Межгосударственный стандарт ГОСТ 32073-2013 "Продукты пищевые. Методы идентификации и определения массовой доли синтетических красителей в алкогольной продукции" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 июля 2013 г. N 467-ст)

Food products. Methods for identification and determination of artificial colours mass fraction in alcoholic production

Дата введения - 1 января 2014 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Разработан Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии), Федеральным государственным бюджетным учреждением "Научно-исследовательский институт питания" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ питания" РАМН)

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 154)

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 марта 2013 г. N 55-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Казахстан	KZ	Госстандарт Республики Казахстан
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Молдова-Стандарт
Россия	RU	Росстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 июля 2013 г. N 467-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32073-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2014 г.

5 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на алкогольную продукцию (за исключением пива) и устанавливает:

- хроматографический метод качественного определения (идентификации) синтетических красителей (далее - красители) в тонком слое сорбента при содержании красителей не менее 0,001%;

- денситометрический метод определения массовой доли красителей в тонком слое сорбента (диапазон измеряемых массовых долей красителей от 0,0012% до 0,0250%);

- спектрофотометрический метод определения массовой доли красителей (диапазон измеряемых массовых долей красителей от 0,0004% до 0,0015%);

- метод зонального капиллярного электрофореза (диапазон измеряемых концентраций с учетом разбавления от 0,001 до 0,100 ).

При возникновении разногласий применяют денситометрический метод количественного определения красителей в тонком слое сорбента. Предварительное разделение красителей следует проводить с использованием хроматографического метода качественного определения (идентификации) красителей в тонком слое сорбента (см. раздел 5).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.2.007.0-75 Система стандартов безопасности труда. Изделия электротехнические. Общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 12.4.103-83 Система стандартов безопасности труда. Одежда специальная защитная, средства индивидуальной защиты ног и рук. Классификация

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 83-79 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-73, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3760-79 Реактивы. Аммиак водный. Технические условия

ГОСТ 3769-78 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия

ГОСТ 3956-76 Силикагель технический. Технические условия

ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе

ГОСТ 4828-83 Изделия ликероводочные. Правила приемки и методы испытаний

ГОСТ 5363-93 Водка. Правила приемки и методы анализа

ГОСТ ИСО 5725-2-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений*

ГОСТ 5830-79 Реактивы. Спирт изоамиловый. Технические условия

ГОСТ 6016-77 Реактивы. Спирт изобутиловый. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 9875-88 Диэтиламин технический. Технические условия

ГОСТ 13647-78 Реактивы. Пиридин. Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 21241-89 (СТ СЭВ 5204-85) Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31730-2012 Продукция винодельческая. Правила приемки и методы отбора проб

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Отбор проб

3.1 Отбор проб ликероводочных изделий - по ГОСТ 4828.

3.2 Отбор проб продукции винодельческой промышленности - по ГОСТ 31730.

3.3 Отбор проб водки - по ГОСТ 5363.

4 Требования безопасности

4.1 При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007 и ГОСТ 12.4.103.

4.2 Помещение, в котором проводят анализы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021.

4.3 Электробезопасность при работе с электроустановками - по ГОСТ 12.2.007.0 и по ГОСТ 12.1.019.

4.4 Организация обучения работающих безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

4.5 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4.6 Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

5 Хроматографический метод качественного определения (идентификации) красителей в тонком слое сорбента

Метод распространяется на алкогольную продукцию и предназначен для установления состава красителей, перечень которых приведен в таблице 1 (см. 5.6.1).

5.1 Сущность метода

Метод основан на сорбции из анализируемой алкогольной продукции твердыми сорбентами, десорбции аммиаком, удалении последнего выпариванием и последующей идентификации красителей хроматографированием в тонком слое сорбента (ТСХ).

Идентификацию проводят методом сравнения значений [отношение расстояния миграции пятна анализируемого красителя до линии старта к расстоянию миграции границы элюента (проявителя) до линии старта] каждого красителя многокомпонентной анализируемой смеси со значениями контрольных красителей (КО).

В качестве КО используют водные растворы стандартных красителей из числа ожидаемых. Массовая доля анализируемого красителя должна находиться внутри диапазона наименьшей и наибольшей массовых долей КО стандартных красителей (диапазон измерения).

5.2 Условия проведения анализа

При подготовке и проведении измерения должны быть соблюдены следующие условия:

    - атмосферное давление ...................... от 84,0 до 106,7 кПа

                                                  (от 630 до 800 мм рт. ст.);

    - температура окружающего воздуха ........... от 10°С до 35°С;

    - относительная влажность воздуха ........... от 40% до 95%;

    - напряжение в электросети ..................  В;

    - частота тока в электросети ................ от 49 до 51 Гц.

Помещение, где проводят работы с реактивами, должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

Все операции с реактивами следует проводить в вытяжном шкафу.

5.3 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

5.3.1 Весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт, со значением среднего квадратического отклонения (СКО), не превышающим 0,03 мг, и с погрешностью от нелинейности не более 0,06 мг.

5.3.2 Весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт, с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более 0,1 г.

5.3.3 Весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт, со значением среднего квадратического отклонения (СКО), не превышающим 0,3 мг, и погрешностью от нелинейности не более 0,6 мг.

5.3.4 Патрон для твердофазной экстракции с сорбентом оксидом алюминия.

5.3.5 Пластина для тонкослойной хроматографии с силикагелем на полимерной подложке размерами 1010 см.

5.3.6 Камера хроматографическая размерами 202010 или 12125 см.

5.3.7 Шприц медицинский инъекционный вместимостью 10 - 20 .

5.3.8 Микрошприц вместимостью 1,0  (0,001 ), ценой деления не более 0,02 .

5.3.9 Пипетки по ГОСТ 29169 с одной меткой, вместимостью 1, 5, 25, 50  1-го класса точности.

5.3.10 Пипетки градуированные по ГОСТ 29227 вместимостью 5, 10  1-го класса точности.

5.3.11 Стаканы термостойкие по ГОСТ 25336 вместимостью 50, 200, 400 .

5.3.12 Колбы мерные с пришлифованной пробкой вместимостью 10, 50, 100, 500  1-го класса точности по ГОСТ 1770.

5.3.13 Колбы конические термостойкие вместимостью 50, 250  1-го класса точности по ГОСТ 25336.

5.3.14 Пробки стеклянные с конусом 29/32 по ГОСТ 1770.

5.3.15 Стаканчик СВ-14/8 по ГОСТ 25336.

5.3.16 Чашка выпарная круглодонная вместимостью 100  по ГОСТ 25336.

5.3.17 Колонка хроматографическая стеклянная диаметром 10 мм, длиной 10 см.

5.3.18 Палочка стеклянная с оплавленным концом.

5.3.19 Термостат или водяная баня.

5.3.20 Сушильный шкаф с диапазоном температур в рабочей камере от 40°С до 200°С и основной погрешностью стабилизации температуры 1°С.

5.3.21 Эксикатор по ГОСТ 25336.

5.3.22 Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.

5.3.23 Линейка металлическая по ГОСТ 427.

5.3.24 Ножницы.

5.3.25 Пинцет медицинский по ГОСТ 21241.

5.3.26 Красители стандартные в соответствии с приложением А, за исключением стандартного красителя Коричневый НТ

5.3.27 Пиридин по ГОСТ 13647, ч. д. а.

5.3.28 Кислота уксусная по ГОСТ 61, х. ч., ледяная, раствор массовой концентрации 10 готовят по ГОСТ 4517.

5.3.29 Спирт этиловый ректификованный технический высшего сорта по ГОСТ 18300.

5.3.30 Спирт изоамиловый по ГОСТ 5830, ч.д.а.

5.3.31 Спирт изобутиловый по ГОСТ 6016, ч.д.а.

5.3.32 Аммиак водный по ГОСТ 3760, ч.д.а., раствор массовой концентрации 250 .

5.3.33 Алюминия оксид активированный кислый рН = 4,50,5, зернением от 0,05 до 0,15 мм, удельной поверхностью 155  для колоночной хроматографии.

5.3.34 Метанол по ГОСТ 6995.

5.3.35 Силикагель марки КСМГ высшего или 1-го сорта по ГОСТ 3956.

5.3.36 Целлюлоза микрокристаллическая для хроматографии.

5.3.37 Сульфат аммония по ГОСТ 3769, раствор массовой концентрации 250 .

5.3.38 Диэтиламин технический по ГОСТ 9875.

5.3.39 Хлороформ по ГОСТ 20015.

5.3.40 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.

5.4 Приготовление реактивов

5.4.1 Приготовление раствора аммиака () массовой концентрации 125

В мерную колбу (см. 5.3.12) с пришлифованной пробкой вместимостью 10  вносят пипеткой (см. 5.3.9) 5  водного аммиака (см. 5.3.32). Доводят объем раствора аммиака в колбе до метки дистиллированной водой (см. 5.3.40), закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.

5.4.2 Приготовление элюентов (проявителей)

5.4.2.1 Приготовление элюента 1

В коническую колбу (см. 5.3.13) вместимостью 50  вносят пипетками (см. 5.3.10), индивидуальными для каждого реактива, 3  пиридина (см. 5.3.27), 3  изоамилового спирта (см. 5.3.30), 3  изобутилового спирта (см. 5.3.31), 4  этилового ректификованного технического спирта (см. 5.3.29), 4  водного аммиака (см. 5.3.32). Колбу закрывают стеклянной пробкой (см. 5.3.14) и тщательно перемешивают.

5.4.2.2 Приготовление элюента 2

В коническую колбу вместимостью 50  вносят пипетками, индивидуальными для каждого реактива, 3  пиридина, 3  изоамилового спирта, 3  изобутилового спирта, 4  этилового ректификованного технического спирта, 8  водного аммиака. Колбу закрывают стеклянной пробкой и тщательно перемешивают.

5.4.2.3 Приготовление элюента 3

В коническую колбу вместимостью 50  вносят пипетками, индивидуальными для каждого реактива, 6  диэтиламина (см. 5.3.38), 5  хлороформа (см. 5.3.39), 6  этилового ректификованного технического спирта, 3  раствора аммиака () массовой концентрации 125 , приготовленного по 5.4.1. Колбу закрывают стеклянной пробкой и тщательно перемешивают.

5.4.2.4 Приготовление элюента 4

В мерную колбу (см. 5.3.12) с пришлифованной пробкой вместимостью 100  пипеткой вносят 5  водного аммиака (см. 5.3.32) и доводят объем раствора до метки метанолом (см. 5.3.34). Колбу закрывают пробкой и тщательно перемешивают.

Элюенты (проявители) готовят за 1 ч до начала анализа.

5.5 Подготовка к анализу

5.5.1 Приготовление КО стандартных красителей

5.5.1.1 В необходимое число стаканов (см. 5.3.11) вместимостью 50  каждый взвешивают на весах (см. 5.3.1) образцы стандартных красителей с записью результата до четвертого десятичного знака.

Массу образца стандартного красителя m, г, рассчитывают с учетом массовой доли основного красящего вещества в образце по формуле

,

(1)

где 0,25 - масса основного красящего вещества, содержащегося в образце стандартного красителя, г;

100 - коэффициент пересчета;

X - массовая доля основного красящего вещества в образце стандартного красителя, %.

Массовую долю основного красящего вещества X в образце стандартного красителя определяют в соответствии с приложением Б.

5.5.1.2 В каждый стакан с образцом стандартного красителя, приготовленного по 5.5.1.1, прибавляют 20  дистиллированной воды и перемешивают стеклянной палочкой (см. 5.3.18) до полного растворения. Для интенсификации растворения допускается нагревание раствора в стакане на водяной бане до температуры не более 90°С. Затем раствор охлаждают до температуры 20°С, переносят в мерную колбу (с пришлифованной пробкой) вместимостью 100 , доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.

5.5.1.3 Полученный раствор КО стандартного красителя имеет массовую концентрацию основного красящего вещества , , определяемую по формуле

(2)

или

,

(3)

где 0,25 - масса основного красящего вещества, содержащегося в образце стандартного красителя, г;

- объем раствора КО стандартного красителя, ( = 100 );

- коэффициент пересчета в .

Раствор КО стандартного красителя хранят в склянке из темного стекла с завинчивающейся пробкой при комнатной температуре.

Срок хранения КО стандартных красителей - 6 мес.

5.5.2 Извлечение красителей из анализируемой алкогольной продукции

5.5.2.1 Извлечение красителей методом твердофазной экстракции

а) Приготовление анализируемого раствора алкогольной продукции

В стакане вместимостью 50  взвешивают на весах 25 г анализируемой алкогольной продукции (см. раздел 3) с точностью 0,1 г. Затем пипеткой (см. 5.3.9) в стакан добавляют 1  ледяной уксусной кислоты (см. 5.3.28). Стакан помещают на водяную баню, предварительно нагретую до температуры (855)°С, и выдерживают в течение 5 - 6 мин.

б) Подготовка патрона для твердофазной экстракции

Медицинским шприцем (см. 5.3.7) набирают 10 - 20  дистиллированной воды, соединяют шприц с патроном для твердофазной экстракции (см. 5.3.4), заполненным сорбентом [оксидом алюминия (см. 5.3.33)]. Патрон промывают со скоростью от 10 до 20 капель дистиллированной воды в минуту. Объем пропускаемой через патрон дистиллированной воды должен быть не менее 30 . После этого патрон промывают один раз 25  раствора ледяной уксусной кислоты массовой концентрацией 10 (см. 5.3.28). Затем патрон отсоединяют от шприца.

в) Сорбция красителей из анализируемой алкогольной продукции

Медицинским шприцем набирают от 10 до 20  анализируемого раствора алкогольной продукции, подготовленного по перечислению а) 5.5.2.1, и соединяют шприц с патроном. Пропускают анализируемый раствор через патрон по одной капле со скоростью от 10 до 20 капель в минуту. При появлении на выходе из патрона окрашенного анализируемого раствора его пропускают через второй патрон. При необходимости используют от 1 до 5 патронов, подготовленных по 5.5.2.1б), до достижения полноты сорбции красителя. После этого промывают каждый патрон с сорбированным синтетическим красителем 25  раствора ледяной уксусной кислоты массовой концентрации 10 .

г) Десорбция красителей из патронов водным аммиаком

Медицинским шприцем набирают от 10 до 20  водного аммиака (см. 5.3.32) и соединяют шприц с патроном. Пропускают водный аммиак через патрон по одной капле со скоростью от 10 до 20 капель в минуту. При необходимости промывание патрона водным аммиаком повторяют до полного обесцвечивания сорбента (оксида алюминия) в патроне. Элюат (раствор водного аммиака, пропущенный через патрон) собирают в выпарную чашку (см. 5.3.16) и выпаривают досуха на водяной бане с температурой (855)°С. После этого чашку с сухим остатком (красителем) охлаждают. Охлажденный краситель растворяют в чашке от 0,5 до 1,0  с дистиллированной водой.

5.5.2.2 Извлечение красителей методом колоночной хроматографии

а) Подготовка хроматографической колонки

В стакане (см. 5.3.11) вместимостью 400  взвешивают на весах 20 г целлюлозы с точностью 0,1 г. Затем в стакан прибавляют 200  раствора сульфата аммония (см. 5.3.37) и взбалтывают. Дают смеси отстояться и декантируют жидкость (сливают с отстоявшегося осадка). Повторяют промывание целлюлозы с декантацией жидкости от 3 до 5 раз. В стакан с промытой целлюлозой добавляют 100  раствора сульфата аммония и переносят суспензию в хроматографическую колонку (см. 5.3.17). После прохождения жидкости содержимое колонки промывают вторично 100  раствора сульфата аммония.

б) Сорбция красителей из анализируемой алкогольной продукции

В стакане вместимостью 50  взвешивают на весах 25 г анализируемой алкогольной продукции с точностью 0,1 г. Пробу анализируемой алкогольной продукции переносят в хроматографическую колонку порциями по 5  и пропускают через нее со скоростью 2 .

в) Десорбция красителей

После прохождения пробы анализируемой алкогольной продукции через хроматографическую колонку по перечислению б) 5.5.2.2, в колонку вносят порциями по 5  элюент 4, приготовленный по 5.4.2.4. Элюент 4 пропускают через колонку со скоростью 2  до полного обесцвечивания целлюлозы. Элюат (раствор элюента 4, пропущенный через хроматографическую колонку) собирают в коническую колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 250 . Элюат переносят в чашку и выпаривают досуха на водяной бане с температурой (855)°С. После этого чашку с сухим остатком (красителем) охлаждают. Охлажденный краситель растворяют в чашке от 0,5 до 1,0  дистиллированной воды.

5.5.3 Подготовка хроматографической камеры

В хроматографическую камеру (см. 5.3.6) вносят элюент 1, приготовленный по 5.4.2.1, в количестве, необходимом для погружения хроматографической пластины в камере на глубину не более 0,5 см от нижнего края пластины. Камеру плотно закрывают.

5.5.4 Подготовка пластин для ТСХ анализа

На линию старта хроматографической пластины (см. 5.3.5), расположенную на расстоянии 1 см от края пластины, карандашом наносят точки с интервалом не менее 1 см.

5.5.5 Получение хроматографических карт реперов КО стандартных красителей

На пластину, подготовленную по 5.5.4, микрошприцем (см. 5.3.8) наносят на линию старта в несколько приемов с промежуточным подсушиванием на воздухе 0,3  каждого раствора репера КО стандартных красителей, полученных по 5.5.1. После нанесения раствора пластину подсушивают в течение 3 - 4 мин и затем пинцетом по ГОСТ 21241 погружают в раствор элюента 1 на глубину не более 0,5 см от нижнего края пластины под углом примерно 45°. Камеру плотно закрывают. Элюирование заканчивают при достижении элюентом 1 линии границы элюента. По окончании элюирования пластину вынимают и подсушивают.

Аналогично получают хроматографические карты с использованием элюентов 2 и 3.

Значения реперов стандартных красителей рассчитывают по формуле

,

(4)

где - расстояние до линии старта от центра пятна репера стандартного красителя, см;

- расстояние до линии старта от линии границы элюента, см.

5.6 Проведение анализа

5.6.1 Предварительная оценка состава красителя анализируемой алкогольной продукции

Пластину, подготовленную по 5.5.4, разрезают ножницами на две части на расстоянии от 3,0 до 3,5 см от боковой стороны пластины перпендикулярно к линии старта.

На линию старта подготовленной хроматографической пластины шириной от 3,0 до 3,5 см микрошприцем (см. 5.3.8) наносят от 0,3 до 1,0  раствора, полученного по 5.5.2.1 или 5.5.2.2. Пластину подсушивают в течение 3 - 4 мин и затем пинцетом (см. 5.3.25) погружают в раствор элюента 1 на глубину не более 0,5 см от нижнего края пластины под углом примерно 45°. Камеру плотно закрывают. Элюирование заканчивают при достижении элюентом линии границы элюента 7,0 см от линии старта. По окончании элюирования пластину вынимают и подсушивают.

Предварительную идентификацию анализируемого красителя проводят на основе визуальной оценки цвета пятен и сравнением значений анализируемых красителей, рассчитанных по формуле (9) со значениями стандартных красителей, рассчитанных по формуле (4) и приведенных в таблице 1, или с помощью хроматографических карт, полученных при предварительном хроматографировании растворов КО стандартных красителей.

Таблица 1 - Значения стандартных красителей

Наименование стандартного красителя	Номер красителя*	Индекс пищевой добавки**	Значения для элюента
			1	2	3
Тартразин	CI 19140	Е102	0,27	0,49	0,37
Желтый хинолиновый	CI 47005	Е104	0,74 0,83	0,65 0,69	0,47 0,65
Желтый "Солнечный закат"	CI 15985	Е110	0,39	0,68	0,64
Азорубин	CI 14720	Е122	0,34	0,67	0,54
Понсо 4R	CI 16255	Е124	0,24	0,65	0,48
Красный очаровательный АС	CI 16035	Е129	0,50	0,67	0,66
Синий патентованный V	CI 42051	Е131	0,20	0,63	0,46
Индигокармин	CI 73015	Е132	0,36	0,67	0,58
Синий блестящий FCF	CI 42090	Е133	0,43	0,69	0,59
Зеленый S	CI 44090	Е142	0,16	0,54 0,63	0,55
Зеленый прочный FCF	CI 42053	Е143	0,43	0,37	0,39
Черный блестящий PN	CI 28440	Е151	0,25	0,62	0,40
Желтый 2 G	CI 18965	Е107	0,32	0,65	0,31
Амарант	CI 16185	Е123	0,29	0,64	0,43
Эритрозин	CI 45430	Е127	0,57	0,76	0,90
Красный 2G	CI 18050	Е128	0,49	0,51	0,48
* Номер красителя в соответствии с международным каталогом красителей Colour Index. ** Индекс красителя в соответствии с европейской кодификацией пищевых добавок.

5.6.2 Приготовление КО смесевых стандартных красителей

5.6.2.1 КО смесевых стандартных красителей готовят с учетом предварительной оценки состава красителей по 5.6.1.

Примечание - На силикагелевых пластинах синие, фиолетовые и красные красители идентифицируются намного лучше желтых и оранжевых.

5.6.2.2 Приготовление раствора А

В мерную колбу (с пришлифованной пробкой) вместимостью 500  пипеткой вносят по 50  КО стандартных красителей по 5.5.1.2, присутствие которых наиболее вероятно в анализируемой алкогольной продукции, доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.

Массовую концентрацию каждого компонента полученного раствора А , , определяют по формуле

(5)

или

,

(6)

где 0,125 - количество основного красящего вещества индивидуального стандартного красителя, содержащегося в 50  КО, приготовленного по 5.5.1.3, г;

V - объем раствора КО смесевых стандартных красителей, (V = 500 );

- коэффициент пересчета в .

5.6.2.3 Приготовление раствора Б

Пипеткой (см. 5.3.9) отбирают 25  раствора А, приготовленного по 5.6.2.2, и переносят в мерную колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 50 . Доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.

Массовую концентрацию каждого компонента полученного раствора Б , , определяют по формуле

,

(7)

где - массовая концентрация красителя в растворе А по 5.6.2.2, ;

2 - коэффициент разведения.

5.6.2.4 Приготовление раствора В

Пипеткой отбирают 25  раствора Б, приготовленного по 5.6.2.3, и переносят в мерную колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 50 . Доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, колбу закрывают пробкой и тщательно перемешивают.

Массовую концентрацию каждого компонента полученного раствора В , , определяют по формуле

,

(8)

где - массовая концентрация красителя в растворе Б по 5.6.2.3, ;

2 - коэффициент разведения.

Полученные растворы Б и В используют в качестве реперов (свидетелей).

5.6.3 Идентификация красителя

На хроматографическую пластину, подготовленную по 5.5.4, шириной от 6,5 до 7,0 см, микрошприцем наносят от 0,3 до 1,0  растворов реперов (раствор Б и раствор В) и анализируемого раствора красителя по 5.5.2.1 или 5.5.2.2. Все растворы наносят на пластину в одинаковой пропорции. Пластину подсушивают в течение 3 - 4 мин и пинцетом помещают в хроматографическую камеру, заполненную элюентом. Элюент выбирают в соответствии с 5.6.1 и таблицей 1. Камеру плотно закрывают. Элюирование заканчивают при достижении границы элюента - высоты 7,0 см от линии старта. По окончании элюирования хроматографическую пластину вынимают и подсушивают.

5.6.4 Обработка результатов

Измеряют линейкой (см. 5.3.23) расстояние от центра каждого пятна анализируемого красителя и границы элюента до линии старта.

Вычисляют значение по формуле

,

(9)

где - расстояние до линии старта от центра пятна красителя, см;

- расстояние до линии старта от границы элюента (проявителя), см.

При совпадении цвета и положения хотя бы одного из пятен обнаруженных красителей с одним из пятен КО идентифицируют обнаруженные красители, сравнивая значения , рассчитанные по формуле (9), со значениями КО, рассчитанными по формуле (4) и приведенными в таблице 1.

6 Денситометрический метод количественного определения красителей в тонком слое сорбента

Метод предназначен для количественного определения в алкогольной продукции синтетических красителей (основных красящих веществ): тартразина Е102, желтого хинолинового Е104, желтого "Солнечный закат" Е110, азорубина Е122, амаранта Е123, понсо 4R Е124, эритрозина Е127, красного 2G Е128, красного очаровательного AC Е129, синего патентованного V Е131, синего блестящего FCF Е133, зеленого прочного FCF Е143, черного блестящего PN Е151.

6.1 Сущность метода

Метод основан на сорбции красителей из анализируемой алкогольной продукции твердыми сорбентами, десорбции аммиаком, удалении аммиака выпариванием, хроматографировании в тонком слое сорбента и определении массовой доли красителей методом количественной оптической денситометрии.

В качестве реперов (свидетелей) используют КО стандартных красителей (растворы Б и В) по 5.6.2.

6.2 Условия проведения анализа

При подготовке и проведении измерения должны быть соблюдены следующие условия:

    - температура окружающего воздуха ............... от 15°С до 25°С;

    - атмосферное давление .......................... от 84,0 до 106,7 кПа

                                                      (от 630 до 800 мм рт. ст.);

    - относительная влажность воздуха ............... от 30% до 80%;

    - напряжение в электросети ......................  В;

    - частота тока в электросети .................... от 49 до 51 Гц.

Помещение, где проводят работы с реактивами, должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

Все операции с реактивами следует проводить в вытяжном шкафу.

6.3 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

Для выполнения анализа используют средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы по 5.3, за исключением стандартных красителей Желтый 2 G, Индигокармин и Зеленый S (см. приложение А), а также:

- оптический денситометр, работающий в диапазоне длин волн от 400 до 800 нм, с чувствительностью по каждому измеряемому красителю в алкогольной продукции не ниже 0,012 (0,0012%);

- детектор - черно-белая малогабаритная видеокамера или аналогичная цветная с чувствительностью не хуже 0,02 лк, с ручной фокусировкой и ручной регулировкой диафрагмы либо цветной сканер разрешением от 200 dpi и выше с графическим интерфейсом, функциями управления сканером, связи и передачи данных в программное приложение компьютера;

- компьютер с операционной системой, совместимой с программным обеспечением сканера и специальным программным обеспечением по обработке тонкослойных хроматограмм;

- блок ввода изображения.

Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения.

6.4 Приготовление реактивов

Приготовление реактивов - по 5.4.

6.5 Подготовка к анализу

Подготовка к анализу - по 5.5.

6.6 Проведение анализа

6.6.1 Предварительная оценка состава исследуемого красителя - по 5.6.1.

6.6.2 Приготовление КО смесевых стандартных красителей - по 5.6.2.

6.6.3 Определение состава красителя - по 5.6.3.

6.6.4 Проведение измерений

Определение значений , массовых долей красителей проводят на денситометре.

Массу каждого красителя в пятне репера (свидетеля) КО смесевого стандартного красителя, полученном нанесением на пластину раствора Б, , мкг, рассчитывают по формуле

,

(10)

где - массовая концентрация каждого красителя в растворе репера Б (свидетеля) смесевого стандартного красителя по 5.6.2.3, ;

- объем раствора репера Б (свидетеля) смесевого красителя, нанесенного на пластину ТСХ по 5.6.3, .

Массу каждого красителя в пятне репера (свидетеля) КО смесевого стандартного красителя, полученном нанесением на пластину раствора В, , мкг, рассчитывают по формуле

,

(11)

где - массовая концентрация каждого красителя раствора репера В (свидетеля) смесевого стандартного красителя по 5.6.2.4, ;

- объем раствора репера В (свидетеля) смесевого красителя, нанесенного на пластину ТСХ по 5.6.3, .

Значения массы каждого красителя в пятне репера (свидетеля) КО смесевого стандартного красителя вводят в программу компьютерной обработки, а массу анализируемого красителя обозначают X.

Получают результат измерения - массу анализируемого красителя, нанесенного на пластину, в мкг

В случае если массовая доля красителя в анализируемом растворе превысит диапазон измерения от 0,0012% до 0,0250%, необходимо разбавить раствор до концентрации, соответствующей указанному диапазону, и значение массовой доли красителя, рассчитанной по формуле (12), умножить на коэффициент разбавления.

Пример количественного определения красителя приведен в приложении В.

6.7 Обработка результатов

Массовую долю красителя в анализируемой алкогольной продукции, , %, рассчитывают по формуле

(12)

или

,

(13)

где - количество анализируемого красителя в пятне пластины ТСХ (выходной сигнал денситометра), мкг;

- коэффициент пересчета, мкг в г;

- объем анализируемого раствора красителя, полученного по перечислению г) 5.5.2.1 или перечислению в) 5.5.2.2, ;

- объем анализируемого раствора красителя, нанесенного на пластину ТСХ по 5.6.3, ;

- коэффициент пересчета в ;

- масса пробы анализируемой алкогольной продукции, взятой для анализа по перечислению а) 5.5.2.1 или перечислению б) 5.5.2.2, г ( = 25 г);

100 - коэффициент пересчета, %.

Вычисления проводят с записью результата до пятого десятичного знака.

Окончательный результат записывают с точностью до четвертого десятичного знака.

6.7.2 За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений , %, если выполняется условие приемлемости

,

(14)

где , - результаты анализов двух параллельных измерений массовой доли красителя, выполненных в условиях повторяемости, %;

- среднее значение двух параллельных измерений массовой доли красителя, выполненных в условиях повторяемости, %;

r - значение предела повторяемости, %, приведенное в таблице 2.

Таблица 2

Диапазон измерений массовой доли красителя в алкогольной продукции, %	Предел повторяемости r, % отн. при Р = 0,95, n = 2	Предел воспроизводимости R, % отн. при Р = 0,95, m = 2	Показатель точности (границы относительной погрешности), , %, при Р = 0,95
0,0012-0,025	10	15	10

Результат анализа представляют в виде

при Р = 0,95,

(15)

где - среднеарифметическое значение результатов двух определений, признанных приемлемыми, %;

- границы относительной погрешности измерений, %.

Предел повторяемости r и воспроизводимости R, а также показатель точности измерений массовой доли красителя в алкогольной продукции приведены в таблице 2.

7 Спектрофотометрический метод количественного определения красителей

Метод предназначен для количественного определения в алкогольной продукции индивидуальных красителей (основных красящих веществ) в соответствии с таблицей 3 и смесевых красителей, в состав которых входят два индивидуальных красителя, максимумы светопоглощения которых находятся в диапазонах длин волн 400 - 450 нм и 590 - 640 нм.

7.1 Сущность метода

Метод основан на сорбции красителей из анализируемой алкогольной продукции твердыми сорбентами, десорбции аммиаком, удалении аммиака выпариванием и определении массовой доли красителей по интенсивности окраски полученного раствора методом спектрофотометрии при характеристической длине волны.

7.2 Условия анализа

Подготовка и проведение анализа - в соответствии с 5.2.

7.3 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы

Для проведения анализа используют средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы по 5.3, а также:

- спектрофотометр с диапазоном измерения в интервале длин волн от 210 до 700 нм допустимой абсолютной погрешностью коэффициента пропускания не более 1%, спектральной шириной не более 1 нм;

- кюветы кварцевые толщиной поглощающего слоя 1 см.

7.4 Подготовка к анализу

Извлеченный по 5.5.2 из анализируемой алкогольной продукции раствор красителя переносят количественно в мерную колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 25 . Доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и перемешивают переворачиванием.

7.5 Проведение анализа

Кювету спектрофотометра заполняют приготовленным по 7.4 раствором анализируемого красителя и измеряют оптическую плотность при длине волны, соответствующей максимуму светопоглощения в соответствии с таблицей 3, относительно оптической плотности растворителя.

При совпадении максимумов светопоглощения растворов анализируемых красителей с максимумами светопоглощения красителей Желтый хинолиновый и Зеленый прочный FCF (см. таблицу 3) проводят повторный анализ извлеченного по 5.5.2 из анализируемой карамели раствора красителя, используя для его растворения растворитель в соответствии с таблицей 3.

Таблица 3 - Спектрофотометрические характеристики красителей

Наименование красителя	Индекс пищевой добавки	Растворитель	Длина волны, соответствующая максимуму светопоглощения, нм	Удельный коэффициент светопоглощения
Тартразин	Е102	Дистиллированная вода	426	530
Желтый хинолиновый	Е104	Раствор уксусной кислоты рН = 5	411	865
Желтый "Солнечный закат"	Е110	Дистиллированная вода	485	555
Азорубин	Е122	Дистиллированная вода	516	510
Амарант	Е123	Дистиллированная вода	520	440
Понсо 4R	Е124	Дистиллированная вода	505	430
Эритрозин	Е127	Дистиллированная вода	526	1100
Красный 2G	Е128	Дистиллированная вода	532	620
Красный очаровательный АС	Е129	Дистиллированная вода	504	540
Синий патентованный V	Е131	Дистиллированная вода	638	2000
Индигокармин	Е132	Дистиллированная вода	610	480
Синий блестящий FCF	Е133	Дистиллированная вода	630	1630
Зеленый S	Е142	Дистиллированная вода	632	1720
Зеленый прочный FCF	Е143	50%-ный раствор этанола	625	1560
Черный блестящий PN	Е151	Дистиллированная вода	570	530

Значения оптической плотности раствора должно находиться в диапазоне от 0,2 до 0,8. В случае превышения значения оптической плотности раствора 0,8 необходимо разбавить раствор и значение массовой доли красителя, рассчитанное по формуле (13), умножить на коэффициент разбавления.

7.6 Обработка результатов

7.6.1 Массовую долю красителя в анализируемой алкогольной продукции , %, рассчитывают по формуле

(16)

или

,

(17)

где А - оптическая плотность анализируемого раствора по 7.4 при длине волны, указанной в таблице 3;

- объем разведения по 7.4, ( = 25 );

10 - коэффициент пересчета результата анализа, г/кг;

- удельный коэффициент светопоглощения, численно равный оптической плотности раствора с массовой долей красителя, равной 1%, при толщине поглощающего слоя 1 см, ;

d - толщина поглощаемого слоя, см (d = 1 см);

- масса пробы анализируемой алкогольной продукции, взятой на анализ по перечислению а) 5.5.2.1 или перечислению б) 5.5.2, г ( = 25 г).

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо "перечислению б) 5.5.2" следует читать "перечислению б) 5.5.2.1"

Вычисления проводят с записью результата до пятого десятичного знака.

Окончательный результат записывают с точностью до четвертого десятичного знака.

7.6.2 За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение , %, двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости

,

(18)

где , - результаты анализов двух параллельных измерений массовой доли красителя, %;

- среднее значение двух параллельных измерений массовой доли красителя, %;

r - значение предела повторяемости, приведенное в таблице 4.

7.6.3 Результат анализа представляют в виде

при Р = 0,95,

(19)

где - среднеарифметическое значение результатов двух определений, признанных приемлемыми, %;

- границы относительной погрешности измерений, %.

Предел повторяемости r и воспроизводимости R, а также показатель точности измерений массовой доли красителя в алкогольной продукции приведены в таблице 4.

Таблица 4 - Нормативы оперативного контроля стандартных красителей

Диапазон измерений массовой доли красителя в карамели, %	Предел повторяемости r, % отн. при Р = 0,95, n = 2	Предел воспроизводимости R, % отн. при Р=0,95, m = 2	Показатель точности (границы относительной погрешности) , %, при Р = 0,95
0,0004 - 0,0015	10	15	10

8 Определение массовой доли красителей методом зонального капиллярного электрофореза

Метод предназначен для количественного определения в алкогольной продукции синтетических красителей (основных красящих веществ) в соответствии с таблицей 5.

Таблица 5

Краситель и его индекс	Аналитическая длина волны, нм	Время миграции основного изомера, мин*	Время миграции других изомеров, мин**
Тартразин Е102	450	22,5	-
Желтый хинолиновый Е104	450	14,22	11,52; 22,00
Желтый "Солнечный закат" Е110	450	11,74 или 15,90	-
Азорубин, кармуазин Е122	520	18,20	-
Понсо 4R, пунцовый 4R Е124	520	18,38	-
Эритрозин Е127	520	9,13	9,29
Красный 2G E128	520	10,5	-
Красный очаровательный AC Е129	520	10,31	-
Синий патентованный V Е131	590	7,63	-
Индигокармин Е132	590	10,88	-
Синий блестящий FCF Е133	590	7,72	-
Черный блестящий PN Е151	590	19,84	-
* Состав некоторых красителей представлен несколькими изомерами, один из которых, как правило, является основным (преобладающим). Для количественного определения необходимо обрабатывать сумму всех пиков, относящихся к данному красителю, т.к. коэффициенты молярной экстинкции у изомеров одинаковые. ** Время миграции 11,74 наблюдают, как правило, при анализе сложных смесей, в то время как время миграции 15,90 наблюдают при анализе однокомпонентной смеси, состоящей из красителя и носителя.

8.1 Сущность метода

Метод капиллярного электрофореза для определения массовой доли пищевых красителей основан на разделении компонентов в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Капиллярный зональный электрофорез (английское сокращение CZE образовано от слов capillary zone electrophoresis) является простейшим видом капиллярного электрофореза, когда разделение обеспечивается за счет миграции растворенных веществ в зонах, движущихся с разной скоростью, и электроосмотического потока.

Идентификацию и количественное определение анализируемых красителей проводят, регистрируя поглощение при длинах волн 254, 450, 520 и 599 нм (а также снятием спектра в диапазоне от 200 до 600 нм) и времена миграции красителей.

В капиллярном электрофорезе разделение проводят с использованием кварцевых капилляров, имеющих внешнее полимерное покрытие, обычно полиимидное#, улучшающее их механическую прочность, и значительно реже полимерные капилляры, например из тефлона. Внутренний диаметр капилляров колеблется в пределах от 25 до 200 микрон, а длина капилляра в зависимости от поставленной задачи - от нескольких сантиметров до 1 м.

Диапазон определяемой массовой доли (содержания) с учетом разбавления от 1 до 100  (мг/кг).

8.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

Весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт, со значением среднего квадратического отклонения (СКО), не превышающим 0,3 мг, и погрешностью от нелинейности не более 0,6 мг.

Весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт, с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более 0,01 г.

Система капиллярного электрофореза с диодноматричным детектором кварцевым капилляром  см, ID = 50 мкм. Детектирование проводят на длинах волн 254, 450, 520 и 599 нм.

Технические характеристики системы капиллярного электрофореза: диапазон напряжений: от 0 до + 30 кВ, значение тока: от 0 до 300 мкА, значение мощности: от 0 до 6 Вт, гидродинамическое введение образца, регистрация детектором с диодной матрицей в диапазоне длин волн от 190 до 600 нм (с шагом 1 нм); продолжительность периода сканирования: 0,1 с, автоматический пробоотборник, термостатирование капилляра: от температуры на 10°С ниже комнатной до 60°С (шаг указания температуры: 0,1°С).

Спектрофотометр, позволяющий измерять оптическую плотность раствора, с диапазоном измерения длин волн от 400 до 700 нм.

УЗ-ванна с частотой ультразвука 43 - 45 кГц, рабочее время сессии 99 с, мощность 90 Вт.

Центрифуга с ротором для пробирок из полимерных материалов вместимостью 1,5  с частотой вращения не менее 14680 об/мин (20000g).

Шейкер с рабочим диапазоном оборотов 50 - 350 об/мин (шаг 10 об/мин) и таймером от 1 мин до 96 ч.

рН-метр с диапазоном измерений -1,99 ...+ 19,99, пределом погрешности измерения рН не более 0,1.

Кювета кварцевая, длина оптического пути 1 см.

Пипетки градуированные вместимостью 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0  по ГОСТ 29227.

Колбы мерные 2-250-2, 2-100-2, 2-50-2, 2-25-2 по ГОСТ 1770.

Стаканы химические по ГОСТ 25336 объемом 100 .

Цилиндры мерные лабораторные с носиком 2-го класса точности, объемом 25  по ГОСТ 1770.

Пробирки центрифужные одноразовые из полимерных материалов вместимостью 1,5 .

Флаконы (виалы), соответствующие пробоотборнику (автосэмплеру) прибора.

Мембранный фильтр целлюлозный диаметром 47 мм, размер пор 0,45 мкм.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, ч.д.а.

Натрий углекислый по ГОСТ 83, ч.д.а.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, ч.д.а.

Ацетонитрил, о.с.ч.

Красители стандартные в соответствии с приложением А, за исключением стандартных красителей Амарант, Желтый 2 G, Зеленый S, Зеленый прочный FCF.

Допускается применение других реактивов и средств измерения с характеристиками не хуже указанных.

8.3 Приготовление градуировочных растворов

8.3.1 Приготовление исходных растворов красителей

В необходимое число стеклянных стаканов отбирают по 0,1 г стандартных образцов красителей, взвешенных с точностью до 0,001 г. В каждый стакан прибавляют около 50  дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения образцов, при необходимости подвергая ультразвуковому воздействию в УЗ-ванне. Полученные растворы количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 , доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают. Массовую долю полученных исходных растворов красителей определяют спектрофотометрическим методом в соответствии с приложением Б.

8.3.2 Приготовление градуировочных растворов красителей

Градуировочные растворы с массовой долей на уровне 0,005; 0,01; 0,02 и 0,05 (точное содержание зависит от определенной концентрации красителя в исходном растворе) готовят из исходных растворов красителей. Для этого в мерные колбы вместимостью 100  вносят по 0,5; 1,0; 2,0 и 5,0  исходного раствора и доводят объем до метки дистиллированной водой. Колбы укупоривают пробками и тщательно перемешивают.

Срок хранения исходных градуировочных растворов при температуре от 6°С до 22°С не более 1 мес. Срок хранения градуировочных растворов при температуре от 2°С до 6°С не более 3 мес.

8.4 Подготовка проб

1 г исследуемого образца помещают в мерную колбу вместимостью 100 , доводят объем до метки дистиллированной водой. Колбу укупоривают пробкой и тщательно перемешивают. В случае исследования сильногазированных напитков предварительно проводят дегазирование образца в УЗ-ванне.

Полученные пробы исследуют в течение суток.

8.5 Приготовление растворов гидроокиси натрия

8.5.1 Приготовление концентрированного раствора

Гидроокись натрия массой 4,0 г помещают в стеклянный стакан, добавляют около 50  дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 , доводят объем до метки дистиллированной водой. Колбу укупоривают пробкой и тщательно перемешивают.

8.5.2 Приготовление разбавленного раствора

Гидроокись натрия массой 0,40 г помещают в стеклянный стакан, добавляют около 50  дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 , доводят объем до метки дистиллированной водой. Колбу укупоривают пробкой и тщательно перемешивают.

Полученные растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Срок хранения раствора при температуре от 2°С до 6°С не более 1 мес.

8.6 Приготовление буферного раствора

Фосфорнокислый однозамещенный калий массой 0,136 г и углекислый натрий массой 0,106 г помещают в стеклянный стакан, затем добавляют 50  дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения, при необходимости озвучивая в УЗ-ванне. Затем концентрированным раствором гидроокиси натрия доводят значение рН буферного раствора до 10,0 ед. рН (контроль по рН-метру). В случае нагрева растворов их охлаждают до комнатной температуры. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 . После этого мерным цилиндром в колбу добавляют 20  ацетонитрила, перемешивают и доводят объем до метки дистиллированной водой, колбу укупоривают пробкой и перемешивают. При наблюдении явления контракции объем снова доводят до метки дистиллированной водой и повторно перемешивают.

Полученный буферный раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Срок хранения буферного раствора при температуре от 2°С до 6°С не более 1 мес.

Перед анализом буферный раствор переносят в соответствующие флаконы (виалы).

8.7 Подготовка прибора

Прибор подготавливают к работе в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают следующие рабочие параметры:

- дозирование пробы - гидродинамическое при 30 мбар в течение 10 с;

- напряжение: 0 мин - 0 кВ, далее с 0 мин до 1,0 мин напряжение поднимают до 20 кВ, от 1,0 мин до 1,5 мин напряжение поднимают до 30 кВ;

- кварцевый капилляр общей длиной 64 см, расстояние до детектора (эффективная длина) 56 см, внутренний диаметр 50 мкм.

Термостатирование капилляра при температуре 25°С.

Детектирование: аналитические длины волн с шириной окна 20 нм: 254, 450, 520 и 590 нм (см. таблицу 5), снятие спектра в диапазоне от 200 до 600 нм; аналитическая длина волны используется для градуировки и количественного определения.

Время анализа 25 мин.

Перед началом работы капилляр в течение 5 мин промывают концентрированным раствором гидроокиси натрия, затем в течение 10 мин дистиллированной водой и буферным раствором в течение 5 мин.

Между анализами капилляр в течение 3 мин промывают дистиллированной водой, затем 2 мин разбавленным раствором гидроокиси натрия, снова дистиллированной водой в течение 3 мин и в конце в течение 1 мин буферным раствором.

Первое измерение, проведенное на новой порции буфера, отбрасывают. Содержимое одного флакона (виалы) с буферным раствором рекомендуется использовать для выполнения не более 5 измерений.

8.8 Градуировка прибора

По 1  приготовленных градуировочных растворов помещают в центрифужную одноразовую пробирку и центрифугируют 2 мин. Не менее 0,5  супернатанта переносят в виалу и устанавливают в лоток прибора, после чего проводят измерение.

На основании полученных данных строят градуировочный график и определяют формулу, описывающую его (например, методом наименьших квадратов). Также определяют коэффициент корреляции: градуировка признается удовлетворительной, если коэффициент корреляции, рассчитанный программой, будет не менее 0,99.

Допускается проведение расчетов по градуировке автоматически с помощью программного обеспечения прибора.

8.9 Проведение анализа

1  приготовленного раствора образца помещают в пробирку центрифужную и центрифугируют 2 мин при 20000g. Не менее 0,5  супернатанта переносят в виалу и устанавливают в лоток прибора, после чего проводят измерение.

При проведении определения следует ориентироваться на аналитические длины волн и времена миграции, приведенные в таблице 5.

Пример электрофореграммы смеси пищевых красителей приведен на рисунке 1.

"Рисунок 1 - Пример электрофореграммы смеси пищевых красителей на длине волны 254 нм"

8.10 Обработка и оформление результатов измерений

Идентификация красителей осуществляется исходя из сравнения времен миграции и спектров анализируемых образцов со стандартными растворами пищевых красителей. Таким образом, в случае наблюдения пика вещества или пиков веществ в зоне выхода соответствующих красителей необходимо предварительно сравнить спектр каждого пика с предполагаемым красителем и после установления тождественности этих двух спектров проводить количественное определение. Следует отметить, что совпадение спектров красителей имеет приоритет перед временем миграции и является определяющим при установлении вида красителя в образце. В случае несовпадения времени миграции, но тождественности спектров, пик принимают за соответствующий краситель.

Концентрацию красителя в пробе определяют согласно градуировочному графику.

Массовую долю (содержание) соответствующих красителей X, (мг/кг), в исследуемом образце вычисляют по формуле

,

(20)

где С - массовая доля красителя, найденная по градуировочной таблице или с помощью внешнего стандарта, ;

V - объем мерной колбы, ;

1000 - коэффициент пересчета;

m - масса образца по 8.4, г.

За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение , (мг/кг), двух параллельных определений массовой концентрации красителя, полученных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

,

(21)

где , - результаты двух параллельных измерений массовой доли (содержания) красителя в образце, (мг/кг);

- среднее значение двух параллельных измерений массовой доли (содержания) красителя в пробе, (мг/кг);

r - значение предела повторяемости, %.

Результаты анализа представляют в виде

() при Р = 0,95, (мг/кг),

где - среднеарифметическое значение двух определений массовой доли (содержания) красителя в пробе (мг/кг), признанных приемлемыми;

- границы абсолютной погрешности определения, (мг/кг), при доверительной вероятности Р = 0,95.

Границы абсолютной погрешности вычисляют по формуле

,

(22)

где - границы относительной погрешности измерения, %;

X - среднеарифметическое значение двух определений массовой доли (содержания) красителей в исследуемой пробе, (мг/кг).

Показатели прецизионности метода определены в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-2 и представлены в таблице 6.

Таблица 6

Предел повторяемости r, %, Р = 0,95	Предел воспроизводимости R, %, P = 0,95	Границы относительной погрешности , %, при вероятности Р = 0,95	Погрешность времени миграции , %, при вероятности Р = 0,95
10	12	15	5

_____________________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений".