Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 56236-2014 (ИСО 6341:2012) "Вода. Определение токсичности по выживаемости пресноводных ракообразных Daphnia magna Straus" (утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 17 ноября 2014 г. N 1627-ст)

Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 56236-2014 (ИСО 6341:2012)
"Вода. Определение токсичности по выживаемости пресноводных ракообразных Daphnia magna Straus"
(утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 17 ноября 2014 г. N 1627-ст)

Water. Determination of toxicity by survival of freshwater crustaceans Daphnia magna Straus

Дата введения - 1 января 2016 г.

Введен впервые.

ГАРАНТ:

Курсив в тексте не приводится

Предисловие

1 Подготовлен Федеральным государственным унитарным предприятием "Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии" совместно с Обществом с ограниченной ответственностью "Протектор" на основе собственного аутентичного перевода на русский язык стандарта, указанного в пункте 4.

2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 343 "Качество воды".

3 Утвержден и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от "17" ноября 2014 г. N 1627-ст.

4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 6341:2012 "Качество воды. Обнаружение угнетения подвижности Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Тест на острую токсичность" (ISO 6341:2012 "Water quality - Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Acute toxicity test") путем:

- введения дополнительных положений, фраз и слов в текст настоящего стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделенных в тексте настоящего стандарта курсивом, за исключением наименований тест-организмов;

- исключения:

- термина "Контроль партии", так как термин является самоопределяющимся.

- второго и третьего абзацев подраздела 6.3 и справочного приложения А в части применения культивационной среды Элендта М4 и способа ее приготовления, указанного в приложении А, в связи с ограниченной возможностью применения этой среды для анализа проб, содержащих металлы.

Текст международного стандарта не вошедший в настоящий стандарт приведен в дополнительном приложении ДА.

- изменения структуры. Сравнение структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного стандарта приведено в дополнительном приложении ДБ;

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2012 (подраздел 3.5).

5 Введен впервые.

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на природные пресные воды (поверхностные и подземные), питьевые воды (централизованных систем и нецентрализованного питьевого водоснабжения), сточные воды (в том числе очищенные) при минерализации не более 6,0 и устанавливает методы лабораторного биологического тестирования (далее - тестирование) для определения их токсичности с использованием пресноводных ракообразных Daphnia magna Straus ("далее - тест-организмов):

- по выживаемости тест-организмов при тестировании в условиях переменного воздействия света и постоянной температуры (метод А);

- по иммобилизации (угнетению подвижности) тест-организмов при тестировании в условиях переменного воздействия света и постоянной температуры (метод В);

Методы применяют также для определения токсичности растворимых в воде веществ, отработанных буровых растворов, водных вытяжек донных отложений, твердых промышленных отходов, грунтов и почв.

Методы позволяют определять токсичность исследуемых объектов и следующие токсикологические показатели:

- среднюю эффективную кратность разбавления () пробы, вызывающую гибель или иммобилизацию 50% тест-организмов, а также безвредную кратность разбавления пробы (), вызывающую отклонение тест-параметров - выживаемости или иммобилизации - за 48 ч (96 ч) не более 10% относительно контрольной пробы;

- среднюю эффективную концентрацию () растворов веществ, вызывающую гибель или иммобилизацию 50% тест-организмов, и безвредную концентрацию () растворов веществ, вызывающую отклонение тест-параметров - выживаемости или иммобилизации - за 48 ч не более 10% относительно контрольной пробы.

При определении токсичности анализируемых объектов с минерализацией выше 6,0 испытания проводят по ГОСТ 31959.

Примечания

1 При определении токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб природных, питьевых и сточных вод, отработанных буровых растворов, водных вытяжек твердых промышленных отходов, донных отложений, грунтов и почв по методу А устанавливают продолжительность тестирования 96 ч.

2 При определении токсичности и токсикологических показателей проб объектов исследования по методу В устанавливают продолжительность тестирования 48 ч.

3 Среднюю эффективную кратность разбавления () за 96 ч тестирования обозначают как 96 ч , среднюю эффективную концентрацию () за 48 ч тестирования - как 48 ч .

4 Тестирование должен выполнять обученный персонал.

5 Настоящий стандарт не предусматривает ознакомление персонала со всеми проблемами безопасности, связанными с его использованием. Пользователь стандарта несет ответственность за обеспечение соответствующих требований стандарта при проведении тестирования.

В помещении лаборатории, где проводят тестирование:

- окружающая среда не должна содержать пара или пыли, токсичной для тест-организмов;

- температура окружающего воздуха должна быть (202)°С;

- относительная влажность воздуха должна быть не более 80%;

- атмосферное давление должно быть 84 - 106 кПа (630 - 800 мм рт.ст.);

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 17.1.5.01-80 Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору проб донных отложений водных объектов для анализа на загрязненность

ГОСТ 17.1.5.05-85 Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору проб поверхностных и морских вод, льда и атмосферных осадков

ГОСТ 17.4.3.01-83 Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб

ГОСТ 17.4.4.02-84 Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического и гельминтологического анализа

ГОСТ 112-78 Термометры метеорологические стеклянные. Технические условия

ГОСТ 612-75 Реактивы. Марганец (II) хлористый 4-водный. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ISO 1042-83, ISO 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2493-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4147-74 Реактивы. Железо (III) хлорид 6-водный. Технические условия

ГОСТ 4148-78 Реактивы. Железо (II) сернокислое 7-водное. Технические условия

ГОСТ 4174-77 Реактивы. Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия

ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

ГОСТ 4201-79 Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия

ГОСТ 4217-77 Реактивы. Калий азотнокислый. Технические условия

ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия

ГОСТ 4234-77 Реактивы. Калий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4461-77 Реактивы. Кислота азотная. Технические условия

ГОСТ 4523-77 Реактивы. Магний сернокислый 7-водный. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 12071-2000 Грунты. Отбор, упаковка, транспортирование и хранение образцов

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 19126-2007 Инструменты медицинские металлические. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 27065-86 Качество вод. Термины и определения

ГОСТ 27753.1-88 Грунты тепличные. Методы отбора проб

ГОСТ 27753.2-88 Грунты тепличные. Метод приготовления водной вытяжки

ГОСТ 28168-89 Почвы. Отбор проб

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-1981) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть I. Общие требования

ГОСТ 30416-2012 Грунты. Лабораторные испытания. Общие положения

ГОСТ 31861-2012 Вода. Общие требования к отбору проб

ГОСТ Р 56237-2014 (ИСО 5667-5:2006) Вода питьевая. Отбор проб

ГОСТ 31959-2012 (ИСО 14669:1999) Вода. Методы определения токсичности по выживаемости морских ракообразных

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 53857-2010 Классификация опасности химической продукции по воздействию на окружающую среду. Основные положения

ГОСТ Р 53858-2010 Классификация опасности смесевой химической продукции по воздействию на окружающую среду. Основные положения

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 27065, а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 контрольный раствор (control solution): Культивационная вода, используемая для выращивания тест-организмов.

3.2 иммобилизация (immobility): Неспособность тест-организмов плавать в течение 15 с, после легкого встряхивания, даже если они все еще могут двигать свои антенны.

3.3 (): Эффективная концентрация, которая вызывает гибель или иммобилизацию 50% тест-организмов по окончании тестирования.

3.4 неонат (neonate): Новорожденный или только что вылупившийся тест-организм.

Примечание - В настоящем стандарте новорожденным считают организм младше 24 ч.

3.5 партия проб (test party): Серия повторностей.

3.6 Эффективная кратность разбавления; ЭКР (effective multiplicity of dilution): Кратность разбавления анализируемой пробы (например, сточной воды) культивационной водой (водой для разбавлений) при подготовке анализируемой пробы, которая приводит к заданному проценту гибели или иммобилизации тест-организмов за 48 или 96 ч относительно контрольной пробы.

3.7 безвредная кратность разбавления: Кратность разбавления анализируемой пробы, при которой отклонение тест-параметров - выживаемости или иммобилизации за 48 ч (96 ч) составляет не более 10% относительно контрольной пробы.

3.8 токсичность (toxicity): Свойство воды (водной вытяжки, раствора вещества), обусловленное наличием в ней токсических веществ, характеризующих способность воды нарушать жизнедеятельность тест организмов.

4 Отбор проб

4.1 Отбор проб природной, питьевой и сточной воды проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 31861, ГОСТ Р 56237, [1], [2] и [3], при этом объем пробы воды должен быть не менее 500 .

Условия и сроки хранения отобранных проб - по ГОСТ 31861 и ГОСТ Р 56237.

Примечание - Если отобранную пробу воды перед тестированием требуется отстаивать или фильтровать, то отстаивание и фильтрование должны предшествовать ее замораживанию.

4.2 Отбор проб донных отложений проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.1.5.01 массой не менее 2 кг.

Срок хранения проб донных отложений - не более 12 ч после их отбора до проведения тестирования.

Допускается хранение отобранных проб до проведения их тестирования:

- не более 48 ч - при температуре от 0°С до 4°С;

- не более 2 мес при температуре минус 18°С.

4.3 Отбор проб отработанных буровых растворов проводят в соответствии с требованиями технической документации предприятия, на котором образуются отработанные буровые растворы, массой не менее 5,0 кг, при этом под крышкой емкости, в которую отобрана проба, должен оставаться слой воздуха высотой 2 см.

Отобранные пробы отработанных буровых растворов хранят в емкостях - холодильниках при температуре от 0°С до 4°С не более 2 мес.

После вскрытия емкостей - холодильников для подготовки проб отработанных буровых растворов к тестированию срок хранения не должен превышать 14 сут.

4.4 Отбор проб твердых промышленных отходов проводят в соответствии с требованиями технической документации предприятия, на котором образуется отход, массой не менее 2 кг.

Срок хранения отобранных проб твердых промышленных отходов в емкостях с притертой или плотно закрытой крышкой при температуре от 0°С до 4°С - не более 7 сут.

4.5 Отбор проб веществ, условия и сроки их хранения должны соответствовать требованиям стандартов и другой документации на конкретную продукцию (группу однородной продукции).

4.6 Отбор проб грунтов проводят по ГОСТ 12071, ГОСТ 27753.1; почв - по ГОСТ 17.4.3.01, ГОСТ 17.4.4.02, ГОСТ 28168, [3], массой не менее 2 кг.

Срок хранения отобранных проб грунтов (почв) в емкостях с притертой или плотно закрытой крышкой при температуре от 0°С до 4°С - не более 7 сут.

4.7 Для отбора проб природной воды, отработанных буровых растворов, донных отложений используют емкости из полиэтилена, полиэтилентерефталата или политетрафторэтилена, а при наличии в воде нефтепродуктов, поверхностно-активных веществ и пестицидов - емкости из темного стекла.

Для отбора проб сточных вод, твердых промышленных отходов, грунтов и почв используют емкости из темного стекла или нержавеющей стали, при этом не допускается использовать емкости с хромовым покрытием.

Для отбора проб веществ используют емкости из полиэтилена, полиэтилентерефлата, политетрафторэтилена или темного стекла.

4.8 Сроки и условия хранения отобранной пробы указывают в протоколе испытаний.

4.9 Консервацию отобранных проб не проводят.

5 Метод А

5.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в регистрации выживаемости пресноводных ракообразных тест-организмов Daphnia magna Straus в анализируемой пробе исследуемого объекта относительно контрольной пробы, определении ее токсичности и токсикологических показателей при тестировании в течение 48 или 96 ч.

Продолжительность тестирования 48 ч указана для определения токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб веществ.

Продолжительность тестирования 96 ч указана для определения токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб природной и сточной воды, отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов, донных отложений, грунтов и почв.

5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы, материалы

Климатостат любого типа, обеспечивающий поддержание температуры (202)°С и белое люминесцентное освещение в диапазоне 500 - 1000 лк.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ Р 53228 высокого класса точности с ценой деления (дискретностью отсчета) не более 0,01 г, максимальной нагрузкой не более 210 г.

рН-метр любого типа, обеспечивающий измерения рН в диапазоне от 3 до 10 ед. рН с пределом абсолютной допускаемой погрешности 0,05 ед. рН.

Кондуктометр любого типа, обеспечивающий измерение удельной электрической проводимости дистиллированной (деионизированной) воды в диапазоне от 0,1 до 99,9 мкСм/см с пределом абсолютной допускаемой погрешности 2,0 мкСм/см при 20°С.

Оксиметр любого типа, обеспечивающий измерения в диапазоне от 0 до 19,9 мг / (при температуре от 5 до 30°С), с допускаемой погрешностью измерения содержания кислорода не более 0,5 мг /.

Термометр лабораторный по ГОСТ 112-78 с диапазоном измерения температуры от 0°С до 50°С с ценой деления шкалы 0,5°С.

Прибор для измерения минерализации (солености) любого типа, обеспечивающий измерения в диапазоне от 0 до 100 , (например, карманный рефрактометр-солемер с автотермокомпенсацией) с допускаемой погрешностью измерения общей минерализации (солености) 1,0

Пипетки автоматические (дозаторы) любого типа вместимостью 0,1 - 0,2  с пределом допускаемой относительной погрешности измерений 1,0%.

Пипетки по ГОСТ 29227 вместимостью 1, 2, 5, 10  с ценой деления 0,1 .

Микропипетки вместимостью 0,1; 0,2  с ценой деления 0,01 .

Колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2 по ГОСТ 1770.

Колбы стеклянные (конические) лабораторные по ГОСТ 25336 вместимостью 0,25, 1 и 2 .

Микроскоп биологический типа МБС, обеспечивающий увеличение в 50 - 100 раз.

Лампа люминесцентная обеспечивающая освещение в пределах от 500 до 1000 лк Мешалка магнитная.

Устройство для встряхивания любого типа (например, орбитальный шейкер, качалка - мешалка).

Центрифуга лабораторная медицинская.

Сушильный электрический шкаф общелабораторного назначения.

Аквариумный микрокомпрессор любого типа.

Шпатели металлические по ГОСТ 19126.

Холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от минус 18°С до минус 20°С и от 2°С до 4°С.

Ступки и пестики фарфоровые по ГОСТ 9147.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Фильтры обеззоленные "белая лента".

Фильтровальная установка любого типа.

Фильтры мембранные с диаметром пор 0,45 и 3,5 мкм.

Эксикаторы по ГОСТ 25336.

Пробирки стеклянные вместимостью 10  по ГОСТ 25336.

Цилиндры вместимостью 25, 50, 100, 1000  по ГОСТ 1770 второго класса точности.

Стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 50, 100, 500, 1000  по ГОСТ 25336.

Сито с отверстиями диаметром 1 мм, 1800 - 2200 мкм.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709, или деионизированная с удельной электрической проводимостью не более 10 мкСм/см при 20°С (далее - дистиллированная вода).

Модельный токсикант - калий двухромовокислый по ГОСТ 4220, ч.д.а.

Примечание - Срок годности двухромовокислого калия марки ч.д.а - 1 год.

Вода для культивирования тест-организмов и разбавления объектов испытания (культивационная вода) по 5.3.2.

Макроводоросли (например, элодея или роголистник темно-зеленый), используемые для приготовления культивационной воды.

Примечание - Элодея (Elodea Canadensis Rich) - представитель погруженных растений, широко распространенный в стоячих водах умеренной зоны. Размножается вегетативным путем за счет образования густо облиственных боковых отростков, побегов из подземных частей (корневищ) или из нижних частей летних побегов. Теневынослива. Температурная граница выживаемости лежит в пределах от 5°С до 41,5°С.

Для культивирования растения отбирают из естественной популяции условно чистого водоема в конце мая - начале июня, когда появляется много молодых, наиболее жизнеспособных растений.

У элодеи отбирают зеленые верхушечные побеги длиной 8 - 10 см. без боковых отростков и корней, не имеющие видимых повреждений.

Отобранные растения транспортируют в сосудах с водой, взятой из того же водоема.

Питательная среда (среда Прата или другая, например, Успенского N 1), приготовленная в соответствии с требованиями В.3.3 (приложение В).

Примечания

1 Емкости, используемые для приготовления питательной среды, должны быть изготовлены из стекла.

2 Питательную среду используют для культивирования водорослей, которые используют для корма при культивировании тест-организмов.

Тест-организмы: пресноводные ракообразные вида Daphnia magna Straus. Культивирование и подготовка к тестированию тест-организмов - см. приложение В.

Калий азотнокислый по ГОСТ 4217, х.ч.

Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493, х.ч.

Кальций хлористый, 2-водный, х.ч., с массовой долей основного вещества не менее 98%

Магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523, х.ч.

Натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.

Хлорид железа 6-водный по ГОСТ 4147, х.ч.

Кислота азотная по ГОСТ 4461, х.ч.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.

Аммоний ванадиевокислый () с массовой долей основного вещества не менее 98%

Калий углекислый (или двууглекислый) ( или ) с массовой долей основного вещества не менее 98%

Калий фосфорнокислый однозамещенный с массовой долей основного вещества не менее 98%.

Примечание - Допускается применять другие средства измерений, вспомогательное оборудование, расходные материалы и реактивы с метрологическими и техническими характеристиками не хуже указанных в настоящем стандарте.

5.3 Подготовка к тестированию

5.3.1 Подготовка посуды

5.3.1.1 Емкости, используемые для тестирования, должны быть химически чистыми.

Для проведения тестирования используют только стеклянную посуду.

5.3.1.2 Стеклянную посуду для тестирования осторожно промывают 10%-ным раствором азотной кислоты и выдерживают 2 - 3 ч при комнатной температуре, затем тщательно промывают водопроводной водой, обрабатывают 10%-ным раствором углекислого кислого натрия, промывают водопроводной водой, после чего не менее трех раз ополаскивают дистиллированной водой.

При сильном загрязнении посуды, а также новую посуду промывают водопроводной водой, заполняют 10%-ным раствором азотной кислоты и выдерживают в течение суток, после чего обрабатывают 10%-ным раствором углекислого кислого натрия, затем тщательно промывают водопроводной водой и не менее трех - четырех раз ополаскивают дистиллированной водой.

5.3.1.3 Емкости и посуду для тестирования сушат на воздухе при комнатной температуре, затем стеклянную посуду, за исключением мерной, помещают в сушильный шкаф и выдерживают в течение 1 ч при температуре 150°С.

Чистую посуду (емкости) закрывают стеклянными притертыми пробками или крышками и хранят в шкафах или на полках.

5.3.1.4 Мембранные фильтры перед применением должны быть промыты и стерилизованы кипячением в дистиллированной воде не менее 10 мин.

5.3.2 Приготовление культивационной воды для тест-организмов

Для культивирования тест-организмов Daphnia magna Straus используют водопроводную воду.

Водопроводную воду отбирают из крана таким способом, чтобы избежать ее загрязнения. Для этого воду спускают 15 мин, затем отбирают в стеклянные емкости и отстаивают в течение 2 сут в открытых сосудах.

Для подготовки культивационной воды используют стеклянные аквариумы (объемом 20 - 30 л). После отстаивания воду аэрируют в течение 7 сут при помощи микрокомпрессоров, затем помещают в аквариумы емкостью 20 - 30 л и добавляют две - три веточки макроводорослей (см. 5.2).

Для культивирования Daphnia magna Straus допускается использовать также природную воду из незагрязненных водоемов (например, артезианских колодцев).

Культивационная вода должна соответствовать следующим требованиям:

- рН - от 7,0 до 8,3;

- жесткость общая - 80 - 250  по (от 1,6 до 5,0 °Ж);

- концентрация растворенного кислорода - не менее 6 мг /;

- температура - (202)°С;

- минерализация - не выше 6,0 .

5.3.3 Проверка физиологической чувствительности тест-организмов

Периодически (не реже одного раза в месяц), а также непосредственно перед тестированием, синхронизированную культуру околосуточных тест-организмов проверяют на физиологическую чувствительность. Для этого определяют среднюю эффективную концентрацию (24 ч ) модельного токсиканта (двухромовокислого калия) в следующей последовательности.

5.3.3.1 Готовят исходный раствор модельного токсиканта массовой концентрацией 1 следующим способом: в мерную колбу вместимостью 1000  вносят 1 г двухромовокислого калия и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды (см. 5.2), затем доводят содержимое колбы до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Срок хранения исходного раствора модельного токсиканта - не более 7 сут.

5.3.3.2 Готовят анализируемые растворы модельного токсиканта (двухромовокислого калия) заданной концентрации в следующей последовательности:

- готовят растворы двухромовокислого калия массовой концентрацией от 0,1 до 2,0  следующим способом: в семь емкостей вместимостью не менее 400  каждая мерным цилиндром вносят по 300  культивационной воды (5.3.2), затем добавляют исходный раствор двухромовокислого калия массовой концентрацией 1 (5.3.3.1) соответственно: в первую емкость - 0,03 , во вторую - 0,075 , в третью - 0,15 , в четвертую - 0,3 , в пятую - 0,45 ,в шестую - 0,6 , в седьмую - 0,75  и перемешивают. При этом в каждой емкости массовая концентрация приготовленного раствора модельного токсиканта (двухромовокислого калия) составляет соответственно: 0,1; 0,25; 0,50; 1,0; 1,5; 2,0 и 2,5  ;

- затем для каждой приготовленной концентрации модельного токсиканта (двухромовокислого калия) отбирают три емкости вместимостью 150  каждая и вносят анализируемые растворы следующим способом: в каждую емкость добавляют по 100  конкретного раствора модельного токсиканта (двухромовокислого калия), после чего помещают в них по 10 экземпляров околосуточных тест-организмов.

5.3.3.3 Проверку физиологической чувствительности тест-организмов проводят аналогично тестированию анализируемых проб объектов исследования по 5.5.3. Продолжительность тестирования - 24 ч.

Для приготовления контрольной пробы используют культивационную воду (5.3.2), при этом используют не менее трех емкостей.

Анализируемые растворы двухромовокислого калия каждой концентрации готовят непосредственно перед определением физиологической чувствительности тест-организмов.

5.3.3.4 Подсчитывают число выживших тест-организмов аналогично подсчету тест- организмов при оценке токсичности анализируемых проб по 5.5.1 и определяют значение 24 ч модельного токсиканта (двухромовокислого калия), при этом:

- если значение 24 ч данного модельного токсиканта находится в диапазоне от 0,9 до 2,5 , то считают, что подготовленные тест-организмы пригодны для тестирования;

- если значение 24 ч данного модельного токсиканта не входит в указанный диапазон, то считают, что подготовленные тест-организмы не пригодны для тестирования. Проверяют соблюдение правильности процедуры тестирования, условия подготовки тест-организмов к тестированию и, при необходимости, повторяют тестирование с использованием обновленной культуры дафний.

Пример определения значения 24 ч модельного токсиканта приведен в А.1 (приложения А).

Примечание - Значение 24 ч раствора модельного токсиканта указывают в протоколе испытаний, имея в виду, что это значение в установленном диапазоне концентраций характеризует токсичность модельного токсиканта только для использованных тест-организмов, характеризует их физиологическую чувствительность, что позволяет (или не позволяет) проводить тестирование сданными тест-организмами.

5.3.3.5 Если по результатам тестирования не удалось получить конкретное значение 24 ч , то для определения 24 ч модельного токсиканта используют пробит-анализ. Аналогичный пример приведен в А.3 приложения А.

5.3.4 Подготовка проб

Перед тестированием предварительно охлажденные или замороженные пробы доводят до температуры (205)°С.

5.3.4.1 Подготовка исходных проб природной и питьевой воды

Отобранные пробы природной и питьевой воды непосредственно перед тестированием фильтруют через мембранные фильтры с порами диаметром 3,5 мкм или через обеззоленные фильтры "белая лента", после чего измеряют рН и концентрацию растворенного кислорода отфильтрованной пробы.

Не допускается для фильтрования использовать фильтр "синяя лента".

Примечание - Фильтр "синяя лента" задерживает коллоидные вещества, что занижает результаты тестирования.

5.3.4.2 Подготовка исходных проб сточной воды

Отобранные пробы сточной воды непосредственно перед тестированием фильтруют через мембранный фильтр с порами диаметром 3,5 мкм или через обеззоленный фильтр "белая лента", после чего измеряют рН и концентрацию растворенного кислорода отфильтрованной пробы.

5.3.4.3 Подготовка исходных проб отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов, донных отложений, грунтов и почв

Из отобранных проб отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов, донных отложений, грунтов и почв, готовят водные вытяжки, затем измеряют рН-метром значение рН и оксиметром - концентрацию растворенного кислорода подготовленных водных вытяжек.

5.3.4.3.1 Подготовка водных вытяжек из проб отработанных буровых растворов

Перед приготовлением водной вытяжки из пробы отработанных буровых растворов отобранную пробу тщательно перемешивают в смесителе со скоростью вращения 17 (1000 об/мин) в течение 5 мин и определяют рН отработанного бурового раствора. Пробу отработанного бурового раствора считают не пригодной для тестирования, если:

- рН пробы отработанного бурового раствора выше 9,0 или ниже 6,0;

- на стенках сосуда с пробой отработанного бурового раствора появились черные пятна;

- проба отработанного бурового раствора имеет неприятный запах.

После перемешивания пробу отработанного бурового раствора смешивают с дистиллированной водой (см. 5.2) в соотношении 1 : 9 по объему и снова перемешивают с применением смесителя со скоростью вращения 17 (1000 об/мин) в течение 5 мин.

После окончания перемешивания смесь выдерживают при температуре (205)°С в течение 1 ч, затем жидкость над осадком (водную вытяжку бурового раствора) осторожно переливают за один прием в другую колбу и перемешивают в течение 5 мин, после чего используют ее для подготовки анализируемой пробы.

Если отстоявшаяся смесь не имеет четкого раздела фаз, то весь объем подготовленной пробы используют для приготовления анализируемой пробы.

Не допускаются консервация и хранение подготовленных водных вытяжек проб отработанных буровых растворов.

5.3.4.3.2 Подготовка водных вытяжек из проб твердых промышленных отходов

Перед приготовлением водной вытяжки из твердых промышленных отходов отобранную пробу твердых промышленных отходов разрыхляют и тщательно осматривают. В случае обнаружения частиц размером более 10 мм их измельчают с помощью металлического шпателя до размера менее 10 мм. Не допускается измельчать смесь с помощью механизированных устройств.

Измельченную пробу отходов высушивают при температуре (205)°С до воздушно-сухого состояния в вытяжном шкафу или в хорошо проветриваемом помещении.

Водную вытяжку из высушенной пробы отходов готовят в соотношении 1:10 (твердые промышленные отходы и дистиллированная вода, соответственно) следующим способом:

В колбу (стакан) вместимостью 1500  вносят 100 г сухой массы пробы твердых промышленных отходов, добавляют 1000  дистиллированной воды (см. 5.2) и перемешивают в течение 6 - 7 ч с использованием магнитной мешалки (или орбитального шейкера) с минимальной скоростью перемешивания, при которой проба твердых промышленных отходов поддерживается во взвешенном состоянии.

Примечания

1 Для приготовления 900  водной вытяжки обычно требуется 100 г сухой массы пробы отходов.

2 Не допускается использовать для приготовления водной вытяжки менее 20 г сухой массы пробы отходов и менее 200  дистиллированной воды.

После окончания перемешивания смесь выдерживают при температуре от 0°С до 4°С в течение 12 - 14 ч, затем жидкость над осадком осторожно переливают в другую колбу, после чего используют ее для подготовки анализируемой пробы.

Примечание - Жидкие промышленные отходы тестируют без разбавления, а также при разбавлении в 10, 100, 1000 и 10000 раз.

Допускается хранение подготовленных водных вытяжек из твердых промышленных отходов при температуре от 0°С до 4°С не более 48 ч.

5.3.4.3.3 Подготовка водных вытяжек из проб донных отложений

Перед приготовлением водной вытяжки из донных отложений отобранную пробу донных отложений высушивают при температуре (205)°С до воздушно-сухого состояния, удаляют остатки растений, камешки и т.п., затем измельчают в ступке и просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

После просеивания навеску пробы донных отложений вносят в колбу (стакан) и заливают дистиллированной водой (см. 5.2) в соотношении 1 : 4 по объему, перемешивают с использованием орбитального шейкера (или качалки-мешалки) в течение 2 ч. После окончания перемешивания смесь выдерживают в течение 1 ч при температуре (205)°С, а затем в течение 12 - 14 ч выдерживают при температуре от 2°С до 4°С. Затем жидкость над осадком осторожно переливают в другую колбу и фильтруют, после чего используют для подготовки анализируемой пробы.

Допускается хранение подготовленных водных вытяжек донных отложений при температуре от 2°С до 4°Сне более 72 ч.

5.3.4.3.4 Подготовка водных вытяжек из проб грунтов и почв

Перед приготовлением водной вытяжки из проб грунтов и почв отобранную пробу грунтов подготавливают в соответствии с требованиями ГОСТ 27753.2, почв - ГОСТ 17.4.4.02.

Водную вытяжку из пробы грунта (почвы) готовят следующим способом: в колбу вместимостью 1000  вносят 100 - 200 г высушенной подготовленной пробы грунта (почвы), заливают дистиллированной водой (см.5.2) в соотношении 1 : 4 по объему и перемешивают с использованием орбитального шейкера (или качалки - мешалки) в течение 2 ч.

После окончания перемешивания смесь выдерживают при температуре (205)°С в течение 30 мин, затем жидкость над осадком осторожно переливают в другую колбу и фильтруют.

Оставшуюся часть осадка в колбе встряхивают до взмучивания взвешенных частиц пробы и фильтруют через обеззоленные фильтры "белая лента" с применением вакуумного водяного (или электрического) насоса при вакууме не более 2666,448 Па (20 мм рт.ст.). При этом, если первые порции фильтрата будут мутными, то их несколько раз фильтруют через новый фильтр до получения прозрачного раствора.

Полученные фильтраты объединяют, после чего используют для подготовки анализируемой пробы.

Примечание - При наличии повышенной мутности отфильтрованных водных вытяжек их выдерживают при температуре 0°С - 4°С в течение 24 ч, затем жидкость над осадком осторожно переливают в другую колбу, фильтруют и только после этого используют для приготовления анализируемой пробы.

Допускается хранение подготовленных водных вытяжек из грунтов (почв) при температуре от 0°С до 4°С не более 72 ч.

5.3.4.4 Подготовка исходных растворов веществ

Исходные растворы веществ, в зависимости от заданной концентрации, готовят в мерной колбе путем растворения определенного количества исследуемой пробы вещества в определенном объеме дистиллированной воды.

Исходные растворы веществ готовят непосредственно перед их тестированием, при этом, если известно, что вещества стабильны в растворе, исходные растворы допускается готовить заранее, но не более чем за 2 сут до тестирования.

Примечания

1 Для веществ трудно растворимых в воде при приготовлении их исходных растворов могут быть использованы ультразвуковые или другие устройства (шейкеры) для облегчения растворимости или диспергирования веществ.

2 Допускается использовать органические растворители, обладающие малой токсичностью в отношении тест-организмов (например, ацетон), при условии, что объем растворителя в 1 анализируемой пробы не превышает 0,1 , при этом параллельно с основным тестированием проводят два контрольных тестирования: одно - без растворителя и другое - с максимальной концентрацией растворителя.

Для приготовления исходного раствора вещества заданной концентрации невозможно рекомендовать какую-либо единую методику. Например, используют следующую процедуру: в мерную колбу вместимостью 1000  (или 100, 50, 25 ) вносят 1 г вещества (или другое его количество, в зависимости от заданной концентрации раствора), затем осторожно добавляют небольшое количество дистиллированной воды (см. 5.2) и перемешивают до полного растворения вещества, затем содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой, снова перемешивают. Перед тестированием приготовленный раствор выдерживают при температуре (205)°С не менее 2 ч.

Измеряют рН-метром значение рН и оксиметром концентрацию растворенного кислорода в исходном растворе вещества.

5.3.4.5 Исходные пробы (5.3.4.1 - 5.3.4.3) и исходные растворы веществ (5.3.4.4) должны иметь следующие характеристики:

a) Значение рН 7,0 - 8,3

Если значение рН исходной пробы (раствора) выше указанного предела, то в пробу (раствор) добавляют раствор соляной кислоты молярной концентрацией 1 , если ниже - то раствор гидроокиси натрия молярной концентрацией 1 так, чтобы добавленный объем не превышал 5% от объема пробы.

Если концентрация растворенного кислорода менее 40%-ного предела насыщения, то пробу аэрируют при помощи аквариумного компрессора не более 20 мин для стабилизации рН.

Примечание - Обычно тестирование должно выполняться без регулировки рН среды после добавления испытуемой пробы. Однако некоторые вещества могут оказывать токсическое действие на тест-организмы вследствие повышенной кислотности или щелочности. Для определения токсичности пробы, не зависящей от рН, регулируют значение рН исходной пробы (исходного раствора) до значения рН питательной среды.

Для исходных проб природной и питьевой воды проводят тестирование при измеренных по 5.3.4.1 значениях рН.

Для исходных проб водных вытяжек из твердых промышленных отходов регулирование рН не допускается.

b) Концентрация растворенного кислорода не ниже 6 мг /

Если концентрация растворенного кислорода исходной пробы ниже указанного значения, пробу аэрируют при помощи аквариумного компрессора.

c) Минерализация менее 6,0 .

5.3.4.6 Подготовка анализируемых проб

Анализируемой пробой природной воды является подготовленная по 5.3.4.1 исходная проба природной воды.

Анализируемые пробы сточной воды для тестирования готовят следующим способом: проводят разбавление исходной пробы сточной воды: в конические колбы вместимостью 250  вносят исходную пробу сточной воды (5.3.4.2) и воду для разбавлений в следующих объемах:

- 100  исходной пробы сточной воды (проба без разбавления);

- 50  исходной пробы сточной воды и 50  воды для разбавлений (кратность разбавления - 50%, в два раза);

- 10  исходной пробы сточной воды и 90  воды для разбавлений (кратность разбавления - 10%, в 10 раз);

- 1  исходной пробы сточной воды и 99  воды для разбавлений (кратность разбавления - 1%,в 100 раз);

- 0,1  исходной пробы сточной воды и 99,9  воды для разбавлений (кратность разбавления - 0,1%, в 1000 раз).

Анализируемые пробы отработанных буровых растворов, донных отложений, твердых промышленных отходов, грунтов и почв для тестирования готовят из их водных вытяжек (5.3.4.3) путем разбавления водных вытяжек водой для разбавлений аналогично подготовке анализируемых проб сточной воды.

Анализируемые пробы вещества для тестирования готовят следующим способом: в емкости вместимостью 150  каждая вносят по 100  воды для разбавлений, затем добавляют рассчитанные объемы исходного раствора вещества (5.3.4.4) для получения заданных концентраций вещества, отвечающих требованиям, установленным в 5.3.4.5.

5.3.4.7 Измеряют и регистрируют рН анализируемой пробы.

5.3.5 Подготовку тест-организмов к тестированию проводят в соответствии с требованиями В.2 (приложение В) с учетом требований 5.3.3.

5.4 Проведение тестирования

Тестирование проводят в два этапа: предварительное и окончательное.

Примечание - Тестирование проб природной и питьевой воды проводят без предварительного тестирования.

5.4.1 Предварительное тестирование

Предварительное тестирование проводят для установления диапазона разбавлений (концентраций,) проб, в пределах которого необходимо провести окончательное тестирование для определения значения 48 ч (96 ч ) или 48 ч в зависимости от анализируемых проб.

При предварительном тестировании исследуют широкую область разбавлений (не менее пяти,) сточных вод, водных вытяжек и концентраций растворов вещества, выбираемых в геометрической прогрессии, при этом используют коэффициент 10 между разбавлениями (концентрациями).

При предварительном тестировании применяют не менее двух емкостей на каждую заданную кратность разбавления (концентрацию,) анализируемой пробы.

Процедура тестирования - по 5.4.3.

Пример проведения предварительного тестирования и установления диапазона концентраций вещества, в пределах которого необходимо проводить окончательное тестирование, приведен в А.2.1 (приложение А).

5.4.2 Окончательное тестирование

По результатам предварительного тестирования (5.4.1) по установлению диапазона разбавлений (концентраций,) подготавливают анализируемые пробы для окончательного тестирования аналогично подготовке анализируемых проб по 5.3.4 для тестирования, но с использованием коэффициента между разбавлениями (концентрациями,), как правило, 2,0 или 2,5.

Для окончательного тестирования используют не менее пяти разбавлений (концентраций,) анализируемых проб, при этом кратность разбавления (концентрации,) проб необходимо, по возможности, подбирать, основываясь на результатах предварительного тестирования, таким способом, чтобы обеспечить два уровня снижения выживаемости тест-организмов ниже и выше предполагаемого значения ().

Для окончательного тестирования применяют не менее трех емкостей на каждую заданную кратность разбавления (концентрацию).

Процедура тестирования - по 5.4.3.

Пример проведения окончательного тестирования и установление значения средней эффективной концентрации 48 ч для вещества приведен в А.2.2 (приложение А).

Примечание - Исходя из статистических данных, схема тестирования может быть изменена, например уменьшено количество емкостей с анализируемыми пробами для каждого разбавления (концентрации) за счет увеличения количества тестируемых разбавлений (концентраций) пробы и сокращения коэффициента между разбавлениями (концентрациями) анализируемой пробы.

5.4.3 Процедура тестирования

5.4.3.1 В каждую емкость (5.4.1 и 5.4.2) вместимостью 150 , вносят по 100  анализируемой пробы, затем в каждую емкость помещают по 10 шт. околосуточных тест-организмов.

5.4.3.2 Для каждой анализируемой пробы (разбавлений, концентраций) подготавливают контрольную пробу следующим способом: в емкости вместимостью 150  вносят по 100  воды для разбавлений (5.3.2) и помещают по 10 шт. односуточных тест-организмов.

Примечание - Плотность посадки тест-организмов - 1 шт. на 10 .

5.4.3.3 Емкости с пробами, подготовленными по 5.3.4.1 - 5.3.4.6 помещают в климатостат.

5.4.3.4 Тестирование (в зависимости от анализируемой пробы) проводят в течение 48 ч или 96 ч (см. 5.1) в климатостате при температуре (202)°С и попеременном воздействии света и темноты:

- 16 ч - при равномерном белом освещении в диапазоне от 500 до 1000 лк на расстоянии 0,35 м от поверхности проб в емкостях,

- 8 ч - при отсутствии освещения.

5.4.3.5 Через каждые 24 ч тестирования подсчитывают количество выживших тест-организмов в каждой емкости (включая контрольную).

5.4.3.6 После окончания тестирования:

- измеряют рН-метром рН в каждой емкости с анализируемой и контрольной пробами.

- измеряют оксиметром значение концентрации растворенного кислорода в каждой емкости с анализируемой и контрольной пробами;

- визуально осматривают в каждой емкости состояние тест-организмов. Любые обнаруженные отклонения регистрируют.

5.4.4 Результаты тестирования считают достоверными, если соблюдаются следующие условия:

a) гибель тест-организмов в контрольной пробе в конце тестирования не должна превышать 10%;

b) Значение 24 ч модельного токсиканта находится в пределах, указанных в 5.3.3.4.

Если условия по перечислениям а) и b) не соблюдаются, то находят причины несоответствия, устраняют их и тестирование повторяют с новой культурой тест-организмов.

5.5 Обработка результатов

5.5.1 По результатам подсчета выживших дафний (5.5.3.5) для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы по трем емкостям, в том числе и трем контрольным, рассчитывают среднеарифметическое значение выживших тест-организмов.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Номер названного пункта следует читать как "5.4.3.5"

5.5.2 Определение токсичности анализируемых проб

5.5.2.1 Токсичность анализируемых проб А, % определяют по гибели тест-организмов для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы относительно контрольной пробы после 48 ч (96 ч) тестирования и рассчитывают по формуле

(1)

где - среднеарифметическое значение количества выживших тест-организмов в контрольной пробе, шт. по 5.5.1;

- среднеарифметическое значение количества выживших тест-организмов для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы, шт. по 5.5.1.

5.5.3 Определение значения средней эффективной кратности разбавления (концентрации,)

5.5.3.1 По результатам, полученным по 5.5.2.1, в процентах для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы определяют конкретное значение средней эффективной кратности разбавления (концентрации) пробы, вызывающее 50%-ную гибель тест-организмов 96 ч (96 ч ) или 48 ч в зависимости от анализируемой пробы. Пример определения 48 ч приведен в А.2.2. (приложение А).

При необходимости определяют:

- минимальную кратность разбавления (концентрацию) пробы, соответствующую 100%-ной гибели тест-организмов;

- максимальную кратность разбавления (концентрацию) пробы, соответствующую 0%-ной гибели тест-организмов за 48 ч (96 ч).

5.5.3.2 Если по результатам тестирования, полученным по 5.5.3.1 не удалось определить конкретное значение средней эффективной кратности разбавления (концентрации) пробы, вызывающее 50%-ную гибель тест-организмов за 48 ч (96 ч), то для определения этого значения используют пробит-анализ.

Пример использования пробит-анализа приведен в A3, приложение А.

5.5.4 Определение степени токсичности анализируемых проб

5.5.4.1 Если значение токсичности анализируемых проб, рассчитанное по 5.5.2.1, формула (1), составляет не более 10%, то эффективную кратность разбавления (эффективную концентрацию) анализируемой пробы, при которой выживаемость тест-организмов снизилась относительно контрольной пробы не более чем на 10% за 48 ч тестирования (или 96 ч тестирования в зависимости от исследуемого объекта), относят к безвредной кратности разбавления (безвредной концентрации).

5.5.4.2 Степень токсичности исследуемых объектов оценивают:

- природной и питьевой воды - по таблице 1;

- донных отложений - по таблице 2;

- отработанных буровых растворов - по таблице 3;

- водных растворов веществ - по таблице 4 (в том числе химической продукции, смесевой химической продукции - по ГОСТ Р 53857, ГОСТ Р 53858 соответственно);

- сточной воды, твердых промышленных отходов, почв и грунтов - по стандартам и другим нормативным документам, утвержденным в установленном порядке.

Примечание - Под нормативным документом следует понимать документы, устанавливающие критерии отнесения исследуемых объектов к классу опасности для окружающей природной среды, разработанные в целях реализации федеральных законов (технических регламентов) в данной области.

Таблица 1 - Степень токсичности проб природной и питьевой воды

Степень токсичности проб природной и питьевой воды		Значение токсичности для проб природной и питьевой воды без разбавления А, %
общая	детализированная
Токсичность отсутствует	Нетоксичная	До 10 включ.
Не обладает острой	Слаботоксичная	Св. 10 до 25 включ.
токсичностью	Малотоксичная	Св. 25 до 35 включ.
	Среднетоксичная	Св. 35 до 50 включ.
Обладает острой токсичностью	Высокотоксичная	Св. 50 до 100 включ.

Таблица 2 - Степень токсичности проб водных вытяжек донных отложений

Степень токсичности проб водных вытяжек донных отложений		Значение токсичности для проб донных отложений А, %
общая	детализированная
Токсичность отсутствует	Нетоксичная	До 10 включ.
Не обладает острой токсичностью	Слаботоксичная	Св. 10 до 35 включ.
	Среднетоксичная	Св. 35 до 50 включ.
Обладает острой токсичностью	Высокотоксичная	Св. 50 до 100 включ.
Примечание - При необходимости более детальной оценки токсичности загрязненных проб донных отложений степень токсичности определяют по значению эффективной кратности разбавления 96 ч приведенному в таблице 3.

Таблица 3 - Степень токсичности проб водных вытяжек отработанных буровых растворов, загрязненных проб донных отложений

Степень токсичности проб водных вытяжек отработанных буровых растворов (донных отложений)	Значение эффективной кратности разбавления проб водных вытяжек отработанных буровых растворов (донных отложений) 96 ч , разы
Нетоксичные	1,0
Слаботоксичные	Менее 100
Среднетоксичные	От 100 до 1000
Высокотоксичные	От 1000 до 10000
Гипертоксичные	Св. 10000

Таблица 4 - Степень токсичности проб водных растворов веществ

Степень токсичности проб водных растворов веществ	Значение эффективной концентрации проб вещества 48 ч ,
Нетоксичные	Св. 1000
Практически нетоксичные	От 1000 до 100 включ.
Слаботоксичные	Менее 100 до 10 включ.
Среднетоксичные	Менее 10 до 1,0 включ.
Высокотоксичные	Менее 1,0 до 0,01 включ.
Гипертоксичные	Менее 0,01

5.6 Оформление результатов тестирования

5.6.1 Результаты тестирования регистрируют в протоколе испытаний в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025, при этом указывают:

а) ссылку на настоящий стандарт с указанием метода определения;

b) данные, необходимые для идентификации пробы или анализируемого вещества, прошедшего испытания;

c) тест-организмы: род, вид, метод культивирования, возраст;

d) подробное описание тестирования:

- дату начала тестирования и продолжительность;

- для природной воды, сточных вод, водных вытяжек отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов, донных отложений, грунтов, почв - кратность разбавления, способ отбора и продолжительность хранения проб. При необходимости, условия, в которых проводились отстаивание, фильтрование, а также размораживание пробы;

- для веществ - анализируемые концентрации, способ их приготовления;

- наименование и способ культивирования тест-организмов;

- значение рН анализируемых проб перед тестированием и после тестирования; сведения о регулировании рН проб (при необходимости);

e) токсичность исследуемого объекта с указанием степени токсичности и результатов определения токсичности, средней эффективной кратности разбавления 96 ч , средней эффективной концентрации 48 ч в зависимости от анализируемой пробы, метод расчета (при необходимости);

f) обнаруженные негативные эффекты (например, вялость тест-организмов, плавание по поверхности, ненормальное вращение), а также другие обстоятельства и условия, не предусмотренные настоящим стандартом, способные повлиять на результат тестирования.

5.6.2 Значения 96 ч (96 ч ) , 48 ч (48 ч ) и диапазон разбавлений (концентраций) пробы, соответствующий 0%-ной и 100%-ной гибели выражают:

- в процентах (%) или в кратности разбавления (разы) - для природной воды, сточных вод и водных вытяжек;

- в миллиграммах на кубический дециметр ( ) - для растворов веществ.

6 Метод В

6.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в регистрации иммобилизации пресноводных ракообразных тест-организмов Daphnia magna Straus в анализируемой пробе исследуемого объекта относительно контрольной пробы, определении ее токсичности и токсикологических показателей при тестировании в течение 48 ч.

Тестирование проводят попеременно в темноте и в режиме светового дня (16 ч свет/ 8 ч темнота) при температуре (202)°С и равномерном белом освещении в диапазоне от 500 до 1000 лк.

6.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы, материалы - по 5.2 со следующими дополнениями.

Помещение с контролируемым температурным режимом или климатическая камера.

Примечание - Тестирование допускается проводить в инкубаторе при температуре (202)°С в тест-контейнерах.

Тест-контейнеры и емкости из химически инертного материала и достаточной вместимостью (например, стеклянные пробирки и стаканы).

Пипетки для отбора тест-организмов достаточным диаметром для захвата тест-организмов, позволяющие захватить лишь малое количество среды.

Микропипетки из инертного пластика с луковицей на конце.

Емкости для отбора проб.

Сита (сетки 1,0 и 0,3 мм), которые могут быть использованы для перемещения взрослых тест-организмов в маточную культуру и позволяют отделить молодь от взрослых.

Тест-организмы: неонаты Daphnia magna Straus.

Примечание - Методы культивирования дафний приведены в В.4 (приложение В).

Модельный токсикант - по 5.2.

Примечание - Двухромовокислый калий () является канцерогенным веществом, которое может быть токсично при вдыхании; использование коммерчески доступных растворов с заданной концентрацией для приготовления исходного раствора эталонного вещества может снизить риск вдыхания токсичной пыли в лаборатории.

Культивационная вода, приготовленная в соответствии с требованиями приложения Е.

Калий хлористый по ГОСТ 4234, х.ч.

Магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523, х.ч.

Натрий углекислый однозамещенный по ГОСТ 4201, х.ч.

Кислота борная по ГОСТ 9656, х.ч.

6.3 Отбор проб для тестирования - по разделу 4.

6.4 Подготовка к тестированию - аналогично 5.3 с использованием культивационной воды (Е.2, приложение Е) и тест-организмов (В.2., приложение В).

Примечание - Проверку физиологической чувствительности тест-организмов по отношению к модельному токсиканту (двухромовокислому калию) проводят по 5.3.3 в условиях тестирования по 6.5. При этом используют данные, приведенные в таблице А.4 (приложение А) и соответствующие статистические методы математического анализа для определения 24 ч модельного токсиканта.

Значения 24 ч модельного токсиканта должно находиться в пределах 0,6 - 2,1 .

6.5 Проведение тестирования

6.5.1 Проводят тестирование по 5.4, с использованием тест-организмов по В.2 (приложение В).

Тестирование проводят в течение (482) ч при температуре (202)°С в помещении с регулируемой температурой (или в терморегулируемой камере) при переменном воздействии равномерного белого освещения в диапазоне 500 - 1000 лк (16 ч свет / 8 ч темнота).

При проведении тестирования рекомендуется использовать одинаковые емкости.

6.5.2 При предварительном тестировании анализируемой пробы используют по одной емкости для каждой заданной кратности разбавления (концентрации) пробы (включая контрольную).

Пример проведения предварительного тестирования пробы сточной воды и установления диапазона кратности разбавлений (концентраций) пробы, в пределах которого необходимо проводить окончательное тестирование, приведен в А.4.1 приложения А.

6.5.3 Окончательное тестирование проводят с анализируемыми пробами, которые приготовлены с использованием коэффициента между разбавлениями (концентрациями) не более 3,2. Тестирование проводят в четырех емкостях как в анализируемой, так и в контрольной пробе.

Пример проведения окончательного тестирования пробы сточной воды для определения значения средней эффективной кратности разбавления 48 ч приведен в А.4.2 приложения А.

Примечание - В случае, если ожидаются крутые кривые концентрации/ответа, рекомендуется использовать коэффициент между разбавлениями не более 2,2 (например, 1,0; 1,8; 3,2; 5,6 и 10,0 ).

6.5.4 Для приготовления контрольной пробы используют культивационную воду (см. приложение Е).

6.5.5 При необходимости определяют 24 ч (24 ч ), а также концентрации вещества (разбавлений), соответствующие 0%-ной и 100%-ной иммобилизации тест-организмов за 48 ч.

6.6 Процедура тестирования - по 5.4.3 со следующими уточнениями:

6.6.1 В серию емкостей для тестирования вносят равные объемы анализируемой пробы. Объем анализируемой пробы должен быть таким, чтобы при использовании необходимого количества тест-организмов их плотность не превышала одного организма на 10  пробы. Допускается максимальная плотность посадки - один тест-организм на 2  анализируемой пробы.

6.6.2 Для каждой серии определений (разбавлений или концентраций) подготавливают контрольную пробу в отдельных емкостях, содержащую объем культивационной воды, равный объему анализируемого раствора одной из концентраций вещества (разбавлений) и не менее пяти тест-организмов.

6.6.3 Если для растворения или диспергирования вещества используют растворитель, то одновременно параллельно готовят контрольные емкости с контрольной пробой, содержащие воду для разбавлений и растворитель в максимальной используемой концентрации.

6.6.4 Тестирование трудно растворимых веществ проводят по 5.4.3 с использованием 20 тест-организмов и при одной концентрации, которая соответствует массовой концентрации 100  или концентрации, являющейся максимальной для растворения данного вещества.

6.6.5 После тестирования и подсчета неподвижных тест-организмов измеряют концентрацию растворенного кислорода и рН в анализируемых и контрольных пробах. Если концентрация растворенного кислорода ниже 2 мг /, тестирование повторяют.

6.7 Обработка результатов - по 5.5 при определении токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб за 48 ч.

6.8. При необходимости определяют минимальное неэффективное разбавление (LID).

Пример определения минимального неэффективного разбавления (LID) для сточной воды приведен в приложении D.

6.9 Оформление результатов - по 5.6.

При этом результаты испытаний считают достоверными если:

- иммобилизация тест-организмов в контрольных емкостях менее или равна 10%;

- Значение 24 ч модельного токсиканта находится в пределах 0,6 - 2,1 .

6.10 Информация о результатах проведенных межлабораторных испытаний (метод В) приведена в приложении С.

* ИСО 5725-2:2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений.

Библиография

[1]	Методика ПНДФ 12.15.1-08	Методические указания по отбору проб для анализа сточных вод. Утверждены "Федеральный центр анализа и оценки техногенного воздействия" Ростехнадзора, от 18 апреля 2008 г.
[2]	Инструкция НВН 33-5.3.01-85	Инструкция по отбору проб для анализа сточных вод. Утверждена приказом Минводхоза СССР от 13 июля 1985 г.
[3]	Методика ПНД Ф 12.1:2:2.2:2.3.2-03*	Отбор проб почв, грунтов, осадков биологических очистных сооружений, шламов промышленных сточных вод, донных отложений искусственно созданных водоемов, прудов-накопителей и гидротехнических сооружений. Экологический Центр аналитического контроля, М., 2003