Методические указания по санитарно-микологической оценке и улучшению качества кормов (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 25 февраля 1985 г.)

Методические указания
по санитарно-микологической оценке и улучшению качества кормов
(утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 25 февраля 1985 г.)

1. Общие положения

1.1. Настоящие методические указания определяют порядок проведения лабораторного санитарно-микологического исследования грубых, концентрированных (зерно, продукты его переработки, дрожжи кормовые, жмыхи, шроты) и комбинированных кормов, способы отбора и хранения средних проб, порядок использования некондиционных кормов, а также методы их обезвреживания.

1.2. Указания не распространяются на пищевые отходы, премиксы, БВД, травяную муку, новые кормовые средства, находящиеся в стадии производственной апробации, или кормовые средства, не имеющие показателей санитарной оценки.

2. Исследование кормов проводится с диагностической целью и направлено на предупреждение заболеваний, возникающих при скармливании животным кормов, пораженных токсигенными или патогенными микроскопическими грибами, а также для выяснения причин отравлений поголовья скота.

Исследование включает органолептический, токсико-биологический, химико-логический и физико-химический анализы.

3. Продолжительность исследования проб кормов не должна превышать:

- при органолептическом исследовании - 1 суток,

- при постановке пробы на мышах - 4 суток,

- при определении токсичности методом кожной пробы на кролике - 6 суток,

- при полном исследовании (органолептическом, микологическом, токсико-биологическом, физико-химическом) - 10 суток.

Заключение о результатах исследований лаборатория выдает не позднее двух суток с момента их окончания. Срок действия экспертизы - один месяц.

4. Порядок отбора проб, оформление и хранение образцов кормовых средств, направляемых на исследование.

4.1. При обнаружении у животных признаков микотоксикоза из рационов исключают корма, подозреваемые в недоброкачественности. Для исследования высылают в ветеринарную лабораторию пробы всех кормов, входивших в суточный рацион в течение одного месяца до проявления болезни, и остатки кормов в кормушках (грубые корма отбирают из пораженных участков партии).

4.2. Для пересылки и хранения пробы кормов с повышенной влажностью досушивают при температуре 40-45° до влажности, предусмотренной соответствующими ГОСТ.

4.3. Отбор средних проб кормов проводят в соответствии с действующими Государственными стандартами: зерна фуражного - по ГОСТ 13586.3-83; комбикорма - ГОСТ 13496.0-80; муки и отрубей - ГОСТ 9404-60; жмыхов, шротов - ГОСТ 13979.0-68; кормовых дрожжей - ГОСТ 20083-74; семян масличных культур - ГОСТ 10852-64; грубых кормов (сено, солома) - ГОСТ 4808-75; муки кормовой рыбной - ГОСТ 7631-73; муки кормовой животного происхождения - ГОСТ 17681-72.

Средние пробы других видов кормовых средств следует отбирать в соответствии с ГОСТ 12430-66 "Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе".

4.4. Отбор проб проводят с участием ветеринарных и зоотехнических специалистов и представителей администрации предприятий, хозяйств, а в конфликтных случаях - с участием представителя организации-поставщика и местных органов Госстандарта, в соответствии с "Инструкцией о порядке приемки продукции производственно-технического назначения и товаров народного потребления по качеству" (утверждена Постановлением Госарбитража при СМ СССР от 25.04.1966 N П-7 с добавлениями и изменениями, внесенными Постановлением Госарбитража от 29.12.79 N 81 и 14.10.74 N 98).

4.4.1. Отобранную среднюю пробу разделяют на две части массой не менее 1 кг каждая, упаковывают в чистые сухие банки или хлопчатобумажные мешки и опечатывают. Одну часть пробы направляют для исследований с актом комиссионного отбора и сопроводительным документом, вторую часть пробы хранят в хозяйстве в течение одного месяца в условиях, предотвращающих порчу или вторичное загрязнение.

В сопроводительном документе указывают цель исследования, вид кормового средства, его назначение, массу партии, место отбора пробы; для комбикормов, кроме того, - номер и состав рецепта (в случае отклонения от него прилагают копию качественного удостоверения), наименование предприятия-изготовителя, дату выработки продукции, обозначение стандарта на нее, номер смены, номер партии.

4.4.2. В конфликтных случаях по требованию представителя-поставщика ему должна быть дополнительно выделена часть отобранной в хозяйстве пробы.

4.4.3. При диагностических исследованиях дополнительно указывают дату возникновения заболевания, вид и количество заболевших животных, указывают основные клинические признаки заболевания. В случае падежа животных к сопроводительному документу прилагается копия акта вскрытия с подробным описанием установленных патолого-анатомических изменений, а также копия экспертиз ветеринарной лаборатории об исключении инфекционных болезней и отравлений животных химическими и растительными ядами, если такие исследования к указанному моменту проведены.

5. Органолептический анализ.

5.1. Органолептический анализ зерна проводят по ГОСТ 10967-75; комбикормов - ГОСТ 13496.13-75; сена и соломы - ГОСТ 4808-75; жмыхов и шротов - ГОСТ 13979.4-68; семян масличных культур - ГОСТ 10854-64; кормовых дрожжей - ГОСТ 20083-74. Степень дефектности зерна определяют в соответствии с "Методическими указаниями по оперативному учету и отчетности на предприятиях хлебопродуктов" (утверждены Государственным комитетом заготовок СМ СССР 9.11.64 N 1-18/286).

5.2. На грубых кормах при развитии грибов могут быть выявлены следующие признаки: потемнение, побурение, грибной налет различного цвета (черный, белый, сероватый и др.), слежавшиеся пласты. Гриб Stachybotiys altecnans на соломе образует сплошной или только на узлах, черный, сажистый налет. Зерновые корма (ячмень, овес, пшеница и др.), пораженные грибами рода Fusarium, могут содержать легковесные, щуплые зерна с матово-серой оболочкой, иногда на оболочке, часто в области зародыша, заметны пятна или коростинки с карминно-красной или розово-оранжевой окраской, представляющие собой грибницу или спороношение гриба; такую же окраску можно обнаружить и у эндосперма при надломе зерна. При развитии грибов Aspergillus и Penicillium зерна могут иметь потемневшие зародыши, а также плесневый налет зеленых, серых, голубоватых оттенков.

