Методические указания МУК 4.1.3231-14 "Измерение массовых концентраций N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в моче методом капиллярной газовой хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 19 декабря 2014 г.)

Методические указания МУК 4.1.3231-14
"Измерение массовых концентраций N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в моче методом капиллярной газовой хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 19 декабря 2014 г.)

Свидетельство о метрологической аттестации N 88-16374-241-01.00076-2012 от 26.11.2013.

1. Назначение и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газовой хроматографии для измерения массовой концентрации N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробах мочи в диапазоне концентраций для N-нитрозодиметиламина от 0,02 до 0,6 и для N-нитрозодиэтиламина от 0,01 до 0,6 .

1.2. Методические указания по измерению массовой концентрации N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробах мочи предназначены для использования в санитарно-гигиенических, экологических, лечебных и научных организациях, осуществляющих деятельность в области профпатологии и экологии человека.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Физико-химические и токсикологические свойства

N-нитрозоамины малоустойчивые вещества, стабильны только при температурах ниже 0°С, являются жидкими или твёрдыми веществами жёлтого цвета.

N-нитрозоамины являются высокотоксичными соединениями. При попадании в организм поражают печень, вызывают кровоизлияния. Большая часть N-нитрозосоединений обладает сильным канцерогенным действием даже при однократном действии, проявляют мутагенные свойства.

N-нитрозодиметиламин
CAS	62-75-9
формула
молекулярная масса	148,0
	153
Давление паров, Па при 20°С	360
Класс опасности	1
N-нитрозодиэтиламин
CAS	55-18-5
формула
молекулярная масса	176,0
	175
Растворимость в воде, г/100 мл при 20°С	10,6
Класс опасности	1

3. Метрологические характеристики методики выполнения измерений

При соблюдении всех регламентированных условий и проведения анализа в точном соответствии с данной методикой значения погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышают значений, приведённых в табл. 1.

Таблица 1

Диапазон измерений, значения точности (правильности и прецизионности) методики

Объект измерения	Диапазон измерений массовых концентраций,	Показатель точности (границы относительной погрешности при вероятности Р = 0,95), , %	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), , %	Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории), r, %
	N-нитрозодиметиламин
Моча	от 0,02 до 0,1 вкл.	38	12	19	34
	от 0,1 до 0,6 вкл.	22	4	11	11
	N-нитрозодиэтиламин
Моча	от 0,01 до 0,1 вкл.	36	12	18	34
	от 0,1 до 0,6 вкл.	22	4	11	11

Значения показателя точности используют при:

· оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

· оценке деятельности лабораторий на качество проведения измерений;

· оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

4. Метод измерения

Выполнение измерений массовой концентрации N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробе мочи проводят методом капиллярной газовой хроматографии с термоионным детектором. Извлечение и концентрирование N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) из проб мочи проводят методом анализа равновесной паровой фазы путем нагревания объекта.

Определению не мешают углеводороды, спирты. Длительность измерений - 30 мин.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

5.1. Средства измерений

Хроматограф газовый с термоионным детектором и капиллярной колонкой
Термометр жидкостной стеклянный	ГОСТ 28498
Секундомер 60-минутный счетчик с ценой деления 0,2 мин (диапазон рабочих температур от -20°С до +40°С)	ТУ 25-1894.003-90
Микрошприцы, диапазон дозируемого объема 1-10 мкл с ценой деления 0,2 мкл, погрешность 1%	ТУ 2.833.106-2000
Весы лабораторные равноплечие второго класса точности, наибольший предел взвешивания 200 г, диапазон взвешивания по шкале мг от 0 до 100 мг, цена деления делительного устройства - 0,05 мг. Погрешность взвешивания по шкале мг мг	ГОСТ Р 53228-08
Меры массы	ГОСТ 7328-01
Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные 1-го класса точности вместимостью 1-2-1-1, 1-2-1-2, 1-2-2-5	ГОСТ 29227-91
Мерный стакан вместимостью 1	ГОСТ 23932-90
Дозаторы жидкости механические с погрешностью объемом дозирования 1-5 , 100-1 000 , 20-200 с одноразовыми наконечниками	ГОСТ 28311-89

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Реактивы

Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная)	ГОСТ 52501-05
Калий двухромовокислый, чда	ГОСТ 4220-75
Серная кислота концентрированная, осч, безводная	ГОСТ 4166-78
Сульфат натрия кристаллизационный	ГОСТ 21458-75
N-нитрозодиметиламин	ГСО 7881-01
N-нитрозодиэтиламин	ГСО 7882-01

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

5.3. Вспомогательные устройства и материалы

Колонка хроматографическая капиллярная из кварцевого стекла с внутренним диаметром 0,32 мм длиной 30 м и толщиной пленки 1,8 мкм
Дозатор равновесного пара, давление равновесного пара в контейнере от 0,01 до 0,25 МПа, объем дозируемой петли 2 мл, температура термостата от 50 до 150°С, относительное среднее квадратическое отклонение выходного сигнала не более 3%	ГОСТ 15150-69
Редуктор кислородный	ТУ 3645-032-00220531-97
Сушильный шкаф, обеспечивающий нагрев до 150°С с погрешностью	ТУ 16.531.743-83
Азот газообразный	ГОСТ 9293-74
Водород технический	ГОСТ 3022-80
Бумага фильтровальная лабораторная	ГОСТ 12026-76
Пробирки из полипропилена конические градуированные на 15 ТС 15А

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств и материалов аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают указанным.

