Купить систему ГАРАНТ Получить демо-доступ Узнать стоимость Информационный банк Подобрать комплект Семинары

Методические указания МУК 4.1.787-99 "Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 23 октября 1999 г.)

 

Методические указания МУК 4.1.787-99
"Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 23 октября 1999 г.)

 

Дата введения: 1 января 2000 г.

Введены впервые

 

1. Назначение и область применения

 

Настоящие методические указания устанавливают способы подготовки проб продовольственного сырья и пищевых продуктов методом твердофазной экстракции для последующего хроматографического анализа микотоксинов и предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции учреждениями госсанэпидслужбы РФ, а также для предприятий и учреждений, осуществляющих контроль качества и исследования продовольственного сырья и продуктов питания в соответствии с СанПиН 2.3.2.560-96 "Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов" и аккредитованных в установленном порядке.

2. Способ подготовки проб

 

Подготовка проб включает следующие разделы:

- экстракция объекта испытания, предусматривающая получение единого экстракта, содержащего все микотоксины, нормируемые в данном объекте по СанПиН 2.3.2.560-96;

- (подготовка экстракта проб методом твердофазной экстракции, включающая предварительную очистку, концентрирование и окончательную очистку на концентрирующих патронах Диапак.

3. Требования безопасности

 

При работе с реагентами, растворителями и веществами необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

4. Условия выполнения подготовки проб

 

Процессы приготовления растворов и обработки проб проводят в нормальных условиях при температуре окружающего воздуха .

5. Афлатоксин (, зеараленон (ЗОН), дезоксиниваленол (ДОН) и Т-2 токсин (Т-2)

 

5.1. Оборудование, материалы, реактивы

 

Таблица 1

 

Оборудование, материалы, реактивы и растворы

ЗОН

ДОН

Т-2

1 вар.

2 вар.

1 вар.

2 вар.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78 или магнитная или механическая мешалка

+

Весы аналитические с погрешностью взвешивания г

+

Мельница типа "Циклон" QC-114

+

Испаритель ротационный (ИР-1М2, ТУ 25-1173.102-84 или др.)

+

Устройство для создания вакуума около - 0,7 мм рт. ст. (водоструйный насос, масляный вакуумный насос, медицинский отсасыватель)

+

Вакуумное устройство для подготовки проб (вакуумный манифолд), с приемниками проб вместимостью не менее 10

+

Устройство для упаривания проб в токе азота при нагревании около 40°С (желательно суховоздушная баня)

+

+

-

-

-

-

Концентрирующий патрон Диапак А-3, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"

+

+

+

+

+

+

Концентрирующий патрон Диапак АУ-3, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"

-

-

-

-

+

+

Концентрирующий патрон Диапак П-3, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"

+

+

+

+

-

-

Концентрирующий патрон Диапак Н, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"

+

-

+

-

+

+

Концентрирующий патрон Диапак С, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"

-

+

-

+

-

-

Пинцет медицинский, 15 см

+

Шпатель металлический или фарфоровая ложка

+

Колбы плоскодонные конические с пробками вместимостью 50 по ГОСТу 25336

+

+

+

+

-

-

Колбы плоскодонные конические (Эрленмейера) с пробками вместимостью 250 или 300 по ГОСТу 25336

+

Колба Бюхнера вместимостью 500

+

Воронка Бунзена вместимостью 200

+

Воронка делительная вместимостью 250 по ГОСТу 25336

+

Колбы остродонные с пробками по ГОСТу 25336 с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 5, 10 или 25

+

Колбы грушевидные с пробками по ГОСТу 25336 с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 10 и 25

+

+

+

+

-

-

Цилиндры мерные вместимостью 25, 50, 100 , 2 кл., по ГОСТу 1770

+

Микрошприц вместимостью 100 (или пипетка с делениями по ГОСТу 20292 исполнения 4 или 5, 1-го класса точности вместимостью 1 )

+

Бумага фильтровальная (плотная, узкопористая, медленно фильтрующая для тонких осадков, типа "синяя лента")

-

-

-

-

+

+

Вата медицинская нестерилизованная, х/б

+

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ОП-3 осч. по ТУ 6-09-14-2167-84, ректифицированный

+

Ацетон, осч, по ТУ 6-09-3513-75 ОП-2, ректифицированный

-

+

-

-

-

-

Бензол, хч, по ГОСТу 5955-75, выдержанный над , ректифицированный

+

+

+

+

-

-

Гептан, гексан, хч, по ТУ 6-09-3375-78 или петролейный эфир (фракция 70-100), хч, ректифицированный

+

+

+

+

-

-

Пропанол-2 (изопропиловый спирт), хч, по ТУ 6-09-402-75, ректифицированный

-

-

-

-

+

+

Уксусная кислота ледяная, хч, по ГОСТу 61-75

+

+

+

+

-

-

Хлороформ, медицинский, выдержанный над , ректифицированный

-

-

-

-

+

+

Хлористый метилен (дихлорметан), выдержанный над , ректифицированный

+

+

-

-

-

-

Эфир диэтиловый, выдержанный над NaOH, ректифицированный

-

+

-

-

-

-

Этилацетат (этиловый эфир уксусной кислоты), хч, по ГОСТу 22300-76, выдержанный над и ректифицированный

-

+

-

-

-

-

Сульфат натрия, безводный, хч, по ГОСТу 4166-76

+

+

+

+

-

-

Хлорид натрия, хч, по ГОСТу 4233-77

+

Вода дистиллированная

+

Экстрагент - 84% ацетонитрила в воде, 840 ацетонитрила доводятся до 1 литра водой либо получается путем ректифткации с водой водно-ацетонитрильной смеси (1:4)

+

33% бензола в ацетонитриле - смешать 30 бензола и 60 ацетонитрила (1:2)

+

+

+

+

-

-

20% ацетонитрила в бензоле - 20 ацетонитрила разбавить бензолом до 100

+

-

-

-

-

-

2% уксусной кислоты в бензоле - 2 уксусной кислоты разбавить бензолом до 100

-

-

+

-

-

-

5% уксусной кислоты в бензоле - 5 уксусной кислоты разбавить бензолом до 100

-

+

-

-

-

-

10% этилацетата в бензоле - 10 этилацетата разбавить бензолом до 100

-

+

-

+

-

-

25% гексана в эфире - 25 гексана разбавить диэтиловым эфиром до 100

-

+

-

-

-

-

10% ацетона в дихлорметане - 10 ацетона разбавить дихлорметаном до 100

-

+

-

-

-

-

20% ацетона в дихлорметане - 20 ацетона разбавить дихлорметаном до 100

-

-

-

-

+

-

5.2. Способ подготовки проб

 

Определяемые микотоксины извлекают экстрагентом из пробы при соотношении масса пробы - объем экстрагента 1:5. При определении афлатоксина и зеараленона проводят очистку водно-ацетонитрильного экстракта на патроне Диапак А-3, концентрируют микотоксины на патроне Диапак П-3, высушивают от остатков воды и после упаривания и перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак Н (Диапак С - в случае кукурузы и продуктов из нее). Фракционным элюированием получают две фракции, содержащие афлатоксин и зеараленон, готовые к хроматографическому анализу.

При определении дезоксиниваленола и Т-2 токсина, проводят предварительную очистку водно-ацетонитрильного экстракта на патроне Диапак АУ-3 и концентрируют упариванием досуха. После перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак Н. Фракционным элюированием получают две фракции, содержащие дезоксиниваленол и Т-2 токсин, готовые к хроматографическому анализу.

Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения микотоксинов проводят анализ пробы методом стандартной добавки в исходный экстракт. Основные характеристики пробоподготовки методом твердофазной экстракции приведены в табл. 2.

 

Основные характеристики подготовки проб

 

Таблица 2

 

Микотоксин

Время пробоподготовки, мин

Степень извлечения, %

Относительное среднее квадратическое отклонение, %

Афлатоксин

120

75

20

Зеараленон

120

70

20

Дезоксиниваленол

90

85

10

Т-2 токсин

90

85

10

 

Для достижения указанной степени извлечения необходимо точно выполнять требования к квалификации органических растворителей, их подготовке и приготовлению растворов, перечисленных в п. 5.1. Алгоритм поиска возможных потерь целевых микотоксинов при подготовке проб приведен в прилож. 1 к настоящим методическим указаниям.

5.3. Подготовка концентрирующих патронов

 

Патроны Диапак представляют собой пластиковую колонку, содержащую 1 или 3 герметично упакованного сорбента.

 

5.3.1. Концентрирующий патрон Диапак А-3

 

Вскрыть выходную линию патрона Диапак А-3, сняв полимерную заглушку. Установить патрон в вертикальном положении узким концом вниз в подходящее устройство для вакуумирования и сбора элюата. Осторожно открыть полимерную крышку патрона, сформировать ровный горизонтальный верхний слой сорбента легким постукиванием по патрону и зафиксировать его с помощью небольшого ватного тампона. Подключить вакуум к устройству для вакуумирования и обеспечить подачу вакуума к патрону.

Концентрирующий патрон Диапак А-3 одноразового применения и регенерации не подлежит.

5.3.2. Концентрирующий патрон Диапак АУ-3

 

Подготовка концентрирующего патрона Диапак АУ-3 проводится аналогично п. 5.3.1.

Концентрирующий патрон Диапак АУ-3 одноразового применения и регенерации не подлежит.

5.3.3. Концентрирующий патрон Диапак П-3

 

Установить патрон Диапак П-3 вертикально в подходящее устройство для вакуумирования и открыть верхнюю крышку. Суспендировать сорбент при перемешивании стеклянной палочкой в 10 бензола, дать отстояться сорбенту и пропустить при слабом вакууме, не допуская попадания воздуха на сорбент, последовательно по 10 бензола и ацетона.

Сохранив слой ацетона около 2 см, ввести пористый полимерный фильтр (имеется в комплекте) и уплотнить его палочкой по верхнему слою сорбента. Затем пропустить оставшийся ацетон и последовательно по 10 экстрагента и смеси экстрагент-вода (1:1), не допуская попадания воздуха на сорбент со скоростью 2-3 капли в секунду.

Сохранив слой последнего элюента около 2 см, отключить вакуум и заглушить патрон сначала верхней крышкой, а затем (после прекращения скапывания) и нижней заглушкой. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение рабочего дня, а при случайном пересыхании приводится в рабочее состояние прокачиванием 10 смеси экстрагент-вода (1:1).

Концентрирующий патрон Диапак П-3 многоразового применения и подлежит регенерации по схеме, как указано выше, после проведения пробоподготовки.

5.3.4. Концентрирующий патрон Диапак Н

 

Снять с патрона Диапак Н заглушки, пропустить через него с помощью шприца 5 бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25°С.

Концентрирующий патрон Диапак Н многоразового применения и подлежит регенерации по следующим схемам после проведения пробоподготовки:

- после подготовки пробы ДТ - последовательно пропустить через патрон по 5 этилового спирта, ацетона и бензола;

- после подготовки пробы АЗ - последовательно пропустить через патрон по 5 ацетона и бензола.

5.3.5. Концентрирующий патрон Диапак С

 

Снять с патрона Диапак С заглушки, пропустить через него с помощью шприца 5 бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25°С.

Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.

5.4. Экстракция микотоксинов

 

5.4.1. Зерно и зернопродукты

 

25 г размолотой пробы перенести в коническую колбу и залить 125 экстрагента. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. Экстракт отфильтровать через бумажный фильтр "синяя лента".

5.4.2. Орехи и семена масличных культур

 

25 г размолотой пробы перенести в колбу Эрленмейера, добавить 125 экстрагента и 40 гексана. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. После перемешивания внести в экстракт 1 г хлорида натрия и продолжить перемешивание в течение 5 мин. Отфильтровать через бумажный фильтр "синяя лента". Отфильтрованный экстракт перенести в делительную воронку и после расслоения раствора собрать нижний водно-ацетонитрильный слой. Ацетонитрильный экстракт обезжирить 25 гексана в делительной воронке вместимостью 250 .

Экстракт перенести в делительную воронку, добавить еще 25 гептана и интенсивно перемешать. После расслоения собрать нижний водно-ацетонитрильный экстракт.

5.4.3. Масло растительное

 

25 г масла перенести в колбу Эрленмейера, добавить 40 гексана и 125 экстрагента. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. После перемешивания в экстракт внести 0,2 г хлористого натрия и продолжить перемешивание в течение 3-5 мин. Экстракт перенести в делительную воронку и после расслоения смеси собрать нижний водно-ацетонитрильный слой. Ацетонитрильный экстракт обезжирить 25 гексана или гептана или петролейного эфира в делительной воронке вместимостью 250 .

Экстракт перенести в делительную воронку, добавить еще 25 гептана и интенсивно перемешать. После расслоения собрать нижний водно-ацетонитрильный экстракт.

5.5. Очистка и концентрирование проб

 

5.5.1. Очистка и концентрирование пробы при определении афлатоксина и зеараленона

 

5.5.1.1. Предварительная очистка и концентрирование пробы

 

25 обезжиренного экстракта пропустить через патрон Диапак А-3 со скоростью капли в секунду и отобрать 20 элюата.

Полученный элюат объемом 20 разбавить равным объемом воды. Полученный раствор пропустить через патрон Диапак П-3 со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего патрон промыть 5 воды и продуть воздухом в течение 1 мин.

Целевую фракцию элюировать с патрона Диапак П-3 последовательно 7 ацетонитрила и 7 33%-ного бензола в ацетонитриле - со скоростью 1-2 капли в секунду. Собранный элюат пропустить через слой безводного сульфата натрия (10 г) самотеком. Колбу ополоснуть 2 33%-ного бензола в ацетонитриле и содержимое перенести на тот же слой безводного сульфата натрия. Промыть сульфат натрия 3 33%-ного бензола в ацетонитриле. Высушенный фильтрат упарить до суха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С и немедленно перерастворить в 0,5 бензола.

5.5.1.2. Окончательная очистка на патроне Диапак Н (вариант 1)

 

Бензольный раствор нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак Н. Колбу, содержавшую сухой остаток, обмыть еще 2 раза по 0,5 бензола и последовательно нанести растворы на патрон Диапак Н. Все смывы с патрона отбросить.

Зеараленон элюировать с патрона Диапак Н 4 2%-ной уксусной кислоты в бензоле и упарить досуха (до исчезновения запаха уксусной кислоты) на ротационном испарителе при температуре не выше 50°С (Проба З). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.

Затем элюировать афлатоксин 5 20%-ного ацетонитрила в бензоле с патрона и упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40°С (Проба А). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ афлатоксина , , - 4 г.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ зеараленона, , - 4 г.

5.5.1.3. Окончательная очистка на патроне Диапак С (вариант 2)

 

Рекомендуется для кукурузы и продуктов из нее.

Бензольный раствор нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак С. Колбу, содержавшую сухой остаток, обмыть еще 2 раза по 0,5 бензола и нанести растворы на патрон Диапак С при достижении верхнего фильтра патрона уровнем предыдущей порции раствора. Все смывы с патрона отбросить.

Зеараленон элюировать с патрона Диапак С 6 10%-ного этилацетата в бензоле и упарить досуха (до исчезновения запаха бензола) на ротационном испарителе при температуре не выше 50°С (Проба 3). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.

Затем через патрон Диапак С последовательно пропустить 3 5%-ной уксусной кислоты в бензоле и 4 25%-ного гексана в эфире. Все элюаты отбросить. Афлатоксин элюировать с патрона 6 10%-ного ацетона в дихлорметане. Элюат упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40°С (Проба А). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ афлатоксина , , - 4 г.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ зеараленона, , - 4 г.

5.5.2. Очистка и концентрирование пробы при определении дезоксиниваленола и Т-2 токсина

 

5.5.2.1. Предварительная очистка и концентрирование пробы

 

20 экстракта пропустить через патрон Диапак АУ-3 со скоростью капли в секунду. Элюат собрать. Патрон промыть 5 экстрагента и отфильтровать объединенные элюаты в сердцевидную колбу, фильтр промыть 2 ацетонитрила, собирая промывочную жидкость в ту же колбу. Упарить досуха на ротационном испарителе при температуре около . Упаривание повторить 2-3 раза с добавлением в колбу пропанола-2 или ацетонитрила до исчезновения капель воды на стенках колбы (Проба ДТ).

5.5.2.2. Окончательная очистка на патроне Диапак Н

 

Пробу ДТ растворить в 0,5 хлороформа и нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак Н. Колбу обмыть еще 2 раза по 0,5 хлороформа и последовательно нанести растворы на тот же патрон, начав сбор фракций, содержащих Т-2 токсин, в отгонную колбу. Завершить элюирование Т-2 токсина 2 хлороформа в ту же колбу. Элюат упарить досуха на ротационном испарителе при температуре и перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению Т-2 токсина (Проба Т).

Дезоксиниваленол элюировать с патрона в другую отгонную колбу 6 20%-ного ацетона в хлороформе. Элюат упарить досуха на ротационном испарителе при температуре и перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению дезоксиниваленола (Проба Д).

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ дезоксиниваленола, , - 4 г.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ Т-2 токсина, , - 4 г.

6. Афлатоксин

 

6.1. Оборудование, материалы, реактивы

 

Испаритель ротационный ИР-1М2 или устройство для упаривания проб в токе азота при нагревании около 40°С

ТУ 25-1173.102-84 или др.

Центрифуга типа ЦЛН-2, или аналогичная

ТУ 5-375-4171-73

Устройство для создания вакуума около - 0,7 мм рт. ст. (водоструйный насос, масляный вакуумный насос, медицинский отсасыватель)

 

Вакуумное устройство для подготовки проб (вакуумный манифолд), с приемниками проб вместимостью не менее 10

 

Концентрирующий патрон Диапак С16М, ЗАО "БиоХимМак СТ"

ТУ 4215-002-05451931-94

Концентрирующий патрон Диапак С, ЗАО "БиоХимМак СТ"

ТУ 4215-002-05451931-94

Пинцет медицинский, 15 см

 

Шприц вместимостью 10 или 20 типа Луер

 

Колбы плоскодонные конические с пробками, вместимостью 50

ГОСТ 25336

Колбы остродонные с пробками, с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 10 или 25

ГОСТ 25336

Колбы грушевидные с пробками, с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 25

ГОСТ 25336

Цилиндры мерные вместимостью 50 , 2 кл., или пробирка градуированная вместимостью 15 или 20

ГОСТ 1770

Микрошприц вместимостью 100 или пипетка с делениями исполнения 4 или 5, 1-го класса точности вместимостью 1

ГОСТ 20292

ГАРАНТ:

Постановлением Госстандарта СССР от 27 декабря 1991 г. N 2234 взамен ГОСТ 20292-74 в части общих требований к градуированным пипеткам с 1 января 1994 г. введен ГОСТ 29227-91

Постановлением Госстандарта СССР от 29 декабря 1991 г. N 2344 взамен ГОСТ 20292-74 в части бюреток с временем ожидания с 1 января 1994 г. введен в действие ГОСТ 29253-91

Вата медицинская нестерилизованная, х/б

 

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ОП-3, осч, ректифицированный или Ацетонитрил, 1 сорт, кооператив "Криохром", г. Санкт-Петербург

ТУ 6-09-14-2167-84

Ацетон, осч, ОП-2, ректифицированный

ТУ 6-09-3513-75

Гептан, гексан, хч, или петролейный эфир (марки 70-100), ректифицированный

ТУ 6-09-3375-78

Кислота лимонная, 1-водная, чда

ГОСТ 3652-29

Хлорид натрия, хч

ГОСТ 4233-66

Хлороформ медицинский, выдержанный над , ректифицированный

 

Сульфат натрия, безводный, хч

ГОСТ 4166-76

Вода дистиллированная

 

 

20% ацетона в хлороформе - к 20 ацетона добавить хлороформ до 100 общего объема или 5% метанола в хлороформе - к 20 хлороформа добавить 5 метанола, объем раствора довести хлороформом до 100 .

6.2. Способ подготовки проб

 

Афлатоксин извлекают из пробы жидкого молока пропусканием ее через патрон Диапак С16М. Затем фракцию, содержащую афлатоксин , элюируют хлороформом с патрона и, после высушивания и упаривания, проводят окончательную очистку на патроне Диапак С. Подготовленная проба готова к хроматографическому анализу.

Афлатоксин из кисломолочных напитков и сметаны экстрагируют хлороформом в присутствии хлорида натрия и лимонной кислоты в соответствии с МУ N 4082-86*(1) и, после высушивания и упаривания, проводят окончательную очистку на патроне Диапак С.

Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения микотоксинов проводят анализ методом стандартной добавки в исходный экстракт.

Время проведения пробоподготовки - 60 мин. Степень извлечения*(2) - 80%. Относительное среднее квадратическое отклонение - 10%.

6.3. Подготовка концентрирующих патронов

 

6.3.1. Концентрирующий патрон Диапак С16М

 

Снять с патрона Диапак С16М заглушки и пропустить через него с помощью шприца последовательно по 5 ацетонитрила и воды. За глушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25°С.

Концентрирующий патрон Диапак С16М одноразового применения и регенерации не подлежит.

6.3.2. Концентрирующий патрон Диапак С

 

Снять с патрона Диапак С заглушки и пропустить через него с помощью шприца 5 бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25°С.

Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.

6.4. Подготовка проб молочных продуктов к анализу

 

6.4.1. Подготовка, концентрирование и очистка проб молока

 

Пробу молока 50 центрифугировать на подходящем оборудовании в течение 5 мин при 1000 об./мин. Для определения афлатоксина отобрать 20 супернатанта, избегая попадания жира.

Сухое молоко растворяется в соответствии с инструкцией или соответствующим ТУ и обрабатывается, как описано выше.

20 подогретой до 40°С подготовленной пробы молока пропустить через предварительно подготовленный патрон Диапак С16М со скоростью 3 капли в секунду. Затем патрон промыть 5 дистиллированной воды и высушить продуванием воздуха в течение 1 мин. Элюаты отбросить. Патрон промыть 10 гексана и вновь высушить воздухом в течение 1 мин.

Афлатоксин элюировать 6 хлороформа. Собранный элюат пропустить самотеком через слой безводного сульфата натрия (3 ). Колбу обмыть 1 хлороформа и содержимое перенести на тот же слой безводного сульфата натрия. Хлороформные растворы собрать (Экстракт М).

6.4.2. Подготовка проб сметаны и кисломолочных продуктов

 

В коническую колбу вместимостью 250 помещают навеску 20,0 г сметаны или 40 кисломолочного напитка. Затем туда же вносят 10,0 водного раствора 2 г хлорида натрия и 0,24 г лимонной кислоты и 100 хлороформа (все составные части предварительно подогревают до температуры ). Содержимое колбы встряхивают мин, переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют 15 мин при об./мин. Отделяют нижний хлороформный слой, высушивают над 10 г безводного сульфата натрия, отфильтровывают, измеряют объем фильтрата () и упаривают до (Экстракт М).

6.5. Окончательная очистка пробы

 

Экстракт М нанести на патрон Диапак С со скоростью капли в секунду. Промыть сульфат натрия 1 хлороформа и раствор нанести на патрон Диапак С при достижении верхнего фильтра патрона уровнем предыдущей порции раствора.

Афлатоксин элюировать с патрона 10 20%-ного ацетона в хлороформе или 7 5%-ного метанола в хлороформе. Элюат собрать и упарить досуха на ротационном испарителе или в слабом токе азота при температуре не выше 40°С. Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению (Проба М).

Эквивалент массы пробы молока, взятой на анализ афлатоксина , , - 20 г.

Эквивалент массы пробы сухого молока рассчитывается по формуле:

 

, где (6.1)

 

- эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;

m - масса пробы сухого молока, г;

V - объем воды для растворения пробы сухого молока, .

Эквивалент массы пробы сметаны или кисломолочных напитков, взятой на анализ, рассчитывается по формуле:

 

, где (6.2)

 

- эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;

- объем фильтрата, ;

- масса (объем) пробы сметаны или кисломолочных напитков, г ().

7. Патулин

 

7.1. Оборудование, материалы, реактивы

 

Испаритель ротационный ИР-1М2

ТУ 25-1173.102-84 или др.

Центрифуга типа ЦЛН-2, или аналогичная

ТУ 5-375-4171-73

Устройство для создания вакуума около - 0,7 мм рт. ст. (водоструйный насос, масляный вакуумный насос, медицинский отсасыватель)

Вакуумное устройство для подготовки проб (вакуумный манифолд), с приемниками проб вместимостью не менее 10

 

Устройство для упаривания проб в токе азота при нагревании около 40°С (желательно суховоздушная баня)

 

Концентрирующий патрон Диапак П-3, ЗАО "БиоХимМак СТ"

ТУ 4215-002-05451931-94

Концентрирующий патрон Диапак С, ЗАО "БиоХимМак СТ"

ТУ 4215-002-05451931-94

Пинцет медицинский, 15 см

 

Колбы плоскодонные конические с пробками вместимостью 50

ГОСТ 25336

Колбы остродонные с пробками с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 5, 10 или 25

ГОСТ 25336

Колбы грушевидные с пробками с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 25

ГОСТ 25336

Пробирка градуированная вместимостью 15 или 20

ГОСТ 1770

Цилиндры мерные вместимостью 10 и 50 , 2 кл.

ГОСТ 1770

Микрошприц вместимостью 100 (или пипетка с делениями исполнения 4 или 5, 1-го класса точности вместимостью 1 )

ГОСТ 20292

Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ

 

Вата медицинская нестерилизованная, х/б

 

Ацетат цинка 2-водный, чда

ГОСТ 5823

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ОП-3 осч, ректифицированный

ТУ 6-09-14-2167-84

Ацетон, осч, ректифицированный, ОП-2

ТУ 6-09-3513-75

Бензол, хч, ректифицированный

ГОСТ 5955-75

Гексацианоферрат II калия (калий железистосинеродистый) 3-водный, хч

ГОСТ 4207

Гептан, гексан, хч, или петролейный эфир (фракция 70-100), хч, ректифицированный

ТУ 6-09-3375-78

Хлороформ, медицинский, выдержанный над , ректифицированный

 

Этилацетат (этиловый эфир уксусной кислоты), хч, выдержанный над и ректифицированный

ГОСТ 22300-76

Карбонат натрия, хч

ГОСТ 83-79

Сульфат натрия, безводный, хч

ГОСТ 4166-76

Вода бидистиллированная

 

 

1,5% карбоната натрия - 1,5 г карбоната натрия растворить в 100 воды.

15% этилацетата в бензоле - 15 этилацетата разбавить бензолом до 100 .

30% этилацетата в бензоле - 30 этилацетата разбавить бензолом до 100 .

Раствор Карреза I - 15,0 г гексацианоферрата II калия растворить в 100 воды.

Раствор Карреза II - 30,0 г ацетата цинка растворить в 100 воды.

7.2. Способ подготовки проб

 

Микотоксин патулин извлекают из проб осветленных соков и напитков пропусканием их через патрон Диапак П-3. Затем патулин элюирут этилацетатом с патрона и после обработки раствором , высушивания, упаривания и перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак С.

Соки и напитки с мякотью и консистентные продукты разводят водой, осветляют растворами Карреза в соответствии с ГОСТом 28038-89*(3), фильтруют и экстрагируют патулин пропусканием фильтрата через патрон Диапак П-3. Затем патулин элюирут этилацетатом с патрона и после обработки раствором , высушивания, упаривания и перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак С.

Подготовленные пробы готовы к хроматографическому анализу.

Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения патулина проводят анализ методом стандартной добавки в пробу.

Время проведения пробоподготовки - 90 мин. Степень извлечения*(4) - 60%. Относительное среднее квадратическое отклонение - 10%.

7.3. Подготовка концентрирующих патронов

 

7.3.1. Концентрирующий патрон Диапак П-3

 

Установить патрон Диапак П-3 вертикально в подходящее устройство для вакуумирования и открыть верхнюю крышку. Суспендировать сорбент при перемешивании стеклянной палочкой в 10 бензола, дать отстояться сорбенту и пропустить при слабом вакууме, не допуская попадания воздуха, последовательно по 10 бензола и ацетона.

Сохранив слой ацетона около 2 см, ввести пористый полимерный фильтр (имеется в комплекте) и уплотнить его палочкой по верхнему слою сорбента. Затем пропустить оставшийся ацетон и последовательно по 10 экстрагента (см. п. 5.1) и смеси экстрагент-вода (1:1), не допуская попадания воздуха на сорбент со скоростью 2-3 капли в секунду.

Сохранив слой последнего элюента около 2 см, отключить вакуум и заглушить патрон сначала верхней крышкой, а затем (после прекращения скапывания) и нижней заглушкой. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение рабочего дня, а при случайном пересыхании приводится в рабочее состояние прокачиванием 10 смеси экстрагент-вода (1:1).

Перед проведением пробоподготовки через патрон Диапак П-3 пропустить 10 воды.

Концентрирующий патрон Диапак П-3 многоразового применения и подлежит регенерации после проведения пробоподготовки по схеме его подготовки, как указано выше.

7.3.2. Концентрирующий патрон Диапак С

 

Снять с патрона Диапак С заглушки и пропустить через него с помощью шприца 5 бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25°С.

Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.

7.4. Подготовка проб к анализу

 

7.4.1. Подготовка осветленных соков и напитков

 

Отфильтровать пробу через плотный бумажный фильтр до получения 20 фильтрата (Фильтрат П).

7.4.2. Подготовка соков и напитков с мякотью и консистентных продуктов

 

Навеску пробы массой 10,0 г поместить в стеклянный стакан, смешать с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 . В мерную колбу внести 6,0 раствора Карреза I и 6,0 раствора Карреза II. Содержание колбы довести дистиллированной водой до метки, тщательно перемешать и отфильтровать в мерный цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Измерить объем фильтрата (Фильтрат П).

7.5. Концентрирование и очистка пробы

 

7.5.1. Концентрирование пробы на патроне Диапак П-3

 

Весь объем Фильтрата П нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак П-3 со скоростью 1-2 капли в секунду. Промыть патрон 5 бидистиллированной воды. Все смывы отбросить.

Патулин элюировать с патрона 10 этилацетата в колбу или мерную пробирку с пришлифованной пробкой, содержащую 5 1,5%-ного карбоната натрия, закрыть пробкой, интенсивно перемешать и дать отстояться. Декантировать верхний этилацетатный слой, высушить его безводным сульфатом натрия (3 г) и перенести в колбу для упаривания. В колбу или пробирку, содержащую оставшийся 1,5%-ный карбонат натрия, добавить еще 10 этилацетата, перемешать и, после полного расслоения, высушивания этилацетатного слоя тем же сульфатом натрия, объединить его с первой порцией этилацетатного раствора в той же колбе для упаривания. Операцию повторить с 5 этилацетата.

Упарить этилацетатный раствор на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С до объема около 0,5 (не упаривать досуха!). Количественно перенести пробу в сердцевидную колбу вместимостью не более 5 или в полимерную пробирку типа Эппендорф, промыв предыдущую отгонную колбу 0,5 этилацетата, и присоединить к упариваемой пробе. Пробу упарить в токе азота при температуре не более 40°С в суховоздушной бане до 0,5 и добавить к ней 2,5 бензола.

7.5.2. Окончательная очистка пробы на патроне Диапак С

 

Бензолэтилацетатный раствор пропустить через патрон Диапак С со скоростью капли в секунду. Обмыть колбу еще 15%-ного этилацетата в бензоле и нанести на патрон. Все смывы отбросить.

Патулин элюировать с патрона 6 30%-ного этилацетата в бензоле, собирая элюат в сердцевидную отгонную колбу. Элюат упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40°С в суховоздушной бане.

Внимание! После упаривания пробу немедленно перерастворить в 100 мкл хлороформа, охлажденного до (для ТСХ-анализа) или в мкл охлажденной до бидистиллированной воды, подкисленной до рН 4,0 уксусной кислотой (для ВЭЖХ-анализа) и быстро охладить до (Проба П). Хранить Пробу П в холодильнике не более 1 ч.

Эквивалент массы пробы осветленных соков и напитков, взятой на анализ, - 20 г, соков и напитков с мякотью и консистентных продуктов определяется по формуле:

 

, где (7.1)

 

- эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;

- объем Фракции П, ;

- масса пробы соков и напитков с мякотью или консистентных продуктов, г.

______________________________

*(1) Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов и продовольственном сырье и пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Утв. МЗ СССР 20.03.86 N 4082-86.

*(2) При снижении степени извлечения афлатоксина см. прилож. 1.

*(3) Продукты переработки плодов и овощей. Метод определения митоксина патулина. ГОСТ 28038-89.

*(4) При снижении степени извлечения патулина см. прилож. 1.

 

 

Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

 

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Получить доступ к системе ГАРАНТ

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Методические указания (МУК 4.1.787-99) устанавливают способы подготовки проб продовольственного сырья и пищевых продуктов методом твердофазной экстракции для последующего хроматографического анализа микотоксинов.

Документ предназначен для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции учреждениями госсанэпидслужбы России, а также для предприятий и учреждений, осуществляющих контроль качества и исследования продовольственного сырья и продуктов питания.

Приведены средства измерений, испытательное оборудование, вспомогательные устройства, реактивы и материалы. Установлены требования безопасности при выполнении измерений, а также к квалификации операторов.

Методические указания вводятся в действие 1 января 2000 г.


Методические указания МУК 4.1.787-99 "Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 23 октября 1999 г.)


Текст методических указаний приводится по официальному изданию Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России (Москва, 1999)


Дата введения: 1 января 2000 г.


1. Разработаны Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Скачков В.Б., Брагина И.В., Королева Н.В.) и ЗАО "БиоХимМак СТ" (ведущий научный сотрудник Васияров Г.Г., старший научный сотрудник Алексеева Г.С., старший научный сотрудник Осокин Д.М., доктор химических наук Староверов С.М).


2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 23 октября 1999 г.


3. Введены впервые