрия (3 г) и перенести в колбу для упаривания. В колбу или пробирку, содержащую оставшийся 1,5%-ный карбонат натрия, добавить еще 10 этилацетата, перемешать и, после полного расслоения, высушивания этилацетатного слоя тем же сульфатом натрия, объединить его с первой порцией этилацетатного раствора в той же колбе для упаривания. Операцию повторить с 5 этилацетата.

Упарить этилацетатный раствор на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С до объема около 0,5 (не упаривать досуха!). Количественно перенести пробу в сердцевидную колбу вместимостью не более 5 или в полимерную пробирку типа Эппендорф, промыв предыдущую отгонную колбу 0,5 этилацетата, и присоединить к упариваемой пробе. Пробу упарить в токе азота при температуре не более 40°С в суховоздушной бане до 0,5 и добавить к ней 2,5 бензола.

7.5.2. Окончательная очистка пробы на патроне Диапак С

Бензолэтилацетатный раствор пропустить через патрон Диапак С со скоростью капли в секунду. Обмыть колбу еще 15%-ного этилацетата в бензоле и нанести на патрон. Все смывы отбросить.

Патулин элюировать с патрона 6 30%-ного этилацетата в бензоле, собирая элюат в сердцевидную отгонную колбу. Элюат упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40°С в суховоздушной бане.

Внимание! После упаривания пробу немедленно перерастворить в 100 мкл хлороформа, охлажденного до (для ТСХ-анализа) или в мкл охлажденной до бидистиллированной воды, подкисленной до рН 4,0 уксусной кислотой (для ВЭЖХ-анализа) и быстро охладить до (Проба П). Хранить Пробу П в холодильнике не более 1 ч.

Эквивалент массы пробы осветленных соков и напитков, взятой на анализ, - 20 г, соков и напитков с мякотью и консистентных продуктов определяется по формуле:

, где (7.1)

- эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;

- объем Фракции П, ;

- масса пробы соков и напитков с мякотью или консистентных продуктов, г.

______________________________

*(1) Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов и продовольственном сырье и пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Утв. МЗ СССР 20.03.86 N 4082-86.

*(2) При снижении степени извлечения афлатоксина см. прилож. 1.

*(3) Продукты переработки плодов и овощей. Метод определения митоксина патулина. ГОСТ 28038-89.

*(4) При снижении степени извлечения патулина см. прилож. 1.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко