Временные методические указания по обоснованию предельно допустимых концентраций (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест (утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 15 июля 1988 г. N 4681-88)

Временные методические указания по обоснованию предельно допустимых концентраций (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест
(утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 15 июля 1988 г. N 4681-88)

1. Общие положения

1. Настоящие "Временные методические указания по обоснованию предельно допустимых концентраций (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест" предназначены для научно-исследовательских институтов гигиенического профиля, медицинских институтов, а также токсикологических лабораторий различных министерств и ведомств, занимающихся разработкой гигиенических нормативов.

2. Предельно допустимая концентрация (ПДК) атмосферных загрязнений - это концентрация, не оказывающая в течение всей жизни прямого или косвенного неблагоприятного действия на настоящее и будущие поколения, не снижающая работоспособности человека, не ухудшающая его самочувствия и санитарно-бытовых условий жизни.

3. В зависимости от показателя вредности атмосферные загрязнения подразделяются на 3 группы: преимущественно рефлекторного действия, преимущественно резорбтивного действия и рефлекторно-резорбтивного действия.

Для веществ 1 группы устанавливается только одна максимальная разовая ПДК по рефлекторному действию; для веществ 2 группы - среднесуточная ПДК и в дополнение к ней максимальная разовая концентрация на уровне 98% вероятности ее появления в хроническом эксперименте; для веществ 3 группы устанавливаются максимальная разовая ПДК по рефлекторному действию и среднесуточная - по резорбтивному.

4. ПДК атмосферных загрязнений утверждаются Минздравом СССР по представлению Секции "Гигиена атмосферного воздуха" Проблемной комиссии союзного значения "Научные основы гигиены окружающей среды". Требования к оформлению материалов по обоснованию ПДК атмосферных загрязнений, представляемых в Секцию, изложены в приложении 1.1.

5. Перечень условных обозначений, символов и специальных терминов с их определениями представлен в приложении 1.2.

2. Принципы проведения эксперимента по обоснованию ПДК

2.1. Методы создания постоянных концентраций и подготовки воздуха.

Для изучения биологического действия атмосферных загрязнений используются специальные установки, обеспечивающие точное дозирование изучаемых веществ во вдыхаемом воздухе.

Общими элементами установок для ингаляционного воздействия являются: блок воздухоподачи, блок очистки воздуха, блок расходомеров и разделения воздушного потока, блок дозирующих устройств, блок смесителей, блок ингаляционного воздействия (рис. 2.1.1.).

Материалы, применяемые при монтаже экспериментальных установок, должны обладать малой сорбционной способностью и не оказывать влияния на физико-химические свойства изучаемого вещества. В качестве воздухоподводящих путей наиболее целесообразно использовать стеклянные и тефлоновые (полиэтилентерефталевые трубки). Допускается использование трубок из силикона. Резиновые шланги могут быть применены только для соединения стеклянных трубок встык.

2.1.1. Блок воздухоподачи.

В качестве устройств, нагнетающих воздух в систему, могут быть использованы компрессоры, вентиляторы, воздуходувки, отвечающие следующим требованиям: а) устройства должны обеспечивать подачу воздуха под напором на уровне от 20 до 40 л/мин; б) устройства должны обеспечивать равномерность давления во всех блоках все время экспозиции.

Наиболее целесообразно использование централизованной подачи воздуха или воздуходувок ВПП-4, а в случае изучения рефлекторного действия компрессора УК-2,5/1,6.

2.1.2. Блок очистки воздуха.

Удаление посторонних примесей осуществляется путем прохождения воздуха через систему очистки.

В качестве фильтров используются материалы и химические соединения удобные для регенерации, обладающие большой фильтрующей емкостью и минимальным сопротивлением току воздуха. Для очистки воздуха могут быть применены фильтрующие ткани, активированный уголь, карбоферрогель, селикагель, молекулярные сита (циалиты), а также фильтрующие устройства, входящие в состав индивидуальных средств защиты органов дыхания от химических соединений и механических примесей.

С целью обезвреживания воздуха, отходящего из камер, фильтры устанавливаются также перед выбросом его в атмосферу.

2.1.3. Блок расходомеров и разделения воздушного потока

Воздушный поток поступает в блок расходомеров, состоящий из регулирующих кранов, ротаметров (реометров), обеспечивающих устойчивое и заданное поступление воздуха в последующие блоки.

2.1.4. Блок дозирования

Дозаторы для подачи заданных концентраций веществ могут, быть основаны на различных принципах и иметь самую разнообразную конструкцию в зависимости от физико-химических свойств веществ и уровня необходимых концентраций.

Метрологические основы дозирования химических веществ и основные типы дозаторов, применяемых для создания определенных концентраций газообразных и жидких химических веществ, описаны в монографии Д.К. Колерова (1967).

В гигиенических исследованиях для дозирования газов чаще всего применяются следующие методы: выдувание газа из раствора, предварительно насыщенного этим газом (К.А. Буштуева); вытеснение газа из сосудов, путем капельной подачи жидкости, в которой дозируемый газ не растворяется (А.М. Петров, 1988); подача разбавленных газов из баллонов через капилляры и микровентили (Е.В. Печенникова, Е.Б. Иродова, 1976); регулируемая подача реагентного раствора в реакционный сосуд, в котором происходит образование необходимого газа (В.М. Пазынич и соавт., 1983); данный способ удобен при работе с особо опасными газами; диффузия сжиженных газов через пористые полимерные материалы (Н.Ш. Вольберг и др., 1973).

При дозировании жидких химических веществ широко применяется метод диффузии паров с поверхности жидкостей, помещенных в сосуды разнообразной формы - "гуськи" (В.А. Рязанов и соавт., 1954; И.В. Саноцкий, Г.Г. Максимов, 1970), ампульные и поршневые "натекатели" (Б.Я. Экштат и соавт., 1976) или в специальные диффузионные ячейки (В.М. Емельянов, А.Н. Бережной, 1984).

Могут быть использованы электромеханические дозаторы, принцип работы которых основан на дозированном вытеснении вещества из дозирующих объемов (шприцов, сильфонов) в ток воздуха (В.Л. Бертнев, 1963; Ю.А. Кротов и соавт., 1981), дозирование может осуществляться и с помощью прибора для регионарной гепаризации.

Для дозирования твердых аэрозолей в установки для ингаляционного воздействия получили наибольшее распространение распылители различных конструкций и дозаторы пыли-аэрозолей дезинтеграции (Ю.Г. Широков и др., 1960; Г.А. Радченко, Ю.И. Белобородов, В.М. Пазынич и соавт., 1984). В основу таких приборов положены принципы распыления порошков, а для получения малых концентраций - дозаторы с комбинированными способами пылеобразования с использованием пневмовибрации, зернистых наполнителей и др. (Ф. Стренк и соавт., 1970; Г.С. Гильденскиольд, 1970). Выбор того или иного дозатора осуществляется в зависимости от свойства вещества (гигроскопичность, дисперсность и т.д.). Наиболее часто применяются: "пылевой генератор N 1" (Р.С. Гильденскиольд и соавт., 1970), "микродозатор пыли" (Фукс и соавт., 1978), "пылевой дозатор" для хронического воздействия на лабораторных животных (Н.В. Гринь и соавт., 1969), дозатор пыли (В.М. Пазынич и соавт., 1978).

Для создания концентраций аэрозолей конденсации могут быть использованы устройства, с помощью которых осуществляются плавление и возгонка твердых веществ в трубчатых электропечах или же распыление растворов в высокотемпературную зону с последующей конденсацией вещества в твердые дисперсные частицы М.С. Садилова, Л.М. Петин, 1967; В.М. Пазынич, В.В. Хлебников, 1978; Л.Г. Диденко, 1982).

2.1.5. Блок смесителей

Для смешения химических соединений может быть рекомендовано устройство, принцип которого основан на использовании изменения направления движения воздушной смеси, а также за счет возникающей разницы статического и динамического давления воздушного потока.

2.1.6. Блок ингаляционного воздействия

Перемешанная воздушная смесь изучаемого соединения поступает в блок ингаляционного воздействия, который представлен цилиндрами, в случае изучения рефлекторного действия, и затравочными камерами, в случае - резорбтивного.

2.2. Контроль за содержанием веществ в воздухе

Контроль содержания вещества в воздухе осуществляется непрерывно с помощью автоматической аппаратуры или прерывисто ручными методами. Пробы следует отбирать из зоны дыхания.

При изучении рефлекторного действия пробы отбирают до начала опыта и после его окончания.

При изучении резорбтивного действия отбор проб осуществляется 3 раза в сутки, при высокой стабильности концентраций (коэффициент вариации ) дозируемого вещества в воздухе камер для ингаляционного воздействия пробы можно отбирать 1 раз в сутки.

При изучении аэрозолей оценка их химического и дисперсного состава обязательна; используемый метод определения дисперсности частиц представлен в приложении 2.1.1.

3. Методика установления ПДК атмосферных загрязнений по их рефлекторному действию

Результаты изучения рефлекторного действия вещества являются основой для обоснования ПДК атмосферных загрязнений 30-минутного периода осреднения.

Изучение рефлекторного действия веществ проводится на людях - (волонтерах) с целью определения пороговых и недействующих концентраций. Общие требования к условиям привлечения волонтеров следующие:

1. Участие людей-добровольцев (волонтеров) в исследованиях допускается при гарантии безопасности их состояния здоровья. Гарантией безопасности служит наличие ПДК вещества в воздухе производственных помещений и в воде водоемов, а также имеющаяся в литературе информация о степени токсичности и опасности вещества (пороги острого, раздражающего, хронического действия, класс опасности вещества).

При отсутствии таких данных экспериментатор обязан провести исследования на животных с определением среднесмертельных концентраций (доз), порога острого действия и ориентировочного безопасного уровня воздействия (ОБУВ) изучаемого вещества в атмосферном воздухе согласно "Методическим указаниям по установлению ОБУВ загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест", утвержденным Минздравом СССР N 2630-82 от 25 ноября 1982 г.

К исследованиям не допускаются кормящие и беременные женщины.

2. Добровольное согласие волонтера на участие в исследованиях оформляется в виде соответствующего договора, утверждаемого дирекцией учреждения, в котором они проводятся.

3. К исследованиям не могут привлекаться лица, работающие в течение рабочего дня с химическими веществами, а также имеющие функциональные нарушения со стороны центральной нервной системы, органов обоняния, полости рта и верхних дыхательных путей.

3.1. Блок ингаляционного воздействия

Блок ингаляционного воздействия для изучения рефлекторного действия представлен в виде 2-х стеклянных цилиндров (рис. 3.1.1.).

Цилиндр представляет собой однокорпусное устройство диаметром 100 мм и емкостью 1 л. В каждый цилиндр подается 15-20 литров воздуха в минуту. В один из цилиндров из дозатора поступает вещество в определенной концентрации, в другой - чистый воздух. С помощью кранов можно чередовать подачу чистого воздуха и газовой смеси в каждый цилиндр. Цилиндры отделены от дозирующей системы экраном так, чтобы обследуемый не знал, в какой из цилиндров подается чистый воздух, а в какой смесь изучаемого вещества. Порядок чередования чистого воздуха и вещества определяется по методу, описанному в разделе 3.2.

3.2. Схема проведения эксперимента

В эксперименте участвуют 20-30 волонтеров в возрасте от 18 до 55 лет (женщины), до 60 лет (мужчины). Перед каждым проведением опыта необходимо выяснить, имеются ли какие-либо отклонения в самочувствии волонтера (простудные заболевания, прием фармпрепаратов, употребление накануне опыта алкоголя и т.д.). При наличии указанных отклонений испытуемый исключается из данного опыта.

Перед началом эксперимента все волонтеры предупреждаются о недопустимости использования в течение всего времени определения порогов обонятельного ощущения парфюмерных средств (пахучие мыла, духи, одеколон, дезодоранты и т.п.), применения фармакологических препаратов, употребления спиртных напитков.

Вся группа наблюдаемых должна, быть ознакомлена с запахом исследуемого вещества. С этой целью за 2-3 дня до начала основного эксперимента каждому испытуемому предъявляется концентрация, по которой он может безошибочно определить специфический запах данного вещества.

Определение порога обонятельного ощущения проводится на основе субъективного суждения волонтеров о наличии или отсутствии запаха по принципу "Да" или "Нет". При этом учитывается не только наличие специфического запаха, но и "неопределенного", когда человек ощущает какой-то запах в сравнении с воздухом в контрольном нюхательном цилиндре, но не может определить его принадлежность конкретному веществу. Кроме того, необходимо выяснить у волонтера, не возникло ли у него каких-либо дополнительных ощущений: вкусовых, тактильных, тепловых и т.д.

Эксперимент следует начинать с хорошо ощутимых концентраций, снижая последующие уровни в 1,5-2 раза. При этом должно быть изучено не менее 4-5 концентраций, т.е. перекрыт диапазон вероятности обнаружения запаха от 100% до близхих к 0. При изучении действия каждой концентрации принимают участие все наблюдаемые. Каждая концентрация должна быть предъявлена волонтеру не менее 3-х раз, причем в течение одного дня не более 3-х раз с интервалом 1-1,5 часа.

Для исключения "угадывания" запаха волонтерами необходимо чередование подачи в цилиндры потоков чистого воздуха и заданной концентрации вещества. Порядок чередования подачи чистого воздуха и вещества может быть определен по таблице случайных чисел. Для этого экспериментатор делает 11 одинаковых табличек, на которых пишется 1 цифра из ряда от 0 до 1: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0. Для определения порядка предъявления концентраций через левый или правый цилиндр вытаскивается одна из табличек. Если ока окажется с числом меньше 0,5 - вещество подается в правый цилиндр, а в левый - чистый воздух; если больше 0,5 - то подача вещества осуществляется через левый цилиндр, а чистый воздух - через правый; если же с числом 0,5 - то в оба цилиндра подается чистый воздух. Результаты исследований заносятся в рабочий журнал.

3.3. Обработка результатов эксперимента

Данные по влиянию каждой концентрации анализируются в процессе проведения исследования: учитывается число положительных и отрицательных ответов каждого участника, сумма предъявлений, сумма и процент положительных ответов для всей группы лиц. В эту обработку включаются лишь лица с одинаковым числом исследований по всему диапазону концентраций. Таким же способом обрабатываются результаты предъявления в оба цилиндра чистого воздуха, то есть необходимо учитывать особенность метода, заключающуюся в том, что существует определенная вероятность случайного правильного ответа.

Теоретически допускается, что процент таких ответов может достигать 20. Для получения более точных результатов исследования можно исключить эту ошибку, используя формулу Шнейдер-Орелли (Г.Н. Красовский и соавт., 1976; Л.А. Тепикина, 1987):

, где

- стандартизованный процент положительных ответов;

- экспериментально полученный процент положительных ответов;

- процент ошибочных (положительных ответов на чистый воздух)

Результаты заносятся в таблицу 3.3.1.

Таблица 3.3.1.

Процент положительных ответов волонтеров по отношению ко всей сумме предъявлений в зависимости от концентрации вещества

Концентрация вещества	Сумма предъявлений	Число положительных ответов	Процент положительных ответов	Стандартизованный процент положительных ответов
1	2	3	4	5
1
2
3
...
Контроль (чистый воздух)

Для определения значения порога обонятельного ощущения результаты эксперимента обрабатываются графическим методом пробит-анализа (Н.Г. Андреещева, 1971) или аналитически - методом наименьших квадратов (Л.А. Тепикина, 1974, 1976). Последний имеет преимущество при одинаковом проценте положительных ответов на различные концентрации вещества.

На стандартной пробитной сетке (рис. 3.3.1) по оси абсцисс откладываются значения концентраций, а по оси ординат соответствующие проценты исправленных значений положительных ответов.

Полученные точки соединяются прямой таким образом, чтобы наиболее приближенными к ней оказались те из них, которые соответствуют значениям . Полученная прямая зависимости "lg концентрации - эффект" используется для определения порога обонятельного ощущения. Пороговой является концентрация, которая соответствует 16% обнаружения запаха . Данная концентрация является вероятностным порогом запаха исследуемого вещества. Величина -минутного периода осреднения устанавливается на основе значения вероятностного порога запаха с учетом класса и коэффициента запаса. Класс вещества по ольфакторным реакциям определяется по углу наклона прямой зависимости вероятности обнаружения запаха от величины воздействующей концентрации вещества, построенной на стандартизованной логарифмически-вероятностной (пробитной) сетке.

Коэффициент запаса устанавливается в зависимости от класса веществ по номограмме (рис. 3.3.2.), при угле наклона прямой менее 30° принимается коэффициент запаса равный 1,5.

Значение максимальной разовой ПДК рассчитывается по формуле:

При аналитической обработке результатов методом наименьших квадратов (на основе уравнения У = а + в lg С, где коэффициент "в" характеризует тангенс угла наклона прямой "lg концентрации - эффект") определяем , коэффициент корреляции и его стандартную ошибку, достоверность построенной линейной зависимости. Значение устанавливается как и при графической обработке на основе с учетом дифференцированных коэффициентов запаса.

При использовании вышеуказанного метода отпадает необходимость изучения рефлекторных реакций с помощью адаптометрии и электроэнцефалографии, поскольку коэффициент запаса учитывает и рефлекторное действие субсенсорных концентраций.

4. Методы обоснования ПДК атмосферных загрязнений по их резорбтивному действию

4.1. Методика установления параметров острого действия.

Для определения параметров токсичности химического вещества в случае, когда в литературе отсутствуют такие сведения, соответствующие характеристики возможно подучить на основе острого воздействия на организм.

Моделирование острого опыта проводится на животных при однократном поступлении химического соединения естественными путями - вдыхание с воздухом, в желудок, а для веществ, обладающих раздражающим действием, при нанесении на кожу и слизистые оболочки глаз. По показаниям изучение острой токсичности возможно при других путях введения: под кожу, внутривенно, внутрибрюшинно.

Острое действие химического соединения изучается, как правило, на двух видах лабораторных животных - белых мышах весом 18-22 г и белых крысах весом 180-240 г. Для эксперимента отбираются однородные группы животных по полу (группа включает самцов или самок), весу (колебания веса животных в одной группе и между группами не должны превышать ). В каждой группе должно быть не менее 6 животных. Каждая группа экспериментальных животных подвергается воздействию определенной концентрации (дозы). Интервалы между испытываемыми уровнями концентраций могут соответствовать: арифметической прогрессии, например 2, 4, 6, 8, 10 и т.д.; или геометрической прогрессии, например, 2, 4, 8, 16 и т.д. Воздействие на разные группы разными концентрациями (дозами) позволяет установить параметры острой токсичности - (средняя концентрация, которая вызывает гибель 50% животных); (средняя доза, которая вызывает гибель 50% животных); - среднее время гибели животных; или (тангенс угла наклона зависимости летального эффекта от концентрации вещества).

Ингаляционное острое отравление. В начале эксперимента определяются уровни концентраций, которые будут испытываться. Начальные концентрации исследуемого вещества, лежащие в зоне летального действия, могут быть определены на основании температуры кипения (t° кип) путем расчета по эмпирическим формулам, предложенным Е.И. Люблиной:

(4.1.1.)

Для мышей при 2-часовой экспозиции возможно применение формул:

(4.1.2.)

Для органических летучих веществ, зная их температуру кипения, начальные концентрации можно выбрать по шкале, представленной в таблице 4.1.1.

Таблица 4.1.1.

Уровень начальных концентраций в зависимости от температуры кипения вещества (по Е.И. Люблиной)

Температура кипения, °С	190-156	155-130	129-105	104-80	79-55	до 55
Начальные концентрации, мг/л	5	10	20	40	80	160

Необходимо проводить динамическую затравку животных, т.к. она обеспечивает стабильность концентрации на все время атравки. При создании высоких концентраций изучаемое соединение сорбируется на шерсти животных и стенках камеры. Для препятствия слизывания вещества целесообразно помещать животных в домики с отверстием для дыхания. Затравка проводится в стандартных 100- или 200-литровых камерах. Острое ингаляционное воздействие на мышей можно проводить и в 12-литровых эксикаторах.

В эксперименте на белых мышах опыт ведется 2 часа, при использовании белых крыс время затравки составляет 4 часа. В связи с тем, что гибель животных после однократного действия может наступать в разное время, за животными ведется наблюдение, как правило, в течение 2-4 недель.

Результаты эксперимента заносятся в протокол (табл. 4.1.2) затем рассчитывается , и или .

Таблица 4.1.2.

Динамика гибели животных в зависимости от действующей концентрации вещества

концентрация, (Доза, мг/кг)	Всего мышей, крыс	Из них погибло через					Число погибших животных	% гибели
		2 час.	4 час.	1 сут.	2 сут.	3-14 суток и т.д.

Пероральное острое отравление. В начале эксперимента определяются возможные летальные дозы исследуемого вещества. Летальные дозы можно рассчитать по формуле Г.Н. Красовского [1969]:

(4.1.3.)

Ориентировочные летальные дозы могут быть установлены также по аналогии с близкими по строению химическими соединениями.

Пероральная затравка проводится путем введения исследуемого вещества в желудок зондом с помощью шприца. Введение вещества в желудок проводится натощак, т.е. спустя не менее 4 часов после еды. Допустимые объемы жидкости для введения в желудок лабораторным животным составляют 1-1,5% от массы тела; т.е. для мышей 0,2-0,3 мл; для крыс - 2-3 мл; для морских свинок - 4-6 мл; для кроликов - 25-40 мл. Вещества можно вводить в чистом виде, водном растворе, растительном масле (0,2 мл), в индифферентном растворителе (например, полиэтиленгликоле), 1-2% растворе крахмала, яичном желтке и т.п. Объем жидкости целесообразно оставлять одинаковым при всех дозах эксперимента, варьируя концентрации вещества в растворе.

После затравки, не ранее чем через 3 часа, допускается кормление выживших животных и в течение 2-х недель ведется наблюдение, описание клинической картины и заполнение протокола опыта (см. таблицу 2).

Испытывается столько различных доз и на таком количестве групп животных, сколько необходимо для выявления , , , , но не менее 4-5 групп. В конце эксперимента рассчитывается , высчитывается стандартная ошибка и среднеквадратическое отклонение, и (или ).

Расчет среднесмертельной концентрации или дозы необходимо проводить с помощью пробит-анализа или методом наименьших квадратов (М.Н. Беленький, 1963). Метод пробит-анализа позволяет аналитически точно определить угол наклона зависимости "концентрация - летальный эффект" и соответственно правильно определить параметры и . Коэффициент регрессии "в" соответствует тангенсу утла наклона кривой "концентрация-эффект". При сравнении токсичности и опасности разных веществ необходимо использовать оба параметра: и .

Необходимость определения тангенса диктуется также тем, что этот показатель характеризует кумулятивность вещества (И.В. Саноцкий, И.П. Уланова, 1975) и корреляционно тесно связан с коэффициентом кумуляции (А.В. Любимов и соавт., 1986).

Раздражающие свойства веществ изучаются в соответствии с [4.23].

4.2. Методика установления ПДК атмосферных загрязнений по общетоксическому действию (хронический эксперимент)

Хронический эксперимент на животных при длительном воздействии химических веществ является основным и главным этапом исследований по обоснованию гигиенических нормативов вредных веществ в атмосферном воздухе населенных мест. Эксперимент позволяет качественно и количественно оценить токсичность и опасность атмосферных загрязнений, установить характер их влияния на организм в концентрациях, близких к реально встречающимся в окружающей среде, выявить избирательность повреждения отдельных органов и систем, разграничить истинную адаптацию и компенсацию процесса.

Конечной задачей хронического эксперимента является установление недействующей концентрации и пороговой концентрации изучаемого вещества, вызывающей биологически значимые изменения интегральных и специфических показателей при ингаляционном пути поступления в организм, с учетом которых рекомендуется предельно допустимая концентрация (ПДК) данного соединения.

4.2.1. Блок ингаляционного воздействия при хронической затравке животных

Этот блок представляет собой различные типы затравочных камер. Широкое распространение получили в нашей стране камеры для ингаляционного воздействия емкостью 100 литров (изготовитель - ЭТМ ЛенГосНИИ гигиены труда и профзаболеваний); 120-литровые горизонтальные камеры Р.С. Гильденскиольда; 200-литровые камеры, предложенные Б.А. Курляндским; камеры (блоки камер) ингаляционного воздействия, разработанные Ю.А. Кротовым и др.

Современные экспериментальные камеры (блоки) ингаляционного воздействия должны соответствовать следующим требованиям:

1. Камеры должны быть изготовлены из материалов, стойких к коррозии, слабо адсорбирующих на своей поверхности различные пары и газы; материалы, применяемые при монтаже камер, не должны оказывать влияния на физико-химические свойства изучаемых веществ.

2. Камеры должны легко и быстро герметизироваться.

3. Изучаемые вещества должны равномерно распределяться по всему объему камеры.

4. Камеры должны легко проветриваться, очищаться и дегазироваться.

5. Конструкция камер должна обеспечивать введение заданных концентраций вещества, забор проб воздуха, вентиляцию, иметь пробки датчиков и устройство по разгерметизации при аварийном прекращении подачи воздуха.

6. Должна быть предусмотрена возможность размещения животных по всему объему камеры наблюдения за их поведением и состоянием.

7. Общий объем животных не должен превышать 5% от объема камеры.

8. Для обеспечения оптимальных параметров микроклимата в камерах должна быть температура не ниже 20°С, относительная влажность - 50-65%; кратность воздухообмена - 10-20 объемов в час; допустимый уровень шума в камерах не должен превышать 40 Дб.

Работа с камерами ингаляционного воздействия требует определенных навыков от персонала и строгого соблюдения инструкции по технике безопасности.

4.2.2. Выбор экспериментальных животных и их содержание.

Основным условием успешного проведения хронического эксперимента является подбор экспериментальных животных. Эксперимент проводится на подопытных и контрольных группах животных, одинаковых по количеству, равноценных по основным показателям и подобранных методом случайной выборки. В зависимости от задач исследования проводятся на разных видах лабораторных животных: мыши, крысы, кролики, морские свинки и др. Наиболее удобной моделью в длительном хроническом эксперименте являются животные грызуны и, в первую очередь, белые крысы.

Как правило, при широкомасштабном исследовании токсичности химических загрязнений атмосферного воздуха рекомендуется использовать нелинейных животных. В отдельных случаях, например, когда требуются животные модели, отражающие генетические вариации в человеческой популяции или когда проверяется гипотеза о механизме действия вещества, целесообразно использовать чистые линии животных.

В эксперименте используются клинически здоровые животные (половозрелые самцы и самки) репродуктивного возраста с исходным весом: белые крысы - 150-180 г, белые мыши - 15-25 г, морские свинки - 200-250 г, кролики - 1500-2000 г. До начала эксперимента, полученные из питомника животные в течение 2-х недель содержатся в карантине, после чего в течение того же срока - в камерах для ингаляционного воздействия с целью адаптации к условиям опыта и снятия фоновых показателей.

Рацион для животных устанавливается согласно существующим нормативам (Приказ МЗ СССР N 1179 от 10 октября 1983 г. "Об утверждении затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения"). Животных кормят 1 раз в сутки, помещая кормушки в камеры для ингаляционного воздействия. Для осуществления питьевого режима в камерах устанавливаются специальные поилки с водой.

Контрольные животные содаржатся в аналогичных с экспериментальными группами условиями - в камерах, в которые подается чистый воздух.

Каждое животное в опытных и контрольных группах должно иметь индивидуальную маркировку.

4.2.3. Выбор показателей функционального состояния организма

Выбор показателей функционального состояния организма в хроническом опыте обычно производится с учетом литературных данных о токсикодинамике изучаемого вещества, а также результатов острого и подострого опытов.

В процессе изучения и сценки токсичности и опасности химических загрязнений атмосферного воздуха в условиях хронического эксперимента важным является выяснение соотношения между признаками адаптации и приспособительной реакции (приложение 1.2).

При выборе показателей и тестов, используемых в хроническом эксперименте, необходимо учитывать их вариабельность, степень лабильности, биологическую значимость. Биохимические, физиологические, иммунологические и другие показатели функционального состояния организма животных подвержены значительным сезонным, а в ряде случаев и ежедневным колебаниям, поэтому важно определить физиологические пределы этих колебаний. Следует также учитывать, что вариабельность зависит от того, относятся ли изучаемые показатели к категории относительно стабильных, то есть "жестких" или лабильных, то есть "пластичных", которые могут быть охарактеризованы коэффициентом вариации, определяющем степень колеблемости признака. Так, к "жестким" может быть отнесен показатель, вариация которого в норме менее 10%. При коэффициенте вариации от 10% до 50% показатели могут расцениваться как "пластичные". Если же коэффициент вариации составляет 50% и выше, то это свидетельствует о "высокой пластичности" показателя.

В зависимости от категории показателей число животных в опыте должно составлять от 6 до 20 (6, 10, 20). При обосновании количества животных, необходимых для проведения исследований, следует также руководствоваться принципом, согласно которому надо использовать такое число животных, которое обеспечит получение статистически достоверных выводов в отношении различий ответных реакций у опытных животных по сравнению с контрольными и будет служить основой для статистической экстраполяции на большие по объему выборки популяции.

При выборе показателей следует учитывать различный уровень реагирования организма: организменный, системный, органный, тканевой, клеточный, субклеточный или биомолекулярный. Исследуемые показатели могут подразделяться на интегральные (неспецифические) и специфические. Первые позволяют судить преимущественно о состоянии всего организма в целом или важнейших его систем, вторые - отдельных органов или функций. При этом интегральные показатели представляются биологически более значимыми, хотя использование специфических показателей в большей степени позволяет выявить механизм действия изучаемого химического вещества и наиболее ранние проявления токсического эффекта.

Вместе с тем, следует иметь в виду, что разделение показателей на интегральные и специфические в известной мере условно. Так, некоторые показатели, часто используемые как интегральные, в определенных случаях могут расцениваться как "специфические". Например, применяемые в качестве интегральных показателей потребление кислорода или изменение высшей нервной деятельности, при воздействии ряда химических соединений отражают специфику действия вещества. И наоборот, некоторые специфические показатели, характеризующие особенности действия определенных химических веществ, применительно к другим токсическим агентам могут быть использованы как "интегральные". Например, к специфическим показателям могут быть отнесены активность холинэстеразы при изучении фосфорорганических соединений или сульфгидрильные энзимы при действии тиоловых ядов, однако при воздействии других веществ эти же показатели являются интегральными.

В каждом конкретном случае комплекс избираемых показателей и тестов должен быть тщательно обоснован с целью "... учета при обосновании норматива гигиенически значимых, признаваемых вредными для организма реакций, и того, насколько эффект мог быть ожидаем, в какой мере он специфичен для воздействия изучаемого соединения".*

В виде примерной схемы в хроническом эксперименте рекомендуется использовать не менее 4-6 интегральных и 3-4-х специфических показателей, хотя, разумеется, целесообразно исследовать по возможности большее их количество, включая физиологические, биохимические, морфологические, иммунологические, а в случае необходимости токсикокинетические и показатели, характеризующие систему биотрансформации, а также другие тесты, связанные с характером действия ядов.

4.2.4. Схема проведения эксперимента

При решении задач гигиенического регламентирования атмосферных загрязнений целесообразно не только определить минимальную концентрацию, вызывающую с определенной степенью вероятности тот или иной эффект (пороговую концентрацию), но и установить концентрацию, которая с необходимой степенью надежности этого эффекта не вызовет (то есть подпороговую концентрацию). Поскольку понятие "величина пороговой дозы (концентрации)" имеет относительный характер и по сути дела порог действия - это диапазон минимально эффективных концентраций на соответствующем участке кривой "концентрация-эффект", постольку с гигиенических позиций наибольшее значение приобретает определение начального уровня концентраций этого диапазона, то есть наименьшей величины порога действия.

Поэтому чрезвычайно важно для получения максимума информации установить характер всей зависимости "концентрация-эффект", что с одной стороны, сделает более надежной оценку пороговых концентраций и облегчит экстраполяцию на область минимально эффективных и максимально неэффективных уровней, а с другой стороны, позволит выявить динамическую картину интоксикации.

В эксперименте лабораторные животные должны подвергаться ингаляционному воздействию изучаемым веществом в 3-5 концентрациях: от неэффективной (подпороговой) до оказывающей выраженный эффект. При этом для установления количественного выражения зависимости "концентрация-эффект" необходимо изучить как минимум 3 эффективных уровня.

Ориентиром для выбора доз (концентраций) для хронического эксперимента могут служить результаты острого или подострого опыта (для самой высокой концентрации) и, например, ОЕУВ, рассчитанный только по параметрам токсикометрии (для самой низкой). Остальные концентрации должны быть промежуточными, но с соблюдением требования их статистически достоверного различия между собой и не менее 3-х, но не более 10-кратной разницы с предшествующим уровнем.

Длительность круглосуточной экспозиции экспериментальных животных, в частности белых крыс, обычно должна составлять 3 месяца или 10-15% времени жизни этих животных. Для обоснования длительности экспозиции и выбора концентраций важное значение может иметь доступная информация о периоде полувыведения вещества, которая может указывать на степень ожидаемой кумуляции. Так, сокращение затравки до 2-х месяцев возможно, если период полувыведения вещества исчисляется часами, если же вещество обладает длительным периодом полувыведения или биологической полужизни необходимо продлевать экспериментальные исследования до 4-х месяцев и более длительных сроков.

Оценка состояния подопытных и контрольных животных в течение хронического эксперимента проводится в динамике. Первое обследование осуществляется через 1-2 недели от начала опыта. В дальнейшем при воздействии высоких концентраций исследование биологических показателей следует проводить с более короткими интервалами (не более 2-х недель), а при воздействии меньших - интервалы между повторными исследованиями показателей можно увеличивать от 2 недель до 1 месяца.

Изменения показателей функционального состояния организма в процессе воздействия различных концентраций вещества учитываются либо в градированной, либо в альтернативной форме.

При использовании градированных показателей (а таковыми являются большинство исследуемых показателей) обычно имеют дело с непрерывной изменчивостью, то есть в процессе исследований устанавливают динамику снижения или повышения изучаемого показателя, например, активности фермента на определенную величину по сравнению с контролем или фоном. В этом случае статистически достоверное различие изучаемого показателя опытной группы животных по сравнению с таковым контрольной группы или фоном устанавливается по средним его значениям в группах. Для этого вычисляется средняя арифметическая для принятого показателя и доверительный интервал с учетом малой выборки . За неблагоприятный эффект принимается изменение, выходящее за пределы доверительных границ контроля.

Однако установление статистически достоверного отклонения изучаемого градированного показателя по сравнению с таковым в контроле не всегда является достаточным основанием для оценки возникших изменений, в частности, являются ли они вредными, либо не выходят за пределы колебаний, встречающихся в условиях нормальной жизнедеятельности.

Сложность этой задачи обусловлена нерешенностью проблемы дифференцирования "просто действия" от "вредного действия" и связанного с ней вопроса о критериях вредности, базирующихся на определении границ между нормой и патологией, при установлении порога хронического действия яда. Согласно определению: "Порог вредного хронического действия - минимальная концентрация (доза) вещества в объекте окружающей среды, при воздействии которой в организме (при конкретных условиях поступления вещества и стандартной статистической группе животных) возникают изменения, выходящие за пределы физиологических приспособительных реакций, или скрытая (временно компенсированная) патология**".

Следовательно, для повышения надежности устанавливаемых в эксперименте пороговых и недействующих величин необходимо использовать такие методы, которые позволили бы выявить признаки физиологической адаптации и компенсированной патологии. С целью выявления начальных изменений, лежащих на грани нормы и патологии, при оценке пороговых и подпороговых концентраций химических загрязнений атмосферного воздуха целесообразно использовать следующие приемы:

- установить дозовые зависимости по отдельным тестам при учете реакций в градированной форме. При этом целесообразно получить зависимости не только между концентрацией и эффектом при каком-то одном фиксированном времени воздействия, но и определить зависимость между временем воздействия и эффектом при каждой концентрации изучаемого вещества. При этом важное значение приобретает сопоставление не только с контролем, но и с фоном. При наличии достоверных отклонений (с принятой степенью вероятности) необходимо сопоставление с данными о физиологических, сезонных и других колебаниях показателя. С этих позиций важно учитывать к какой категории относится показатель - к "жестким" или "пластичным". Эти данные о жесткости или пластичности биохимических, физиологических и других показателей следует учитывать при оценке наблюдаемых в эксперименте изменений структуры и функции;

- выявить наличие интегральных ответов, оцениваемых на уровне организма, которые являются более весомыми с позиций критерия вредности, хотя изменения на различных структурно-функциональных уровнях организации (от молекулярного до органного) также должны приниматься во внимание при установлении пороговых и недействующих уровней, при этом особое значение приобретают биологическая важность системы и характер наблюдаемых отклонений;

- определить биологическую значимость сдвига на основе изучения биохимических, физиологических и морфологических параллелей, установления направленности изменений во времени и их стойкости. В связи с этим необходимы исследование корреляционных связей между различными показателями на различных уровнях эффективных концентраций, а также учет количества измененных показателей при анализе зависимости концентрация-эффект во времени. Установление корреляционных связей между показателями, характеризующими состояние физиологических биохимических процессов в организме, позволяет осуществлять оценку их сопряженности и степени нарушения синхронизации на различных уровнях организации от молекулярного до организменного, что будет способствовать более точному выявлению пороговых и максимальных недействующих уровней;

- оценить состояние метаболических превращений, а в случае необходимости и кинетики токсических веществ в организме, степени накопления, распределения и выведения последних;

- использовать функциональные нагрузочные тесты с целью оценки адаптационных резервов организма.

Суммируя вышеизложенное, для установления пороговых и максимальных недействующих концентраций можно выделить несколько групп критериев вредности, которые могуть быть охарактеризованы следующими признаками, рассматриваемыми в комплексе:

- Статистические критерии:

- Изменения достоверно отличаются от контроля (р < 0,05) и выходят за пределы статистически значимых в зависимости от категории показателей ("жесткий", "пластичный") их физиологических колебаний для данного вида животных и для данного времени года.

- Достоверных изменений (р < 0,05) по сравнению с контролем или фоном нет, однако наблюдаются скрытые нарушения равновесия с внешней средой (сужение возможности адаптации), выявляемые при помощи функциональных нагрузок.

- Изменения достоверно (р < 0,05) отличаются от контроля, находятся в пределах физиологической нормы, однако стойко сохраняются (в эксперименте на животных - более 1 месяца).

- Суммарное число достоверных изменений (р < 0,05) разных показателей в измеряемом комплексе в течение длительного времени проводимых многократных повторных измерений достверно отличается от контроля, хотя все эти изменения находятся в пределах физиологических колебаний.

- Метаболические критерии

- Принцип "песочных часов" - изменение ключевого фермента в метаболической системе; уменьшение активности ферментных систем, сопровождающееся увеличением концентрации субстрата; изменение соотношений активности ферментов одного цикла; компенсаторное увеличение активности ферментной системы, для которой яд является субстратом и др.