При органолептическом анализе грубых кормов и зерна обращают внимание на наличие головни и спорыньи, паразитирующих на злаках в период их вегетации.

5.3. При поступлении на исследование дефектного или подвергшегося самосогреванию зерна определяют степень его порчи. По органолептическим показателям различают четыре степени дефектности зерна:

Первая степень. Зерно имеет солодовый запах. Цвет внешних покровов зерна без изменений. Эндосперм с нормальным оттенком.

Вторая степень. Зерно с плеснево-затхлым запахом. Внешний покров зерен без блеска, потемневший. Эндосперм и зародыш при поражении их микроорганизмами могут быть темными.

Третья степень. Зерно имеет плеснево-гнилостный запах. Цвет внешних покровов зерна темный, эндосперм кремовый, поражен зародыш.

Четвертая степень. Зерно с гнилостным запахом, цвет эндосперма коричневый.

5.4. Оценка кормов по результатам органолептического анализа.

5.4.1. Зернофураж первой и второй степени дефектности подвергают дальнейшему санитарно-микологическому исследованию с целью определения его пригодности к скармливанию животным.

5.4.2. Считаются недоброкачественными и непригодными к использованию:

- непрессованное сено или солома, пораженные грибами более чем на 10% (горелое, заплесневелое, с затхлым запахом); прессованное - содержащее более 10% кип с прослойками заплесневелой соломы (сена) с затхлым запахом;

- комбинированные корма, отруби, дрожжи кормовые, мучка кормовая, жмыхи, шроты, мука кормовая рыбная, мука кормовая животного происхождения, имеющие затхлый, плесневый, гнилостный и другие запахи, не свойственные данным продуктам, а также комковатость и устанавливаемое визуально заплесневение;

- зерно фуражное третьей степени дефектности;

- зерно фуражное четвертой степени дефектности.

5.4.3. Корма, признанные непригодными к использованию по результатам органолептического анализа, дальнейшему исследованию не подлежат; при подозрении на отравление животных такие корма подвергают токсико-биологическому анализу.

6. Токсико-биологический анализ.

6.1. Определение токсичности кормов методом пробы на коже кролика (ГОСТ 13496.7-71)

Методика предназначена для определения токсичности фуражного зерна, продуктов его переработки, комбикормов и других видов концентрированных кормов (за исключением жмыхов, шротов и кормовых дрожжей), а также грубых кормов. Метод основан на дермонекротическом действии токсических веществ микогенного происхождения, извлекаемых из корма диэтиловым эфиром или ацетоном.

6.1.1. Получение экстракта. В банку или колбу с притертой пробкой вместимостью 500 помещают 50 г измельченного корма, заливают 150 мл диэтилового эфира или эфира для наркоза, или ацетоном, экстрагируют 24 часа при комнатной температуре, периодически встряхивая вручную или на шуттель-аппарате в течение 3-х часов. Если слой экстрагента над навеской будет менее 1 см, объем его увеличивают.

Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в выпарительную чашку. Оставшуюся в колбе или банке навеску корма дополнительно промывают небольшим количеством эфира (не менее 20 мл), промывную порцию фильтруют через тот же фильтр. Эфир выпаривают до полного исчезновения запаха. Для ускорения процесса можно использовать водяную баню. Экстракт, оставшийся на стенках чашки, смывают эфиром с тем, чтобы основное количество его находилось на дне чашки. Все операции, связанные с использованием эфира, проводят в вытяжном шкафу.

6.1.2. Проведение испытания. У кролика массой 2-2,5 кг в области бедра, лопатки или бока в день постановки биопробы тщательно выстригают участок кожи размером 6х6 см. Пигментированная кожа, а также кожа с признаками шелушения непригодна для проведения испытаний. На одном кролике допускается ставить одновременно не более 4-х проб.

На выстриженный участок кожи кролика стеклянной лопаткой наносят, слегка втирая, половину экстракта. В случае если он имеет восковидную консистенцию, его предварительно подогревают. Небольшую часть участка оставляют свободной от экстракта как контрольную.

Через 24 часа наносят оставшуюся часть экстракта. Если экстракта недостаточно для двух нанесений, его предварительно разбавляют подсолнечным маслом с тем расчетом, чтобы общее количество его составляло не менее 1 грамма.

Для предупреждения слизывания экстракта, нанесенного на кожу, на шею кролика надевают воротник, который снимают не ранее чем через 3 дня. Учет реакции ведут на следующий день после повторного нанесения экстракта и продолжают в течение 3-5 дней в зависимости от развития реакции.

6.1.3. Оценка результатов исследования.

Корм нетоксичный - отсутствие воспалительной реакции или наличие гиперемии, сохраняющейся не более двух суток после нанесения экстракта и не сопровождающейся шелушением кожи.

Корм слаботоксичный - гиперемия, сохраняющаяся 2-3 суток и заканчивающаяся шелушением кожи, или гиперемия, болезненность и отечность, проявляющаяся незначительным утолщением кожи с последующим образованием отдельных корочек.

Корм токсичный - резкая гиперемия, болезненность, складчатость, отек, проявляющийся сильным утолщением кожи, на всей поверхности участка появляются язвы, затем сплошной струп.

6.2. В качестве дополнительного может быть использован метод определения токсичности кормов на рыбах-гуппи, позволяющий обнаруживать микотоксины трихотеценовой группы, стеригматоцистин, патулин (приложение 5, п. 3).

6.3. Токсичность жмыхов, шротов и кормовых дрожжей определяют на белых мышах (приложение 6).

6.4. В случае, когда указанными выше методами не выявляется токсичность корма при наличии отравлений в хозяйствах, токсичность можно установить методом скармливания одному из видов лабораторных животных: цыплятам, утятам, голубям, белым мышам, морским свинкам, кроликам. Для определения токсичности концентрированных или комбинированных кормов используют цыплят в возрасте 10-15 дней, утят в 10-дневном возрасте, молодых мышей весом 20-25 г, а при определении токсичности грубых кормов - молодых морских свинок и кроликов.

Подозрительный по качеству корм вводят в суточный рацион взамен аналогичного доброкачественного корма в количествах, определенных зоотехническими нормами для данного вида животных.

Скармливание проводят не менее 10 дней подряд. Токсикоз проявляется быстрее, если пораженный корм скармливать подопытным животным на голодный желудок, для чего перед опытом их выдерживают 5-6 часов без корма (дачу воды не ограничивают). Для опыта берут 5 животных, за ними ведут ежедневные клинические наблюдения, учитывают поедаемость корма.

Показателями токсичности кормов при постановке биопробы являются: потеря в весе, расстройства желудочно-кишечного тракта и центральной нервной системы (дрожь, угнетение или возбуждение, нарушение координации движения, судороги, параличи); у цыплят и утят - цианоз гребня и сережек, сонливость, нередко понос, развитие анемии, судороги, параличи; у голубей - рвота.

Токсичные корма могут вызывать гибель подопытных животных без проявления клинических признаков.

Если после скармливания исследуемого корма в сроки наблюдения (10 дней) гибель подопытных животных не наступает, то их убивают и вскрывают. При вскрытии павших и убитых животных обнаруживают катаральное воспаление желудочно-кишечного тракта, иногда кровоизлияния, а также дегенеративные изменения паренхиматозных органов. Для птиц характерен гепатит различной интенсивности (цвет печени оранжевый, желтый и др.) в зависимости от степени токсичности корма.

6.5. В случаях если токсичность корма не выявлена выше перечисленными методами, для установления роли кормов в возникновении заболеваний невыясненной этиологии применяют скармливание подозрительных кормов тем видам животных, которые болели в хозяйстве.

При постановке биопробы непосредственно в хозяйстве подопытным животным (3-5 голов) скармливают подозрительные корма в количестве, предусмотренном суточным рационом для данного вида животного. Корма дают без перерыва в течение 10 дней. За подопытными животными ведут ежедневные клинические наблюдения и учитывают: температуру, пульс, дыхание, деятельность желудочно-кишечного тракта, состояние слизистых оболочек, особенно ротовой полости, общее поведение животных. Одновременно ведут учет количества съеденного корма.

Положительными показателями биопробы являются: потеря в весе, расстройства желудочно-кишечного тракта (понос, запор, атония с тимпанией или без нее), усиление саливации, скрежетание зубами, стоматит, рвота у свиней, пониженный аппетит (может быть нормальный), нарушение координации движений, дрожь, угнетение, аборты, температура может быть нормальной или пониженной.

7. Микологический анализ.

Микологическое исследование входит в комплекс санитарно-микологического контроля кормов и ставит своей целью выявление токсигенных или патогенных грибов, развивающихся в период вегетации и хранения кормов.

7.1. Выявление фитопатогенных грибов, развивающихся только в период вегетации злаков

Санитарно-показательными фитопатогенными грибами являются спорынья и головневые грибы.

Спорынья (Claviceps purpurea) поражает культурные и дикорастущие злаки в период вегетации, при этом на зараженных колосьях ко времени созревания вместо зерен образуются буро-фиолетовые склероции ("рожки") длиной до 15 мм. При скармливании животным кормов, содержащих такие склероции (в грубых кормах, зерне) или их частицы (в комбикормах, продуктах переработки зерна), может возникнуть отравление - эрготизм.

Головня - заболевание злаковых растений, вызываемое головневыми грибами (Ustilaginales). В зерновом фураже головня может обнаруживаться как в виде пораженных зерен (мешочков) или их обломков, так и в виде распыленных спор (хламидоспор), приставших к оболочке зерна ("синегузочное" и "мараное" зерно).

7.1.1. Определение содержания головневых мешочков в зерне.

Пораженные зерна (мешочки) вручную отделяют из навески зерна в 400 г, взвешивают на технохимических весах с точностью до 0,01 г и определяют их процентное содержание.

7.1.2. Определение содержания спор головневых грибов в зерне (ГОСТ 13496.11-74).

Сущность метода заключается в отмывании спор головни от зерна, последующем осаждении их на бумажном фильтре фильтрованием под вакуумом, взвешивании и вычислении их процентного содержания.

7.1.2.1. Подготовка прибора для фильтрации. Фильтрацию проводят с помощью модифицированного прибора Зейтца (схема прибора приведена в ГОСТ 13496.11-74).

В нижнюю треть цилиндрической части прибора Зейтца вставляют кольцо, изготовленное из стальной проволоки диаметром 1-2 мм; на кольцо помещают металлическую сетку с величиной ячеек 2-4 мм, а на сетку - два кружка из полотна сита N 0105. Размер кольца, сетки и кружков из полотна сита должен соответствовать внутреннему диаметру цилиндрической части прибора.

Кружок, вырезанный из фильтра "синяя лента", диаметром, на 0,3 см превышающим внешний диаметр прибора Зейтца, обезжиривают в диэтиловом эфире в течение 20-30 мин и после высушивания взвешивают на аналитических весах с точностью до 0,001 г.

Фильтр помещают в разъемную часть прибора на резиновую прокладку по размеру внешнего диаметра прибора, которую предварительно 2-3 часа выдерживают в эфире. Под резиновую прокладку помещают металлическую сетку, приложенную к прибору, затем винтами соединяют цилиндрическую и конусовидную части прибора.

Прибор Зейтца, собранный указанным способом, вставляют в отверстие пробки, которой закрыта колба Бунзена. Колбу Бунзена соединяют шлангом с водоструйным насосом или с вакуум-насосом Камовского.

7.1.2.2. Ход определения. Навеску исследуемого зерна массой 50 г, взвешенную на технохимических весах, помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, заливают 100 мл диэтилового эфира, взбалтывают в течение одной минуты, дают отстояться в течение 10-20 секунд для осаждения частиц почвы, после чего жидкость сливают в прибор Зейтца. Такую промывку зерна проводят до получения бесцветной жидкости в колбе с навеской зерна.

После окончания фильтрации прибор разбирают, извлекают фильтр, выдерживают 5 минут в вытяжном шкафу и взвешивают на аналитических весах до тысячных долей грамма.

7.1.2.3. Подсчет содержания спор головневых грибов. Содержание спор головневых грибов (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где:

- масса фильтра после фильтрации, г;

- масса фильтра до фильтрации, г.

Допускаемые расхождения между результатами контрольных испытаний не должны превышать 0,01%.

7.1.3. Определение содержания спор головневых грибов в комбикормах и продуктах переработки зерна (ГОСТ 13496.10-74).

Сущность метода заключается в подсчете количества спор головневых грибов с помощью счетной камеры Горяева.

7.1.3.1. Подготовка к испытанию. Средний образец комбикорма массой 1 кг размалывают на лабораторной мельнице до прохождения через сито с диаметром отверстий 1 мм. Указанного измельчения достигают просеиванием и дополнительным измельчением остатка комбикорма на сите до тех пор, пока вся взятая масса комбикорма не будет измельчена до указанной степени размола. После измельчения образец тщательно перемешивают. После этого 10 г измельченного корма помещают в фарфоровую ступку и высушивают в сушильном шкафу при 100°С в течение 15 мин, после чего навеску тщательно растирают в фарфоровой ступке, периодически (3-5 раз) добавляя по 3 мл диэтилового эфира для равномерного распределения спор.

Для установления равномерности распределения спор гриба в навеске готовят препарат для микроскопирования. С этой целью в каплю воды на предметное стекло с помощью препаровальной иглы, смоченной в воде, помещают небольшое количество корма, растертого в диэтиловом эфире, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом. В хорошо растертой навеске не должно содержаться склеенных в кучки спор. На одном стекле готовят одновременно два препарата.

0,1 г комбикорма, растертого в эфире, помещают в пробирку, приливают 10 мл 0,5-процентного раствора едкого кали, взбалтывают, нагревают над пламенем горелки до кипения и охлаждают.

7.1.3.2. Ход определения. После тщательного перемешивания тонко оттянутой пастеровской пипеткой сразу же берут небольшое количество содержимого пробирки и вносят его в счетную камеру Горяева.

Просмотр и подсчет спор производят с помощью микроскопа при хорошем освещении и увеличении . Считают количество спор на всей сетке камеры, площадь которой равна 9 . При наличии половинок спор каждые две половинки считают за одну целую спору.

Споры грибов хорошо различимы под микроскопом, одноклеточные, шаровидные, но могут быть продолговатыми, эллиптическими или неправильной формы. Цвет спор - желтоватый, коричневатый, оливковый. Оболочка гладкая либо бородавчатая, щетинистая, сетчато-утолщенная (чертеж спор головневых грибов приведен в ГОСТ 13496.10-74).

7.1.3.3. Подсчет содержания спор головневых грибов. Для исследуемой пробы корма проводят не менее 6 определений, после чего вычисляют среднее арифметическое результатов подсчета спор.

Содержание головни (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где:

а - среднее арифметическое найденного числа спор;

22 - количество спор головневых грибов, установленное опытным путем для корма, содержащего 0,1% головни.

Допускаемое расхождение между результатами контрольных испытаний не должно превышать 0,01%.

7.1.4. Определение содержания спорыньи в зерне.

Из навески зерна 400 г отбирают вручную все "рожки" как целые, так и их частицы, взвешивают на технохимических весах с точностью до 0,01 г и определяют процентное содержание.

7.1.5. Определение содержания спорыньи в комбикормах и продуктах переработки зерна проводят по ГОСТ 13496.5-70.

Сущность метода заключается в отделении частиц склероциев спорыньи от массы корма путем обработки навески корма хлороформом, этиловым спиртом и 3 н раствором едкого натра или едкого кали.

7.1.5.1. Подготовка к испытанию. Средний образец комбикорма весом 1 кг размалывают на лабораторной мельнице до прохождения через сито с диаметром отверстий 1 мм, тщательно перемешивают и разравнивают тонким слоем, из нескольких точек которого (не менее 5) берут навески по 1 г.

3 н раствор едкого натра готовят путем растворения 120 г его в 1 л дистиллированной воды; для приготовления 3 н раствора едкого кали растворяют 168,33 г его в 1 л дистиллированной воды.

7.1.5.2. Проведение испытания. 1 г измельченного комбикорма помещают в стеклянную бюксу, приливают 10 мл хлороформа и взбалтывают, затем при постоянном встряхивании добавляют небольшими порциями 5 мл этилового спирта. Темные частицы спорыньи вместе с небольшим количеством частиц комбикорма всплывают на поверхность, остальная масса комбикорма оседает на дно. Затем осторожно, не допуская смешивания слоев, по стенке бюксы доливают 3 н раствор едкого натра или едкого кали с таким расчетом, чтобы он покрыл всю поверхность жидкости слоем не более 3 мм.

При ярком освещении в желтоватом слое щелочи хорошо различимы красновато-фиолетовые частицы наружных слоев и серовато-сиреневые частицы внутренних слоев склероциев спорыньи. Просмотр и подсчет частиц спорыньи проводится с помощью лупы.

7.1.5.3. Подсчет результатов испытания. За окончательный результат принимают среднее арифметическое пяти параллельных определений. Содержание спорыньи в корме определяют по таблице.

Среднее арифметическое количество всплывших частиц спорыньи	Содержание спорыньи, %
Не более 1,0	0,05
От 1,1 до 2,0	0,1
От 2,1 до 4,0	0,25

7.1.6. Оценку качества корма, содержащего головневые грибы и спорынью, проводят в соответствии с действующими Государственными стандартами на сырье и комбикорма.

7.2. Выявление грибов, способных развиваться в период хранения корма

Особую опасность для животноводства представляют грибы, способные развиваться в хранящейся массе корма. К ним относятся продуценты большинства известных в настоящее время микотоксинов, таких как афлатоксины, зеараленон, Т-2 токсин, а также грибы - возбудители аспергиллеза.

Микологическое исследование кормов с целью выявления этой группы грибов включает первичное выделение грибов из кормов путем посева их на питательные среды, выделение грибов из первичных посевов в чистые культуры и идентификацию их.

7.2.1. Первичное выделение грибов из кормов.

Первичное выделение грибов из кормов проводят путем посева их на питательную среду в чашки Петри - на агар Чапека или сусловый агар, а также (грубые корма) во влажные камеры со средой Ван-Итерсона (приложение 7).

Для предупреждения загрязнения посевов применяемая посуда (чашки Петри, пипетки и др.) и инструменты должны быть стерильными. Стерилизацию чашек, завернутых предварительно в бумагу, а также пипеток проводят в сушильном шкафу при температуре 140-160° в течение 2 часов.

Все процессы, связанные с разливкой питательных сред в чашки Петри, подготовкой корма для посева, с посевом корма, проводят в стерильных условиях - около пламени горелки в специальном боксе. Перед посевом проводят контроль зараженности воздуха в боксе спорами грибов седиментационным методом, для чего 1-2 чашки со средами оставляют открытыми в течение 3-х мин.