6. Требования безопасности и охраны окружающей среды

6.1. При выполнении работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

6.3. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. При работе с сосудами, работающими под давлением необходимо соблюдать правила их устройства и безопасной эксплуатации в соответствии с ПБ 03-576-03.

6.5. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005-88, ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

6.6. Организуют обучение работающих безопасности труда по ГОСТ 12.0.004-90.

6.7. При работе с биологическими средами соблюдают санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения работ на газовом хроматографе.

8. Условия измерений

При выполнении измерений в лаборатории соблюдают следующие условия:

- температура окружающего воздуха ;

- атмосферное давление от 84,0 до 106,7 кПа (630-800 мм рт. ст.);

- относительная влажность воздуха от 30 до 80%;

- напряжение в сети В;

- частота переменного тока Гц.

Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерений

При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы:

- подготовка стеклянной посуды;

- подготовка хроматографической системы;

- приготовление растворов для градуировки;

- построение градуировочной характеристики;

- отбор проб.

9.1. Подготовка посуды

В термостойкий стакан вместимостью 1 помещают 25 г калия двухромовокислого, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 концентрированной серной кислоты.

Используемую посуду необходимо замочить в свежеприготовленном 3%-м растворе калия двухромовокислого в серной кислоте, промыть проточной водопроводной водой, ополоснуть дистиллированной водой и высушить в сушильном шкафу при температуре 105°С.

9.2. Подготовка хроматографической системы

Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации хроматографа.

9.2.1. Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку перед эксплуатацией устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (азота) с расходом 4 при температуре 240°С в течение 2 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору и проверяют стабильность нулевой линии при рабочей температуре термостата колонок. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

9.2.2. Условия хроматографирования

Устанавливают режим работы газового хроматографа в соответствии со следующими условиями:

- температурный режим термостата колонки: 50°С, подъём со скоростью 10°С/мин до 200°С;

- режим испарителя: температура 200°С; деление потока: 1:14,3;

- режим детектора: температура 320°С;

- режим расхода газа-носителя (азота): 20 ;

- время удерживания:

- N-нитрозодиметиламин: мин;

- N-нитрозодиэтиламин: мин.

Записывают нулевую линию при установленных режимных параметрах. При отсутствии флуктуаций приступают к работе.

9.3. Приготовление растворов для градуировки

9.3.1. Приготовление исходного раствора

В мерную пробирку объемом 10 дозатором добавляют бидистиллированную воду в объеме 10 , вводят микрошприцем по 2 N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) и тщательно перемешивают. Весовое содержание компонентов в исходном растворе составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества): N-нитрозодиметиламин - 0,2 , N-нитрозодиэтиламин - 0,19 . Срок хранения раствора 12 ч.

9.3.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы N-нитрозоаминов готовят в мерных пробирках объемом 10 . Для этого в каждую пробирку дозатором вносят по 10 бидистиллированной воды и добавляют исходный раствор для градуировки в соответствии с табл. 2, добавляют 8 г сульфата натрия кристаллизационного и тщательно перемешивают.

Таблица 2

Растворы для установления градуировочной характеристики

Градуировочный раствор	1	2	3	4	5	6	7
Объем исходного раствора,	0,25	0,5	1	2	5	10	15
Массовая концентрация N-нитрозодиметиламина,	-	0,02	0,04	0,08	0,2	0,4	0,6
Массовая концентрация N-нитрозодиэтиламина,	0,0095	0,019	0,038	0,076	0,19	0,38	0,57

9.4. Построение градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади хроматографического пика от массовой концентрации N-нитрозоаминов в моче, устанавливают по 7 сериям измерений по 5 концентрациям каждого вещества в каждой серии для каждого диапазона в соответствии с табл. 2.

Во флакон из-под пенициллина помещают по 5 образца мочи (N-нитрозоамины в исходной пробе мочи отсутствуют), добавляют градуировочный раствор (табл. 2) и 8 г сульфата натрия кристаллизационного, флакон закрывают резиновой пробкой, зажимают алюминиевым колпачком и ставят в термостат дозатора равновесного пара (ДРП). По истечении 20 мин термостатирования вещества, находящиеся в равновесной паровой фазе, переносятся из флакона в дозирующую петлю крана-дозатора и затем через испаритель попадают в хроматографическую колонку.

Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора. На полученной хроматограмме вычисляют площади пиков определяемого компонента и по средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику.

Градуировку проводят 1 раз в месяц и при смене реактивов.

9.5. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация N-нитрозоаминов соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

, где (1)

С - заданная массовая концентрация N-нитрозоаминов в градуировочном растворе;

- результат измерения массовой концентрации N-нитрозоаминов в образце для градуировки.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

9.6. Отбор проб

Отбор проб мочи объемом не менее 10 производят в чистый сухой флакон. Анализ мочи необходимо проводить сразу или хранить в холодильнике не более 12 ч после отбора пробы.

10. Выполнение измерений

В два флакона из-под пенициллина помещают по 5 мочи и добавляют по 8 г сульфата натрия кристаллизационного, флакон закрывают резиновой пробкой, зажимают алюминиевым колпачком и ставят в термостат дозатора равновесного пара (ДРП). По истечении 20 мин термостатирования вещества, находящиеся в равновесной паровой фазе, переносятся из флакона в дозирующую петлю крана-дозатора и затем через испаритель попадают в хроматографическую колонку. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб мочи. Условия выполнения измерений аналогичны условиям при установлении градуировочной характеристики (п. 9.2.2).

11. Обработка результатов измерений

11.1. На хроматограмме рассчитывают площадь пика и по градуировочной характеристике определяют массовую концентрацию N-нитрозоаминов в моче.

11.2. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости , (параллельных определений), для которых выполняется условие:

, где (2)

r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в табл. 3.

При невыполнении условия (1) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений (, , , ), полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

, где (3)

- критический диапазон. Значения критического диапазона приведены в табл. 4;

- наибольший результат измерений, полученный в условиях повторяемости;

- наименьший результат измерений, полученный в условиях повторяемости.

При невыполнении условия (3) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условий (2) и (3).

Таблица 3

Значения пределов повторяемости, воспроизводимости и критического диапазона при доверительной вероятности Р = 0,95

Диапазон измерений,	Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории в условиях повторяемости), r, %	Критический диапазон (относительное значение допускаемого расхождения между наибольшим и наименьшим из четырех результатов измерений, полученных в одной лаборатории в условиях повторяемости), , %	Предел воспроизводимости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях), R, %
N-нитрозодиметиламин
От 0,02 до 0,1 вкл.	34	43	53
Св. 0,1 до 0,6 вкл.	11	14	31
N-нитрозодиэтиламин
От 0,01 до 0,1 вкл.	34	43	50
Св. 0,1 до 0,6 вкл.	11	14	31

12. Оформление результатов измерений

Результат измерений представляют в виде , где

 - результат измерений, полученный в соответствии с процедурами раздела 9.4, ;

- характеристика погрешности, при Р = 0,95, значение рассчитывают по формуле: , где значение - относительное значение характеристики погрешности измерений массовой концентрации N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина, % (табл. 1).

13. Контроль качества результатов измерений

13.1. Достоверность измерений в пределах лаборатории обеспечивают путем проведения проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях повторяемости, промежуточной прецизионности, воспроизводимости, оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6.

13.2. Проверка приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности, являются образцы мочи с внесенными в них добавками аттестованных растворов N-нитрозоаминов, подготовленных в соответствии с п. 9.3.2.

Проверку приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности (в пределах одной лаборатории, разными операторами, в разное время), проводят по результатам измерений массовых концентраций N-нитрозоаминов в образцах мочи с одинаковым содержанием N-нитрозоаминов.

Результаты измерений признают приемлемыми при выполнении условия:

, где (4)

и - результаты измерений массовых концентраций N-нитрозоаминов, полученные в условиях внутрилабораторной прецизионности, т.е. в одной лаборатории в разное время, разными операторами;

- предел внутрилабораторной прецизионности, значения предела внутрилабораторной прецизионности при доверительной вероятности Р = 0,95 приведены в табл. 4.

Таблица 4

Диапазон измерений,	Предел внутрилабораторной прецизионности (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории в разное время, разными операторами), , %
N-нитрозодиметиламин
От 0,02 до 0,1 вкл.	48
Св. 0,1 до 0,6 вкл.	25
N-нитрозодиэтиламин
От 0,01 до 0,1 вкл.	28
Св. 0,1 до 0,6 вкл.	17

Если условие (4) не выполняется, процедуру повторяют. При повторном превышении предела повторяемости выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок.

Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры рассчитывают по формуле:

, где (5)

- результат измерений массовой концентрации N-нитрозоамина в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2);

- результат измерений массовой концентрации N-нитрозоамина в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2);

- величина добавки.

В качестве добавки используют растворы N-нитрозоамина, приготовленные по п. 9.3.2.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

, где (6)

, - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации N-нитрозоамина в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения: с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:

(7)

При невыполнении условия (7) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (7) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.4. Оперативный контроль процедуры измерений, а также реализуемые процедуры контроля стабильности результатов выполняемых измерений приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова