Национальный стандарт РФ ГОСТ Р ИСО 21571-2014 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот" (утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 ноября 2014 г. N 1656-ст)

Foodstuffs. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Nucleic acid extraction

Дата введения - 1 июля 2015 г.

Введен впервые

Предисловие

1 Подготовлен Федеральным государственным бюджетным учреждением науки "Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева" Российской академии наук (ИФР РАН) на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 447 "Биологическая безопасность пищевых продуктов, кормов и товаров народного потребления и методы ее контроля"

3 Утвержден и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 ноября 2014 г. N 1656-ст

4 Настоящий стандарт является идентичным международному стандарту ИСО 21571:2005 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот" (ISO 21571:2005 "Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Nucleic acid extraction"), включая техническую поправку: Amd.1:2013.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты Российской Федерации и межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

5 Введен впервые

Введение

Исследование генетически модифицированных организмов (далее - ГМО) и производных продуктов осуществляется посредством следующих стадий, выполняемых последовательно или одновременно. После отбора проб нуклеиновые кислоты выделяются из анализируемой пробы. Выделенные нуклеиновые кислоты далее могут быть очищены от возможных примесей в самом процессе выделения или после него. Следующими этапами являются: оценка количества выделенных нуклеиновых кислот (при необходимости), разведение нуклеиновых кислот (при необходимости) и выполнение аналитических процедур, например полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР). Указанные этапы подробно изложены в настоящем стандарте и следующих международных стандартах:

- ИСО 21568 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Отбор проб";

- ИСО 21569 "Продукты пищевые. Методы анализа на обнаружение генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Качественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте";

- ИСО 21570 "Продукты пищевые. Методы анализа на обнаружение генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте".

Дополнительная информация об общих требованиях и определениях, относящихся к упомянутым выше этапам, приведена в ИСО 24276 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения".

В 2013 г. в ИСО 21571:2005 была внесена техническая поправка N 1 (Amd.1:2013) в части уточнения условий экстракции ДНК и добавления нового подраздела А.5.2 (приложение А), касающегося применения гуанидин-хлороформного метода для соевого лецитина. В настоящем стандарте техническая поправка N 1 выделена на полях одиночной вертикальной чертой.

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает общие требования и специфические методы выделения, очистки и количественной оценки дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее - ДНК). Эти методы изложены в приложениях А и В.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, но может быть также применен к другим продуктам, например семенам и кормам.

Настоящий стандарт следует применять совместно с ИСО 21569, ИСО 21570 в части аналитических методов на основе нуклеиновых кислот, в частности качественных аналитических методов, установленных в ИСО 21569, и количественных аналитических методов, установленных в ИСО 21570.

2 Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта.

ИСО 24276:2006 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения (ISO 24276:2006, Foodstuffs.Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. General requirements and definitions)

ИСО 21568:2003 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Отбор образцов (ISO 21658:2003, Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Sampling)

3 Принципы

3.1 Общие положения

Основная цель применения методов экстракции нуклеиновых кислот - обеспечение выделения нуклеиновых кислот, пригодных для последующего анализа (см. ИСО 24276).

Примечание - "Качество" ДНК зависит от средней длины экстрагированных молекул ДНК, химической чистоты и структурной целостности одной нити и двойной спирали ДНК (например, внутри- и межцепочечные связи оснований ДНК, выпадение оснований в цепочке ДНК, перекрестные сшивки с высокомолекулярными спиртами, гемином и т.д.). Кроме того, такие структурные изменения часто являются специфичными для определенной последовательности ДНК и поэтому не распределены по геному случайным образом (см. [1] - [4]).

Пользователям настоящего стандарта необходимо иметь в виду, что некоторые методы (например, методы на основе диоксида кремния) могут быть запатентованы.

3.2 Экстракция ДНК

Основной принцип выделения присутствующей в пробе ДНК заключается в одновременной или последующей очистке ДНК от ингибиторов полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Методы выделения и очистки ДНК изложены в приложении А. Выбор метода основывается на опыте пользователя с учетом области применения и примеров продуктов, которые указаны в каждом методе.

Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующем продукте, подлежащем исследованию.

3.3 Количественная оценка содержания ДНК

Количественная оценка экстрагированной ДНК может потребоваться для последующего ПЦР-анализа.

Такая оценка может выполняться либо физическими (например, измерением поглощения при специфической длине волны), физико-химическими (например, применением интеркалирующих или связующих агентов, обладающих флюоресцентными свойствами), ферментативными (например, биолюминесцентным обнаружением) методами, либо путем количественной ПЦР. Последний метод применяется для продуктов сложного состава, проб с низким содержанием ДНК или проб, в которых ДНК подверглась деградации.

Существует несколько методов, применяемых для определения количества ДНК, присутствующей в растворе. Эти методы изложены в приложении В.

Выбор наиболее подходящего метода осуществляется пользователем в зависимости от количества и качества ДНК, подлежащей количественному определению, а также от продукта, из которой была экстрагирована ДНК.

Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующем продукте.

4 Общие требования к лаборатории

Вследствие воздействия пыли и распыляемых аэрозолей может происходить случайная контаминация ДНК, поэтому организация рабочих мест в лаборатории основывается на строгом соблюдении:

- последовательности всех установленных методологических этапов, используемых для получения промежуточных и конечных результатов;

- принципа "прямого потока" при обращении с пробами.

Использование последнего принципа гарантирует, что ДНК, подлежащая анализу, и полученная в результате ПЦР амплифицированная ДНК, остаются физически разделенными.

Дополнительные требования к лабораториям приведены в ИСО 24276.

5 Методика

5.1 Приготовление проб для анализа

5.1.1 Общие положения

Специфические параметры анализируемого продукта (например, влажность) и его обработка могут влиять на количество и качество ДНК, выделяемой из анализируемого продукта. В связи с этим рабочие характеристики применяемого метода экстрагирования ДНК зависят от конкретного анализируемого продукта.

Необходимо принять соответствующие меры, чтобы гарантировать, что проба для анализа является представительной, отобранной из лабораторной пробы.

Проба для анализа должна быть достаточной(го) массы (объема) и содержать достаточное количество молекул ДНК для обеспечения представительности лабораторной пробы.

Исходя из практических и технических соображений не рекомендуется, чтобы масса пробы для анализа превышала 2 г.

Любые ограничения, связанные с массой (объемом) пробы для анализа, не позволяющие рассматривать ее как представительную, должны быть учтены при интерпретации аналитических результатов и указаны в протоколе испытаний.

Методы экстракции ДНК, приведенные в приложении А, устанавливают массу пробы для анализа от 200 до 500 мг, что обычно является приемлемым для продукции с высоким содержанием ДНК (молотое зерно, мука). Однако некоторые продукты содержат очень малое количество ДНК или деградировавшую ДНК, в связи с этим указанная масса пробы не позволит выделить достаточное для анализа количество ДНК. В таких случаях масса (объем) пробы может быть увеличена.

Выделение ДНК должно выполняться не менее чем из двух параллельных проб одной и той же продукции.

Хранение стандартных образцов, лабораторных проб и анализируемых проб должно соответствовать требованиям ИСО 24276 и быть организовано таким образом, чтобы анализируемые биохимические параметры были сохранены (подробнее см. ИСО/МЭК 17025).

5.1.2 Пробы

Все операции по приготовлению лабораторных проб (например, измельчение, гомогенизация, деление, высушивание) должны выполняться в соответствии с лабораторными правилами, описанными в ИСО 24276:2006 (пункт 5,3.2). При выполнении всех необходимых операций должны быть приняты меры предосторожности для защиты лабораторной пробы от загрязнения или изменения ее состава. Лабораторные пробы должны быть достаточно гомогенными перед измельчением или размолом и перед отбором анализируемой пробы.

В случае жидких проб сосуд с пробой необходимо встряхивать для обеспечения гомогенизации продукта. В случае негомогенных продуктов типа неочищенных масел необходимо убедиться, что осадок и все нерастворимые составляющие полностью удалены со стенок сосуда.

В случае твердых проб, которые не могут быть суспендированы без затруднений, лабораторная проба должна быть размолота для уменьшения размера частиц и/или облегчения экстрагируемости ДНК. В таких случаях особое внимание необходимо обратить на размер частиц. Проба для анализа, подвергаемая экстракции, должна содержать минимальное количество частиц. Необходимо, чтобы оборудование, предназначенное для дробления и измельчения проб, было легко моющимся по всей рабочей поверхности и обеспечивало требуемое количество и распределение по размерам частиц (гранулометрический состав) анализируемой пробы.

Если какие-либо компоненты лабораторной пробы были удалены до проведения экстракции ДНК, то это должно быть указано в протоколе испытаний с описанием проведенных операций.

Для твердых или пастообразных готовых пищевых продуктов с высоким содержанием липидов достаточно трудно достичь требуемого размера частиц за один этап измельчения. В таких случаях допускается перед измельчением применять дополнительные процедуры, такие как удаление липидов гексаном после промежуточного измельчения, замораживание или сублимационная сушка.

Для улучшения измельчения пастообразных или вязких продуктов в некоторых случаях можно использовать одну из следующих обработок:

- нагрев до максимальной температуры 40°С;

- растворение в соответствующей жидкости, например в воде;

- замораживание при температуре минус 20°С или ниже.

После такой обработки необходимо гомогенизировать всю лабораторную пробу. Затем необходимо отобрать две параллельные анализируемые пробы с учетом возможного проведения в дальнейшем процедур разбавления или концентрирования.

Во время проведения процедур размола и измельчения необходимо соблюдать меры, гарантирующие нагрев лабораторной пробы на минимальном уровне и не допускающие ее сильного нагревания, так как нагрев может отрицательно воздействовать на качество выделяемой ДНК.

По возможности необходимо избегать способов размола/измельчения, при которых возникает высокий риск перекрестного загрязнения (например, комбинированное использование жидкого азота и ступки, а также использование одной и той же ступки для разных образцов). Одним из основных требований является необходимость изолирования любого методологического этапа, при проведении которого происходит образование пыли, от всех других аналитических этапов и процедур.

В случае присутствия в лабораторной пробе солей, специй, сахарной пудры и/или других веществ, которые потенциально могут оказывать влияние на выделение ДНК или последующий аналитический метод, должны быть предприняты дополнительные соответствующие процедуры очистки в соответствии с используемым методом (см. приложение А).

Например, в случае образцов сложного состава целевой материал для исследования (например, панировочный слой рыбных палочек) может быть отделен от остальной части продукта для выделения ДНК.

5.2 Экстракция и очистка ДНК

5.2.1 Общие положения

При разработке методов выделения ДНК необходимо учитывать следующие требования.

Качество и выход экстрагированной нуклеиновой кислоты при использовании того или иного метода для того или иного продукта должны быть как повторяемыми, так и воспроизводимыми при условии содержания достаточного количества нуклеиновой кислоты в анализируемой пробе, из которой она была выделена.

Для получения ДНК хорошего качества рекомендуется при необходимости удалить следующие компоненты:

- полисахариды (пектин, целлюлозу, гемицеллюлозу, крахмал, загустители и т.д.) путем обработки соответствующим ферментом (например пектиназой, целлюлазой, гемицеллюлазой, -амилазой) или экстрагирования органическим растворителем (например гексадецилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ)/хлороформ);

- рибонуклеиновые кислоты (далее - РНК) и/или белки путем соответствующей обработки, например ферментативной обработки рибонуклеазой и протеиназой соответственно;

- липидные фракции путем ферментативной обработки или использования растворителей (например гексана);

- солей (например из буфера для выделения и лизиса, добавляемых в раствор на стадии осаждения), способных оказывать влияние на последующий анализ.

В частности, в случае твердых или высушенных проб объем буфера для выделения и лизиса должен быть таким, чтобы гарантировать растворение в нем ДНК.

Примечание - Очистка ДНК может выполняться различными способами, например путем фракционного осаждения с использованием таких растворителей, как фенол, хлороформ, этанол, изопропанол, и/или с использованием адсорбции на твердые матрицы (ионообменную смолу, силикагель или жидкое стекло, диатомовую землю, мембраны и т.д.). Можно объединить несколько принципов очистки ДНК. При необходимости выделение и очистка могут совмещаться путем выполнения на одном и том же этапе.

В случае использования соосадителей ДНК, например гликогена, полиэтиленгликоля (ПЭГ), транспортной РНК (т-РНК), для увеличения выхода ДНК в ходе стадий осаждения они не должны обладать нуклеазной активностью (содержать детектируемый уровень нуклеаз), содержать ингибиторы и/или конкуренты ПЦР или последовательности нуклеиновых кислот, гомологичные анализируемым последовательностям. При выделении ДНК из генетически модифицированных растений в качестве соосадителя может быть использована ДНК-носитель, например ДНК из спермы лосося или сельди.

При использовании сублимационных сушилок для высушивания осадка ДНК, полученного после стадии осаждения, необходимо учитывать риск перекрестного загрязнения.

Необходимо повторно растворяют ДНК в воде или буферном растворе для предотвращения деградации ДНК.

Пример - Для ресуспендирования или разбавления ДНК пригоден трис/ЭДТА (1 или 0,1) с 8,0 ед. рН.

При применении нового метода выделения ДНК или одного из методов, описанных в приложении А, для новых продуктов потенциальные качество и целостность выделенной ДНК с использованием выбранного метода должны быть проверены следующим образом: путем добавления в лизирующий буфер известного количества меченой ДНК вместе с пробой, из которой необходимо выделить ДНК. Если оценка нового метода производится на основании использования меченой ДНК, количество (масса) которой известно, или подсчета количества копий определенной последовательности ДНК, необходимо оценить возможную перекрестную реактивность такой ДНК с ДНК, содержащейся в исследуемой пробе.

Примечание - Использование меченой ДНК является наилучшим приближением к реальной ситуации, когда предполагается образование комплекса ДНК данного продукта с другими компонентами (например белками). Такой метод также может использоваться для оценки присутствия растворимых ингибиторов ПЦР в выделенной ДНК (см. ИСО 24276, ИСО 21569 и ИСО 21570).

Однако меченая ДНК может привести к ложному представлению о степени извлечения ДНК, так как она может гораздо легче выделяться из продукта, чем целевая ДНК.

5.2.2 Процедуры контроля

Процедуры контроля, подлежащие использованию при проведении анализа, описаны в таблице 1 ИСО 24276. Они должны включать, как минимум, отрицательный и положительный контроли экстрагирования, а также могут включать контроль окружающей среды.

5.2.3 Контроль чистоты ДНК. Внутренний контроль ПЦР

При отработке нового метода экстрагирования присутствие ингибиторов ПЦР в экстрагированной ДНК может быть оценено с помощью внесения чужеродной ДНК (внутренний стандарт, см. ИСО 24276, ИСО 21569 и ИСО 21570). Количество добавленной ДНК не должно превышать максимальный уровень, допустимый для применяемой системы ПЦР, и должно содержать установленное число копий последовательности целевой ДНК. Это число необходимо определять отдельно для каждой последовательности целевой ДНК и указывать как кратное нижнему пределу обнаружения. В идеальном случае концентрация целевой ДНК в ПЦР при положительном контроле должна соответствовать чувствительности, требуемой для анализа. При использовании в качестве положительного контроля ПЦР высококонцентрированной клонированной целевой последовательности ДНК необходимо соблюдать осторожность из-за высокой опасности перекрестного загрязнения. По возможности нуклеиновые кислоты положительного контроля должны максимально соответствовать параметрам нуклеиновых кислот исследуемого материала.

5.3 Количественная оценка экстрагированной ДНК

5.3.1 Общие положения

Качество, целостность и количество экстрагированной нуклеиновой кислоты оказывают влияние на рабочие характеристики аналитического метода и, следовательно, на полученные аналитические результаты. Предел обнаружения конкретного метода может, таким образом, зависеть от количества использованных нуклеиновых кислот. Необходимо определить общее количество ДНК, которое используется в ПЦР, равно как и общее количество ДНК целевого таксона, так как ДНК нецелевого таксона может повлиять на эффективность ПЦР.

Количественная оценка ДНК помогает:

- при определении эффективности различных методов выделения ДНК для определенного вида объектов (повторяемость);

- измерении концентрации нуклеиновых кислот перед анализом.

5.3.2 Область применения

Каждый метод количественной оценки должен применяться в пределах его динамического диапазона с учетом уровня точности измерения.

5.3.3 Количественные стандарты

Точность методов количественной оценки зависит от стандартов нуклеиновых кислот, используемых для калибровки метода.

При использовании метода, чувствительного к размеру и/или качеству фрагментов нуклеиновой кислоты, должны применяться стандарты нуклеиновой кислоты, которые соответствуют ожидаемым размеру и/или качеству нуклеиновой кислоты, экстрагированной из пробы.

Используемый контрольный материал (национальный или международный стандартный образец) должен обеспечивать проявление заявленных характеристик по непрерывной цепи при сравнении со стандартами национального или международного эталона (см. Руководство ИСО 30).

При применении метода с использованием интеркалирующих (встраивающихся в ДНК) агентов необходимо применять стандарт ДНК с высокой молекулярной массой, если количественной оценке подлежит ДНК с высокой молекулярной массой. Соответственно необходимо использовать стандарт ДНК с низкой молекулярной массой при количественной оценке ДНК с низкой молекулярной массой. Нуклеиновая кислота с высокой молекулярной массой, как правило, содержит некоторое количество фрагментов с более низкой молекулярной массой. Это означает, что многие методы количественной оценки ДНК имеют определенную степень неточности, которую необходимо учитывать при оценке результатов.

Примечание - Кроме того, в зависимости от исследуемого материала и применяемого метода выделения некоторая часть ДНК может быть извлечена в виде одноцепочечной ДНК (которая имеет гораздо более низкую способность к интеркаляции), что приводит к занижению общего содержания ДНК. С другой стороны, одноцепочечная ДНК также хорошо обнаруживается путем физических измерений.

Для построения калибровочного графика требуется не менее трех точек, предпочтительно в нескольких повторностях. Количество стандартной ДНК, использованной для каждой точки калибровочного графика, зависит от чувствительности метода и динамического диапазона измерений.

5.4 Стабильность выделенной ДНК

Выделенная из пробы ДНК должна храниться в условиях, которые обеспечивают ее стабильность для проведения последующих анализов.

Следует избегать многократного замораживания и оттаивания растворов ДНК.

6 Оценка результатов

Применяемый метод экстракции ДНК должен обеспечивать получение нуклеиновой кислоты, качество и количество которой соответствуют требованиям последующих анализов.

Качество выделенных нуклеиновых кислот должно быть удостоверено соответствующим аналитическим методом с регистрацией и оценкой параметров, аналогичных используемым при предстоящем анализе (например, если анализ, который будет выполнен, это ПЦР, качество выделенной ДНК должно быть оценено с использованием соответствующего ПЦР-контроля).

Дополнительные параметры для оценки совместимости метода указаны в ИСО 21569, ИСО 21570 и ИСО 24276.

7 Протокол испытаний

В случае представления протокола испытаний в соответствии с ИСО 24276 в него должна быть включена следующая дополнительная информация о деятельности лаборатории:

- описание происхождения проб для анализа и предварительной обработки пробы перед экстракцией нуклеиновой кислоты;

- масса проб для анализа, используемых для экстракции нуклеиновой кислоты;

- используемый метод экстракции нуклеиновой кислоты;

- любые нетипичные ситуации, наблюдаемые во время проведения испытаний;

- любая операция, не указанная в методе или рассматриваемая как необязательная, которая может оказать влияние на результаты;

- оценка результатов;

- персонал.

Обработка и хранение исходных данных изложены в ИСО/МЭК 17025.

_____________________________

*(1) Vortex - это пример коммерчески доступного оборудования, пригодного для использования с описываемым методом. Эта информация приводится исключительно для информации пользователей настоящего стандарта и ни при каких условиях не может служить рекомендацией или одобрением конкретного типа оборудования. Допускается использование аналогичного оборудования, при условии, что оно позволяет получать такие же результаты.

*(2) Повторяемость может зависеть от партии продукта и/или технологии его получения. В некоторых случаях ДНК не может быть обнаружена или она подверглась расщеплению таким образом, что результаты ПЦР оказываются ниже предела обнаружения метода независимо от используемых праймеров и/или протоколов ПЦР. Это может быть причиной низкой воспроизводимости результатов между лабораториями.

*(3) Mini-BeadBeater - это пример коммерчески доступного оборудования Biospec products, пригодного для использования с описываемым методом. Эта информация приводится исключительно для информации пользователей настоящего стандарта и ни при каких условиях не может служить рекомендацией или одобрением конкретного типа оборудования. Допускается использование аналогичного оборудования, при условии, что оно позволяет получать такие же результаты.

*(4) SIGMA Р-5288 - пример подходящего реактива, имеющегося в продаже. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательность его применения. Могут использоваться эквивалентные реактивы, если их применение приводит к тем же результатам.

*(5) SIGMA S-5631 - пример подходящего коммерческого реактива. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательное использование только этого реактива. Могут использоваться эквивалентные реактивы, если их применение приводит к тем же результатам.

*(6) Пример коммерческого продукта. Эта информация приводится исключительно для удобства пользователей настоящего стандарта и не может служить рекомендацией или принуждением к использованию со стороны ИСО. Допускается использование аналогичного продукта, при условии, что он позволяет получать такие же результаты.

*(7) Колонка и набор представляют собой пример коммерческих продуктов, подходящих для использования. Эта информация приводится исключительно для удобства пользователей настоящего стандарта и не может служить рекомендацией или принуждением к использованию со стороны ИСО. Допускается использование аналогичного продукта, при условии, что он позволяет получать такие же результаты.

*(8) Eppendorf Thermomixer - пример подходящего коммерческого продукта. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательное использование только этого оборудования. Может использоваться эквивалентное оборудование, если его применение приводит к тем же результатам.

*(9) Пример подходящего реактива, имеющегося в продаже. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательность его применения. Могут использоваться эквивалентные реактивы, если их применение приводит к тем же результатам.

*(10) Колонки MicroSpin S-300 HR и набор Quant-iT PicoGreen dsDNA Quantitation Kit являются примерами подходящего коммерческого продукта. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательное использование только этих приборов и реагентов. Могут использоваться эквивалентные приборы и реагенты, если их применение приводит к тем же результатам.

_____________________________

* Эти продукты имеются в Sigma как D-7290 и D-1501 соответственно. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательное применение данных реактивов. Могут использоваться эквивалентные реактивы, если их применение приводит к тем же результатам.

Библиография

[1]	Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K.: Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons (1988) (ISBN 0-471-50338-X)
	(Современные методы в молекулярной биологии)
[2]	Sambrook J., Russel D. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001) (ISBN 0-87969-576-5)
	(Молекулярное клонирование. Лабораторное руководство)
[3]	Sambrook J., Frltsch E.F., Maniatis, Т., eds. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition, 1989 [Superseded by Green M.R., Sambrook J., eds. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 4th Edition, 2012]
	(Молекулярное клонирование. Лабораторное руководство)
[4]	Prokisch J., Zeleny R., Trapmann S., Le Guem L, Schimmel H., Kramer G.N., Pauwels J. Estimation of the minimum uncertainty of DNA concentration in a genetically modified maize sample candidate certified reference material. Fresenuis J. Analy. Chem. (2001) 370(7) pp. 935-9
	(Оценка минимальной неопределенности измерений концентрации ДНК в пробе генетически модифицированной кукурузы, аттестуемой в качестве стандартного образца)
[5]	Sambrook J., Fritsch E.F and Maniatis Т. In: Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Vol. 3, Appendix E.3, Purification of nucleic acids. (1987) (ISBN 0-87969-309-6)
	(Молекулярное клонирование. Лабораторное руководство)
[6]	Detection of a genetic modification of Lactobacillus cutvatus in uncooked-meat sausage by amplification of the modified DNA sequence using the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR productwith a DNA probe. L 08.00-44 In: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods. Federal Health Office, September 1998, revised version: state 05/2001; Berlin, Kln, Beuth Verlag GmbH
	(Обнаружение генетической модификации Lactobacillus curvatus в колбасе из мясного фарша, не подвергавшегося тепловой обработке, путем амплификации модифицированной последовательности ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации продукта ПЦР с образцом ДНК. L 08.00-44)
[7]	Straub J.A., Hertel С. and Hammes W.P. The fate of recombinant DNA in thermally treated fermented sausages. Eur. Food Res. Technol. (1999) 210, pp. 62 - 67
	(Судьба рекомбинированной ДНК в колбасах, подвергнутых ферментации и термической обработке)
[8]	Straub J.A., Hertel С. and Hammes W.P. A23S rDNA-targeted polymerase chain reaction-based system for detection of Staphylococcus aureus in meat starter cultures and dairy products. J. Food Protect (1999) 62, pp. 1150 - 1156
	(Система обнаружения Staphylococcus aureus в заквасочных культурах мясной продукции и в молочной продукции, основанная на обнаружении 23S рДНК путем полимеразной цепной реакции)
[9]	Lick S., Keller М., Bockelmann W, Heller K.J. Optimized DNA extraction method for starter cultures from yoghurt. MilkSci. Int. (1998) 51, pp. 183 - 186
	(Оптимизированный метод экстрагирования ДНК из заквасочных культур йогурта)
[10]	Lick S., Heller K.J. Quantitation by PCR of yoghurt starters in a model yoghurt produced with a genetically modified Streptococcus thermophilus. Milk Sci. Int. (1998) 53, pp. 671 - 675
	(Количественное определение методом ПЦР заквасочных культур в йогурте, приготовленном с использованием генетически модифицированного Streptococcus thermophilus)
[11]	Detection of a genetic modification of Streptococcus thermophilus in yoghurt by amplification of the modified DNA sequence by means of the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a DNA probe. L 02.02-4 In: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods. Federal Health Office, September 1998, revised version: state 05/2001; Berlin, Kln, Beuth Verlag GmbH
	(Обнаружение генетической модификации Streptococcus thermophilus в йогурте путем амплификации модифицированной последовательности ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации продукта ПЦР с пробой ДНК. L 02.02-4)
[12]	Lick S., Keller М., Krusch U., Heller K.J. Identification of starter cultures in thermally treated plain yoghurt using geneprobes and PCR. J. Dairy Res. (1998) 63, pp. 607 - 613
	(Идентификация заквасочных культур в обычном йогурте, подвергнутом термической обработке, используя генопробы и ПЦР)
[13]	Van Vaerembergh В., Grootaert В., Moens W. Validation of a method for the preparation of fungal genomic DNA for Polymerase chain reaction (PCR) and Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD). J. Mycol. Md. (1995) 5, pp. 133 - 139
	[Подтверждение эффективности метода подготовки геномной ДНК грибков к полимеразной цепной реакции (ПЦР) и случайной амплификации полиморфной ДНК (RAPD)]
[14]	Haynes K.А., Westerneng T.J., Fell J.W., Moens W. Rapid detection and identification of pathogenic fungi by polymerase chain amplification of large subunit ribosomal DNA. J. Med. & Vet. Mycology (1995) 33, pp. 319 - 325
	(Быстрое обнаружение и идентификация патогенных грибов путем амплификации больших субъединиц рибосомной ДНК методом полимеразной цепной реакции)
[15]	Guillaume G.: Verbrugge D., Chasseur-Libotte M.-L., Moens W., Collard, J.-M.: PCR typing of tetracycline determinants (Tet A-E) in Salmonella enterics Hadar and in the microbial community of activated sludges from hospital and urban wastewater treatment facilities in Belgium. In: FEMS Microbiology Ecology, 2000, 32, pp. 77 - 85
	(Типирование определителей тетрациклина (Tet A-E) методом ПЦР в Salmonella enterica Hadar и в микробном сообществе активного ила, отобранного на станциях по очистке сточных вод больниц и городских предприятий Бельгии)
[16]	Pedersen LH., Skouboe P., Boysen M., Soule J., Rossen L: Detection of Penicillium species in complex food samples using the polymerase chain reaction, Int. J. Food Microbiol., 1997, 35(2), pp. 169-77
	(Обнаружение видов Penicillium в пробах пищевых продуктов сложного состава, используя полимеразную цепную реакцию)
[17]	Ann S.J., Costa J., Emanuel J.R. PicoGreen quantitation of DNA: Effective evaluation of samples pre- or post-PCR. Nucleic Acids Res. 1996, 13 pp. 2623 - 2625
	(Количественное определение ДНК с помощью PicoGreen: эффективная оценка образцов до и после ПЦР)
[18]	Haugland R.A., Heckman J.L., Wymer L.J. Evaluation of different methods for the extraction of fungal conidia by quantitative competitive PCR analysis. In: J.Microbiol. Methods, 1999, 37(2), pp. 165 - 176
	(Оценка различных методов экстрагирования конидий грибов путем количественного конкурентного ПЦР-анализа)
[19]	Kim C.S., Lee C.Н., Shin J.S., Chung Y.S., and Hyung N.I. A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP. Nucleic Acids Research, 1997, 25, No. 5, pp. 1085 - 1086
	(Простой и быстрый метод выделения высококачественной геномной ДНК из плодовых и хвойных деревьев с использованием ПВП)
[20]	Berthelet М., Whyte L.G., and Greer C.W.: Rapid, direct extraction of DNA from soils for PCR analysis using polyvinylpolypyrrolidone spin columns. FEMS Microbiology Letters, 1996, 138, pp. 17 - 22
	(Быстрая, прямая экстракция ДНК из почв для выполнения анализа ПЦР с использованием вращающейся колонки из поливинилполипирролидона)
[21]	Petit F., Craquelin S., Guespin-Michel J., and Buffet-Janvresse C. Nucleic acid extraction from polluted estuarine water for detection of viruses and bacteria by PCR and RT-PCR analysis. Res. Microbiol., 1999, 150, pp. 143 - 151 (Выделение нуклеиновых кислот из загрязненной речной воды для обнаружения вирусов и бактерий путем анализа ПЦР и ПЦР в реальном времени)
[22]	Watson R.J., and Blackwell В.: Purification and characterization of a common soil component which inhibits the polymerase chain reaction. Can. J. Microbiol., 2000, 46, pp. 633 - 642 (Очистка и охарактеризование общего компонента почв, который ингибирует полимеразную цепную реакцию)
[23]	Griffiths R.J., Whiteley A.S., O'Donnell A.G., and Bailey M.J.: Rapid Method for Coextraction of DNA and RNA from Natural Environments for Analysis of Ribosomal DNA- and rRNA-Based Microbial Community Composition. Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66, No. 12, pp. 5488 - 5491
	(Экспресс-метод совместной экстракции ДНК и РНК из проб естественной окружающей среды для анализа состава микробных сообществ на основе метода рибосомной ДНК и рРНК)
[24]	Rogers S.O. and Bendich A.J. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual A6 (1988) pp. 1 - 10 (Выделение ДНК из растительных тканей. Руководство N А6 по молекулярной биологии растений)
[25]	Analysis of foodstuffs: Detection of a genetic modification of soya beans by amplification of the modified DNA sequence using the polymerase chain reaction (PCR) and hybridisation of the PCR product with a DNA probe. L 23.01.22-1, March 1998. In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG; Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegen-stnden/BgVV (In: Official Collection of methods under article 35 of the German Federal Food Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco prod-ucts, cosmetics and commodity goods/BgVV). March 1998 Bd. 1 1999-03 Vol. 1) Berlin, Kln: Beuth Verlag GmbH (Анализ пищевой продукции. Обнаружение генетической модификации сои путем амплификации модифицированной последовательности ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации продукта ПЦР с образцом ДНК. L23.01.22-1)
[26]	Analysis of foodstuffs: Detection of a genetic modification of potatoes by amplification of the modified DNA sequence using the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a DNA probe. L 24.01-01, February 1996, revised in January 1997. In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG; Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenstnden/BgVV (In: Official Collection of methods under article 35 of the German Federal Food Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/BgVV). Jan 1997 Bd. 1 (1997-01 Vol. 1) Berlin, Kln: Beuth Verlag GmbH (Анализ пищевой продукции. Обнаружение генетической модификации картофеля путем амплификации модифицированной последовательности ДНК, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и гибридизацию продукта ПЦР с образцом ДНК. L 24.01.01)
[27]	Analysis of foodstuffs: Detection of a genetic modification of tomatoes bean by amplification of the modified DNA sequence by means of the polymerase chain reaction (PCR) and hybridisation of the PCR product with a DNA probe. L 25.03.01-1, November 1999. In: Amtliche Sammlung von Unter-suchungsverfahren nach § 35 LMBG; Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenstnden/BgVV (In: Official Collection of methods under article 35 of the German Federal Food Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/BgVV). Nov 1999 Bd. 1 (1999-11 Vol. 1) Berlin, KIn: Beuth Verlag GmbH (Анализ пищевой продукции. Обнаружение генетической модификации томатов путем амплификации модифицированной последовательности ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации продукта ПЦР с образцом ДНК. L 25.03.01-1)
[28]	Boyle J.S. and Lew А.М. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purification, Trends in Genetics, Vol. 11(1), p. 8, 1995 (Недорогая альтернатива микропористому стеклу для очистки ДНК)
[29]	Brodmann P., Eugster A., Hubner Ph., Meyer R., Pauli U., Vgeli U. and Lthy J. Nachweis gen-technisch vern-derter Roundup Sojabohnen mittels der Polymerase - Kettenreaktion (PCR), Methodenvorprfung im Rahmen der Subkommission 29a des Schwelzerlschen Lebensmittelbuches. Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg. 1997, 88, pp. 722 - 731 [Обнаружение генетически модифицированной сои (раундап-реди) с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР)]
[30]	Hubner P., Studer Е. and Lathy J. Quantitative Competitive PCR for the Detection of Genetically Modified in Food, Food Control, 1999, 10, pp. 353 - 358
	(Количественный конкурентный анализ ПЦР для обнаружения генетически модифицированных организмов в пищевой продукции)
[31]	Hbner P., Studer Е. and Luthy J. Quantitation of genetically modified organisms in food. Nat Biotechnol. 1999, 17, pp. 1137 - 1138
	(Количественная оценка генетически модифицированных организмов в пищевой продукции)
[32]	Melzak К.А., Sherwood C.S., Turner R.F.B. and Haynes C.A. Driving Forces for DNAA dsorption to Silica in Perchlorate Solutions. J. Colloid and Interface Science, 1996, 181, pp. 635 - 644
	(Адсорбция ДНК диоксидом кремния в перхлоратных растворах)
[33]	Patents: ЕР 0389063, USP5, 234, 809
	(Патенты: ЕР 0389063, USP5, 234, 809)
[34]	Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T, In: Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed., Vol. 5, Appendix В 16, 1989 Proteinase-K. (ISBN 0-87969-509-6)
	(Молекулярное клонирование. Лабораторное руководство. Протеиназа-К)
[35]	Swiss Food Manual, Chapter 52B, Section 1 to 5. (2000) Eidgenssische Drucksachen und Materialzentrale, CH-5005 Bern, available on CD.
	(Швейцарское пособие по пищевой продукции, глава 52В, разделы 1 - 5)
[36]	Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. In: Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed., Vol. 5, Appendix 5, (1989) Quantitation of DNA and RNA (ISBN 0-88989-509-8)
	(Молекулярное клонирование. Лабораторное руководство. Количественная оценка ДНК и РНК)
[37]	Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. In: Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd ed., Vol. 1, Chapter 6, (1989) Gel electrophoresis of DNA (ISBN 0-88989-509-8)
	(Молекулярное клонирование. Лабораторное руководство. Электрофорез ДНК в геле)
[38]	Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. In: Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd ed., Vol. 1, Section 6.5, table 8.1 (1989) (ISBN 0-88989-509-8)
	(Молекулярное клонирование. Лабораторное руководство)
[39]	ISO/IEC 17025:2005
	General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
	(Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий)
[40]	ISO 21569:2005
	Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Qualitative nucleic acid based methods
	(Продукты пищевые. Методы анализа обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Качественные методы на основе нуклеиновых кислот)
[41]	ISO 21570:2005
	Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods
	(Продукты пищевые. Методы анализа обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Количественные методы на основе нуклеиновых кислот)
[42]	ISO Guide 30:1992
	Terms and definitions used in connection with reference materials
	(Термины и определения, используемые в области стандартных образцов)
[43]	ISO 5725-1
	Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 1: General principles and definitions
	[Точность (подлинность и прецизионность) методов измерения и результатов - часть 1. Общие принципы и определения]
[44]	WurzA., Ruggeberg Н., Brodmann P., Waiblinger H.-U., Pietsch K. DNA-Extraktionsmethode fr den Nachweis gentechnisch vernderter Soja in Sojalecithin [DNA extraction method for the detection of genetically modified soy in soy lecithin]. Dtsch. Lebensm. Rundsch, 1998, 94 pp. 159 - 161
	[Метод экстракции ДНК для обнаружения генетически модифицированной сои в соевом лецитине]
[45]	Waiblinger H.-U., Ernst В., Graf N., Pietsch K. Ringtrial validation of a method for the extraction of DNA from soy lecithins. J. Verbrauch. Lebensm, 2007, 2 pp. 113 - 115
	[Кольцевое подтверждение эффективности метода экстракции ДНК из соевых лецитинов]
[46]	Horwitz W. Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies. Pure Appl. Chem. 1995,67, pp. 31 - 343
	[Протокол для планирования, руководства и интерпретации исследований рабочих характеристик методов]