Стерилизацию бокса, рабочего помещения, термостата, холодильника проводят парами формальдегида с последующей нейтрализацией аммиаком. На 1 объема помещения расходуют 45 мл 40-процентного формальдегида, к которому добавляют 20 мл воды и 30 г марганцевокислого калия. Дезинфекцию проводят в течение 2-х часов, после чего для нейтрализации паров формалина применяют нашатырный спирт из расчета 50% от объема затраченного формалина.

Перед посевом питательный агар расплавляют в водяной бане, затем после охлаждения до 45-50° для подавления сопутствующей бактериальной флоры добавляют антибиотики (пенициллина - 50000 ед. и стрептомицина - 100000 ед. на 1 л среды).

Приготовленный агар в жидком виде разливают в стерильные чашки Петри и дают застыть на горизонтальной поверхности. Слой агара должен быть не менее 0,5 см.

Для приготовления влажной камеры на дно чашки Петри помещают тонкий слой ваты, на нее - кружок фильтровальной бумаги по диаметру чашки (вместо ваты можно положить несколько кружков фильтровальной бумаги), после чего стерилизуют в сушильном шкафу.

Перед посевом в чашки добавляют среду Ван-Итерсона в таком количестве, чтобы хорошо увлажнить вату и фильтровальную бумагу, но не создать избытка влаги (на чашку с диаметром 10-12 см расходуют около 5 мл среды).

7.2.1.1. Выделение грибов из зерна. Для выделения грибов из зерна их раскладывают в чашках Петри на поверхности питательной среды - по 10 шт. таким образом, чтобы они не соприкасались друг с другом, стараясь не передвигать их, чтобы предотвратить появление колоний, берущих начало не от зерен и рассматриваемых при учете как загрязнение.

Заражение зерен грибами может быть поверхностным (заспорение), когда элементы гриба (споры, частицы гиф и др.) присутствуют на поверхности зерна, не развиваясь в нем, и глубинным (поражение), когда гриб развивается в субэпидермальных частях зерна. Выявляют как субэпидермальную, так и поверхностную флору грибов.

Для выявления субэпидермальной микофлоры, преимущественно обусловливающей качество корма, перед посевом проводят обработку зерен 3-процентным раствором формальдегида (за основу берут 40-процентный формальдегид) или водным раствором сулемы в концентрации 1:1000 при экспозиции 1,5-2 минуты.

Для этого зерна, завернутые в марлевую салфетку размером 10х10 см, помещают в стаканчик с дезинфицирующим раствором. После окончания экспозиции их промывают стерильной водой: при дезинфекции сулемой трехкратно, при использовании формальдегида - однократно с обязательным добавлением для его нейтрализации 2-3 капель 5-процентного раствора аммиака к 50 мл воды. Поверхностную дезинфекцию зерен можно проводить в течение 1 минуты в 2-процентном растворе гипохлорита натрия с последующей двухкратной промывкой зерен стерильной водой. Промывную воду сливают, затем, слегка раздвинув пинцетом марлю, раскладывают зерна на агаровую пластинку. Число посеянных зерен должно быть не менее 50.

Выявление поверхностной микофлоры, необходимое для контроля зерна на зараженность патогенным грибом Aspergillus fumigatus, проводят путем раскладывания зерен по поверхности среды без предварительной поверхностной дезинфекции. Число посеянных зерен должно быть не менее 20.

7.2.1.2. Выделение грибов из концентрированных кормов (кроме зерна) и комбикормов проводят путем посева разбавленной взвеси их на питательные среды в соответствии с ГОСТ 13496.6-71 "Комбикорм. Метод выделения микроскопических грибов".

Образец гранулированного или брикетированного корма предварительно размалывают на лабораторной мельнице.

10 г комбикорма помещают в колбу с 100 мл стерильного 0,1-процентного раствора поверхностно-активного вещества (ОП-7, ОП-10, Твин-80) в дистиллированной воде и проводят дезинтеграцию пробы встряхиванием на шуттель-аппарате в течение 15-20 мин. Из этой взвеси 1 (1:10) готовят последующие разведения, используя также стерильные растворы вышеназванных ПАВ, следующим способом: 1 мл ее берут стерильной градуированной пипеткой (конец пипетки следует обрезать для свободного прохождения частиц комбикорма, после чего пипетка должна быть откалибрована на 1 мл), приливают в пробирку с 9 мл раствора и получают взвесь 2 (1:100). Из полученной взвеси 2 готовят аналогичным образом взвесь 3 (1:1000) и, если необходимо, взвесь 4 (1:10000). Перед взятием очередной порции взвеси как для получения дальнейшего разведения, так и для посева необходимо тщательно перемешивать взвесь пипеткой, а также промывать пипетку во взвеси не менее 5 раз.

Корм с нормальными органолептическими показателями разбавляют 1:1000, подвергшийся порче - 1:10000.

Посев проводят сразу же после приготовления последней взвеси (3 или 4), не давая ей отстояться, при этом 1 мл ее равномерно распределяют по всей поверхности питательной среды.

Число засеянных чашек зависит от выбранной степени разбавления: 5 чашек при разбавлении 1:1000 и 8 чашек при разбавлении 1:10000.

7.2.1.3. Выделение грибов из грубых кормов проводят в соответствии с ГОСТ 18057-72 "Корма грубые. Метод выделения микроскопических грибов".

Исследуемые солому, сено стерильными ножницами нарезают кусочками длиной около 2 см в стерильную чашку Петри.

Нарезанный корм стерильным пинцетом переносят на поверхность агара Чапека или суслового агара и, параллельно, во влажные камеры со средой Ван-Итерсона. Кусочки корма не должны соприкасаться друг с другом.

В три чашки Петри с агаризированной средой раскладывают по 10 кусочков сена или соломы, в 3 влажные камеры помещают не менее 90 кусочков из того же образца (по 30 кусочков в каждую чашку).

7.2.1.4. Культивирование посевов. Чашки Петри с посевами помещают в термостат завернутыми в стерильную бумагу и выдерживают при температуре 22-25° в течение 7-10 суток. Рост и спороношение большинства грибов становится заметным уже через 3 суток, однако идентификация грибов требует больших сроков культивирования - 5-7, а иногда и более суток.

7.2.2. Контроль кормов на содержание гриба Aspergillus fumigatus.

7.2.2.1. Выявление гриба A. fumigatus в комбикормах и других сыпучих кормах проводят в соответствии с ГОСТ 13496.6-71 "Комбикорм. Метод выделения микроскопических грибов" с учетом следующих дополнений.

Влажность исследуемой пробы корма не должна превышать уровня, предусмотренного соответствующими ГОСТ.

Образец перед взятием навески тщательно перемешивают, навеску 10 г взвешивают с точностью до 0,01 г.

Корм высевают в разведении 1:1000.

7.2.2.2. Выявление A. fumigatus в зерне проводят путем посева зерен без предварительной дезинфекции (по п. 7.2.1.1), однако для количественного учета гриба необходимо предварительное измельчение зерна и посев способами, изложенными в п.п. 7.2.1.2 и 7.2.2.1.

7.2.2.3. Показателем степени заспоренности корма грибом A. fumigatus является количество диаспор (грибных "зародышей") в 1 г исследуемого корма, которое определяют после подсчета выросших колоний с учетом количества посеянного материала и степени разбавления.

Подсчет колоний гриба можно проводить на 5, а иногда и на 3-4 сутки после посева.

Число колоний на всех 5 чашках суммируют, умножают на степень разбавления (1000) и делят на общее количество миллилитров посеянной взвеси (5) - таким образом получают количество диаспор гриба в 1 г корма.

Пример: на 5 чашках Петри выросло 7 колоний гриба A. fumigatus. Число диаспор гриба в 1 г исследуемого корма равно:

7.2.3. Выделение грибов в чистые культуры и их идентификация.

Родовую, а в ряде случаев и видовую принадлежность грибов устанавливают в первичном посеве, однако часто вид гриба определяют после выделения его в чистую культуру, для чего применяют два метода: метод непосредственного пересева и метод разделения. Получение чистых культур необходимо для дальнейшего изучения их токсигенности.

7.2.3.1. Метод непосредственного пересева применяют в том случае, если в первичном посеве выросли изолированные колонии. Пересевают маленький кусочек мицелия или часть колонии, для чего осторожно берут их микологическим крючком* и помещают на поверхность питательной среды.

Примечание: * - Микологический крючок - игла длиной не менее 5 см, свободный конец которой загнут под прямым или тупым углом, и вставленная в иглодержатель. Для этих целей применяют обычно нихром, сплав железа с никелем, кобальтом, вольфрамом.

При наличии обильного спороношения (например у аспергиллов и пенициллов) иглой, предварительно увлажненной в агаре той чашки или пробирки, куда будет проведен посев, лишь касаются спороносящей поверхности колонии и переносят минимальное количество спор.

Пересев грибов с целью их идентификации следует проводить на агаровые пластинки в чашки Петри; с целью поддержания культур для длительного хранения их в качестве эталонов* или для дальнейшего изучения их токсичности - на скошенный агар в пробирки.

Примечание: * - Для длительного поддержания культур их пересевают один раз в год, хранят при температуре 4-5°; ватные пробки при этом должны быть защищены колпачками из фильтровальной бумаги.

При использовании пробирок материал помещают в нижней трети косяка, чашек - обычно в одной или трех точках. В последнем случае чашки во время инокуляции, а также дальнейшей инкубации держат кверху дном для предотвращения рассеивания спор по всей агаровой пластинке.

7.2.3.2. Метод разделения применяют в тех случаях, если колонии загрязнены другими грибами или бактериями, что устанавливают обычно визуально. С этой целью готовят три-четыре последовательных разведения взвеси спор гриба в стерильном 0,1-процентном растворе Твина-80 в воде и высевают из одного-двух последних разведений по 1 мл на поверхность агара в чашки Петри, распределяя взвесь шпателем или наклоняя чашку в разные стороны. При наличии обильного спороношения разделение проводят с помощью посева - коснувшись стерильной влажной иглой (или крючком) ограниченного участка спороносящей поверхности, проводят ею штрихом по поверхности агаровой пластинки в чашке Петри. Штриховой посев особенно эффективен, если контаминант - бактерии.

7.2.3.3. Для идентификации различных групп грибов применяют определенные дифференциально-диагностические среды: для аспергиллов и пенициллов - агар Чапека и мальц-агар, для мукоровых грибов - сусловой агар, для фузариев - сусловой агар и среда Билай. Для более полного изучения культурально-морфологических свойств грибов используют и другие специальные среды, указанные в соответствующих пособиях по определению грибов.

Культивируют посевы при 22-25°. Сроки культивирования различны, в зависимости от рода и вида гриба, до образования характерного спороношения.

После окончания культивирования проводят макро- и микроскопическое исследование культур.

7.2.3.4. При макроскопическом изучении признаков грибов рассматривают колонии на месте их роста, учитывают цвет, форму, консистенцию колонии, характер роста, форму растущего края, наличие или отсутствие склероциев, пигмента, цвет его, степень развития воздушного мицелия.

7.2.3.5. Микроскопическое исследование проводят после приготовления препарата. Для этого маленькие частицы мицелия, желательно со спороношением, взятые микологическим крючком (из пробирок) или препаровальной иглой (из чашки) как из молодых (скраю), так и более старых (у центра) частей колоний, помещают на предметное стекло в небольшую каплю фиксирующей жидкости для препаратов, при этом используют вторую иглу, с помощью которой осторожно снимают и расправляют материал.

Покрывают препарат покровным стеклом и слегка надавливают на него, стараясь не загрязнить сверху; в случае если по краям покровного стекла появляется избыток жидкости, его следует убрать с помощью кусочка фильтровальной бумаги.

Фиксирующей жидкостью, наиболее пригодной для приготовления препаратов грибов из родов Aspergillus, Penicillium и ряда других, является лактофенол Аммана: дистиллированная вода - 1 часть, молочная кислота - 1 часть, глицерин - 2 части, фенол - 1 часть. Прежде чем поместить материал в эту жидкость, его следует кратковременно (до 30 секунд) обработать 70° этиловым спиртом для смачивания спор и удаления их избытка.

Для изучения грибов из рода Fusarium и некоторых других используют жидкость, состоящую из равных частей дистиллированной воды, этилового спирта и глицерина, при этом исследуемый материал спиртом не обрабатывают. Для улучшения видимости контуров конидий и перегородок в них к 100 мл указанной жидкости добавляют 0,5-1,0 мл 0,01-процентного водного или спиртового раствора метиленового синего.

Оба названных выше фиксатора позволяют хранить препарат сравнительно долгое время; для увеличения сроков хранения края покровного стекла заливают парафином или лаком.

Для предотвращения загрязнения воздуха помещения спорами грибов, препараты готовят с соблюдением правил асептики.

С помощью малого (объектив х8, х10), а затем большого (объектив х40, редко х90) увеличения микроскопа изучают препараты и, пользуясь специальными определителями с микологическими ключами, идентифицируют гриб.

8. Определение токсичности культур грибов

В случае установления токсичности кормов при микологических исследованиях, а также для выявления роли грибов в этимологии микотоксикозов определяют токсичность культур грибов ускоренным методом с использованием простейших (Paramaecium caudatum), а также методом кожной пробы на кролике. Результаты используют при оценке санитарного качества кормов и выборе способов их обезвреживания.

8.1. Определение токсичности культур грибов на простейших Paramaecium caudatum

Метод применяется для ориентировочного определения токсичности грибов, в первую очередь таких, как Stachybotrys alternans, Dendrodochium toxicum, виды рода Fusarium, и дает возможность выявлять водорастворимые токсические вещества.

Из культур грибов в первичных посевах на агаровых средах готовят водные экстракты. Для этого колонии грибов снимают с поверхности агара, освобождают от него, помещают в пробирки, измельчают до кашицеобразного состояния, заливают дистиллированной водой нейтральной реакции в соотношении 1:1 по объему, перемешивают и оставляют при температуре 4-10° на 24 часа.

Две капли экстракта из культуры гриба с помощью пастеровской пипетки наносят на предметное стекло и добавляют одну каплю среды с простейшими (приложение 8). Отмечают время начала опыта и под микроскопом (объектив х8, х10) наблюдают за поведением парамеций. Если в течение 3-5 минут гибель простейших не наступит, предметное стекло помещают в чашку Петри на кружок фильтровальной бумаги, смоченный водой, что предотвращает подсыхание капель.

Для быстрого определения токсичности ряда грибов, таких как Stachybotrys alternans, Fusarium sporotrichiella, Dendrodochium toxicum, берут кусочек колонии гриба, выросшего в чашке Петри при первичном посеве корма, переносят на предметное стекло шпателем или иглой, измельчают, заливают несколькими каплями дистиллированной воды и смешивают. Через 2 часа пленку удаляют или отодвигают в сторону, вносят каплю среды с простейшими и ведут наблюдение.

Критерием для определения чувствительности парамеций к токсическим веществам служит время от начала воздействия испытуемого экстракта до гибели простейших, которую констатируют на основании прекращения их движения, часто сопровождающегося деформацией и распадом. Если нет гибели парамеций, то наблюдение за ними проводят не более 2-х часов. В случаях, когда хотя бы часть парамеций за это время прекращает движение, наблюдение продолжают вплоть до момента гибели всех экземпляров. Многие метаболиты с острой токсичностью вызывают гибель простейших в период от 1 до 20-30 минут; со слабой - до 1-2 часов, иногда несколько дольше.

8.2. Определение токсичности культур грибов методом кожной пробы на кролике

В матрицы емкостью 1,5 л или конические колбы на 1000 мл помещают 200 г раздробленного зерна (кукуруза, рис, ячмень, пшеница и др.) или 30-50 г грубого корма, увлажняют водой (к зерну добавляют 100 мл для культивирования Aspergillus и Fusarium и 200 мл для Penicillium; к грубому корму - 20 мл) и стерилизуют в автоклаве при давлении 1 в течение 30 мин. Приготовленную среду засевают суспензией спор испытуемого гриба, предварительно выделенного в чистую культуру из первичного посева. Суспензию получают путем добавления в пробирку с культурой 3-5 мл физиологического раствора, содержащего 0,1% Твина-80, ОП-7 или ОП-10, и встряхивания ее для отделения спор. Колбы с посевами тщательно встряхивают.

Культивируют грибы при температуре 25-27° в течение 10 дней. Для накопления микотоксинов грибами из рода Fusarium (Т-2 токсин, Ф-2 токсин) культуры дополнительно выдерживают при пониженной температуре (5-7°) 15-30 суток.

Накопление токсических веществ в среде идет параллельно с ростом и развитием грибов. По окончании сроков культивирования культуру извлекают из сосудов, помещают в пакеты из фильтровальной бумаги и подсушивают при температуре 40-45°, после чего измельчают.

Кожную пробу на кролике ставят и учитывают так же, как при определении токсичности кормов.

Можно применять упрощенный способ определения токсичности чистых культур грибов методом кожной пробы на кролике. Для этого снимают мицелиальную пленку гриба, выросшего на питательной среде, растирают до кашицеобразного состояния и стеклянной палочкой или шпателем наносят на кожу кролика.

8.3. Работу с культурами грибов проводят с соблюдением режима микробиологической лаборатории и мер индивидуальной безопасности персонала.

9. Физико-химический анализ.

9.1. Количественное определение афлатоксинов и в кормах.

Исследованию подлежат корма при подозрении на афлатоксикоз сельскохозяйственных животных и птицы. Основным патолого-морфологическим признаком отравления является поражение печени (дегенерация, жировое перерождение, цирроз и некроз). Катаральные изменения желудочно-кишечного тракта могут отсутствовать.

Исследованию на наличие афлатоксинов подвергают также все партии арахисового и соевого шрота, используемые для приготовления комбикормов, а также партии зернофуража, подвергшегося процессу самосогревания. Продуцентами афлатоксинов являются грибы Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus, которые из кормов, прошедших термическую обработку, а также из шротов могут при микологическом анализе не выявляться.

При подозрении на афлатоксикоз целесообразно исследовать пробы кормов, поступивших для кормления животных в течение месячного периода, предшествующего отравлению.

Определение афлатоксинов и в кормах проводят в соответствии с "Методикой количественного определения афлатоксинов и в кормах", утвержденной Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 7 апреля 1980 г. (приложение 1).

9.2. Качественное определение микотоксина Т-2 в зернофураже

Показанием к исследованию на наличие токсина является положительный результат при проверке токсичности корма по кожной пробе на кролике. Наиболее вероятным источником отравления Т-2 токсином сельскохозяйственных животных и птиц являются зерновые, пораженные грибами рода Fusarium в поле и особенно перезимовавшие под снегом, длительное время хранившиеся в валках и недостаточно просушенные перед закладкой на хранение.

Отравление животных всегда сопровождается острыми катаральными воспалениями желудочно-кишечного тракта. Специфическим клиническим признаком при отравлении Т-2 токсином птицы является наличие изъязвлений ротовой полости.

Определение микотоксина Т-2 в зернофураже проводят в соответствии с "Методикой качественного определения микотоксина Т-2 в зернофураже", утвержденной Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 28 февраля 1980 г. (приложение 2).

9.3. Определение микотоксина зеараленона (Ф-2) в фуражном зерне и комбикормах

Исследованию на содержание зеараленона подлежат корма при возникновении среди животных гиперэстрогенного синдрома. Заболевание преимущественно отмечается среди свинопоголовья всех возрастов (вульвовагиниты). Повышенное содержание токсина в кормах может также приводить к бесплодию крупного рогатого скота. Зеараленон наиболее часто обнаруживают в кукурузе, пораженной различными видами Fusarium, чаще Fusarium graminearum и F. moniliforme. С диагностической целью целесообразно исследовать остатки кормов, использовавшихся для кормления в 2-3-недельный период, предшествующий заболеванию.

Определение зеараленона проводят в соответствии с "Методикой определения микотоксина зеараленона (Ф-2) в фуражном зерне и комбикормах", утвержденной Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 28 февраля 1980 г. (приложение 3).

9.4. При установлении наличия афлатоксинов, Т-2 токсина, Ф-2 токсина заключение о возможности использования таких партий корма выдается в соответствии с нормативной документацией по предельно допустимому количеству микотоксинов, утвержденной Главным управлением ветеринарии МСХ СССР.

10. Порядок использования некондиционных кормов.

10.1. Грубые корма (сено, солома, полова)

10.1.1. Токсичные грубые корма запрещается использовать в корм и на подстилку.

10.1.2. Слаботоксичные грубые корма, токсичность которых обусловлена:

- грибом Stachybotrys alternans - разрешается использовать только после обезвреживания (приложение 4) при условии отрицательного результата в повторных их исследованиях на токсичность;

- грибами из родов Fusarium и Dendrodochium - запрещается использовать для фуражных целей и на подстилку;

- грибами из родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus и другими, помимо перечисленных выше, - допускают в корм крупному и мелкому рогатому скоту, кроме лактирующих и беременных маток, в количестве 25% от нормы грубых кормов после подработки и просушивания. После обезвреживания скармливают без ограничений.

10.1.3. Нетоксичные грубые корма, пораженные грибом Stachybotrys alternans, скармливают только после обезвреживания.

10.1.4. Сено, солому, пораженные грибом Aspergillus fumigatus, использовать в подстилку молодняку с.-х. животных и птице запрещается.

10.2. Комбинированные корма

10.2.1. Токсичные комбинированные корма запрещается использовать для фуражных целей.

10.2.2. Слаботоксичные комбинированные корма, токсичность которых обусловлена:

- грибами родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus и другими, кроме Fusarium, - допускаются в корм животным на откорме: крупному рогатому скоту и овцам в количестве 25% от нормы комбикормов; свиньям, лошадям и птице - в том же количестве после обезвреживания и получения отрицательного результата при повторном исследовании на токсичность;

- грибами рода Fusarium - используют крупному рогатому скоту на откорме после обезвреживания в количестве 25% от суточной нормы комбинированных кормов.

10.2.3. Содержание спор гриба Aspergillus fumigatus не должно превышать 1000 в 1 г комбикорма для молодняка птиц: для цыплят в возрасте до 90 дней, бройлеров - до 56 дней, утят - до 55 дней, гусят - до 65 дней, индюшат - до 60 дней.

10.2.4. Для изготовления комбикорма используют сырье, отвечающее требованиям действующих нормативных документов - Государственных и отраслевых стандартов, технических условий.

10.2.5. Сырье, используемое для изготовления комбикормов, должно быть нетоксичным.

10.3. Концентрированные корма

10.3.1. Токсичные концентрированные корма запрещается использовать для фуражных целей.

10.3.2. Слаботоксичное фуражное зерно и продукты его переработки, токсичность которых обусловлена:

- грибами родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus и др. - допускаются в корм животным на откорме: крупному рогатому скоту и овцам в количестве 25% от суточной нормы концентратов; свиньям, лошадям и птице - в том же количестве после обезвреживания и получения отрицательного результата при повторном исследовании на токсичность;

- грибами рода Fusarium - используют крупному рогатому скоту на откорме после обезвреживания в количестве 25% от суточной нормы концентрированных кормов.

10.3.3. Зерно, перезимовавшее под снегом или подвергшееся самосогреванию (I-II степеней дефектности) и оказавшееся в результате исследования нетоксичным, допускают для фуражных целей только после просушивания. Хранению более 1 месяца такие корма не подлежат.

10.3.4. Слаботоксичные шроты, жмыхи используют в корм только откормочному крупному рогатому скоту в количестве, не превышающем зоотехнических норм.

10.3.5. Слаботоксичный шрот, выработанный из дефектных семян подсолнечника, пораженного склеротинией, может быть использован для приготовления комбикормов (в процентах): крупному рогатому скоту на откорме не более 10; откормочному поголовью свиней не более 8; ремонтному молодняку птицы промышленного стада яичных пород старше 60 дней не более 6; курам-несушкам промышленного стада не более 7. Указанный шрот запрещается использовать в корм свиноматкам, лактирующим и беременным маткам крупного и мелкого рогатого скота, молодняку сельскохозяйственных животных и птице раннего возраста.

Шрот следует исключить из рациона за две недели до убоя.

11. Поступившие на исследование корма, результаты их анализов и оценки регистрируются в журнале (приложение 9).

12. Считать утратившими силу Методические указания по санитарно-микологическому исследованию кормов, утвержденные Главным управлением ветеринарии 14 мая 1969 года.

Методические указания разработаны Всесоюзным научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, Рязанским СХИ, Сибирским научно-исследовательским ветеринарным институтом, Казанским ветеринарным институтом и Центральной ветеринарной лабораторией МСХ СССР.