- Токсико-кинетические критерии

- Относительное уменьшение выведения слабо метаболизируемого яда; относительное угнетение метаболизации веществ; двойное превышение нормального выведения вещества, являющегося одновременно естественным метаболитом и др.

Совокупность вышеприведенных принципов и методических приемов дает возможность более дифференцированно подходить к обоснованию критериев вредности изменений изучаемых показателей и, следовательно устанавливать наиболее точные величины пороговой и максимальной недействующей концентрации.

Вместе с тем, величины пороговых и максимальных недействующих концентраций, как и вся зависимость "концентрация-эффект" имеют вероятностный характер и связаны с видовой и индивидуальной чувствительностью к изучаемому веществу различных животных. Поэтому в рамках проведенного эксперимента целесообразно установить вероятностные параметры этой зависимости и, в первую очередь, вероятностные значения пороговых и недействующих уровней химических загрязнений атмосферного воздуха, что не всегда возможно при использовании среднегрупповых значений изменений тех или иных функциональных показателей состояния организма.

Установление вероятностных значений пороговых и подпороговых уровней имеет особо важное значение при наличии сомнений в величине максимальной неэффективной концентрации или в тех случаях, когда разрыв между пороговой и выявленной недействующей концентрацией является очень большим (например, достигает одного порядка);

Для определения вероятностных значений пороговых величин целесообразно осуществлять переход от градированной формы учета эффекта к альтернативной. Это возможно, в частности, в тех случаях, когда известен критерий вредности градированного сдвига. Так, многочисленными исследованиями установлено, что понижение активности ацетилхолинэстеразы эритроцитов и холинэстеразы сыворотки на 25 и более процентов от исходной величины может рассматриваться как признак неблагоприятного влияния. Указанное дает основание в опытах на лабораторных животных принимать снижение активности фермента на 25% и более за проявление вредного влияния и на этой основе переводить градированный показатель в альтернативный.

При отсутствии таких данных аналогичный подход возможен и при оценке других градированных показателей, только в тех случаях, когда можно судить о биологической значимости наблюдаемых сдвигов. Для определения биологической значимости отклонений различных показателей можно использовать сочетание вышеприведенных подходов, а в качестве количественных критериев градированного сдвига принимать статистические параметры, устанавливаемые дифференцированно в зависимости от категории показателя. Такими критериями могут быть изменения показателя, выходящие: за пределы одной сигмы от средней величины показателя в контроле или фоне с учетом малой выборки для "жестких" показателей; за пределы - для "пластичных" показателей (коэффициент вариации - 10-30%); за пределы 2-х сигм для "пластичных" показателей, имеющих коэффициент вариации - 30-50%, и более двух сигм - для "высокопластичных" показателей, у которых коэффициент вариации превышает 50%.

4.2.4.1 Установление количественного выражения зависимости "концентрация-эффект" по альтернативным показателям.

С целью установления вероятностных параметров зависимости "концентрация-эффект", необходимо градированные показатели перевести в альтернативные.

Для этого до воздействия изучаемого соединения у всех подопытных и контрольных животных вычисляется среднее арифметическое значение изучаемого показателя и его стандартная ошибка. В качестве границ нормы используется отклонение от установленной средней величины, кратное сигнальному отклонению, устанавливаемое дифференцированно в зависимости от категории показателей (то есть от одной сигмы до 2-х и более). В тех случаях, когда изменения величин исследуемых показателей у каждого подопытного животного выходят за пределы принятой нормы, они принимаются как значимые.

В процессе эксперимента на основе динамического наблюдения за животными регистрируется время наступления значимых изменений у каждого животного по исследуемому показателю с учетом принятого количественного критерия перехода от градированной формы учета эффекта к альтернативной. В соответствии с выявленными аначимыми изменениями проводится расчет числа животных, у которых наблюдалось изменение этого показателя в данный момент, и общего числа подопытных животных данной группы, у которых к этому же времени наблюдался аналогичный эффект. Полученное число выражается в процентах по отношению к общему числу животных в данной опытной группе, т.е. вычистляется кумулятивная частота. Данные по всем группам (при воздействии каждой концентрации и по каждому из изучаемых показателей) записываются в таблицу, макет которой представлен ниже

Таблица 4.2.4.1.1

Макет таблицы для регистрации кумулятивной частоты наступления альтернативного эффекта у подопытных животных (по исследуемому показателю)

Концентрация N группы	Сроки исследования, час	Число животных в группе	Число животных, у которых наступил эффект к данному времени	Общее число животных, у которых наступил эффект	Кумулятивная частота, %

В соответствии с кумулятивными частотами строятся кривые зависимости вероятности (частоты) наступления эффекта от времени воздействия определенной (каждой) концентрации вещества. На логарифмически-пробитной сетке указанные кривые аппроксимируются прямыми, для выравнивания прямолинейной функции целесообразно использовать метод наименьших квадратов и описать их соответствующими уравнениями регрессии (рис. 4.2.4.1.1).

Прямые зависимости вероятности (частоты) наступления эффекта от времени воздействия данной концентрации вещества используются для получения данных, необходимых для построения зависимости "концентрация-эффект". Такой методический прием позволяет определять зависимость "концентрация-эффект" к различным срокам ингаляционного воздействия вещества (рис. 4.2.4.1.1.).

Поскольку для установления ПДК атмосферных загрязнений пороговые концентрации определяются для 2-4-месячного срока воздействия изучаемых веществ, поскольку зависимость "концентрация-эффект" должна быть установлена к этому сроку экспозиции.

Данные для построения количественной зависимости "концентрация-эффект" для различных показателей в хроническом эксперименте заносятся в таблицу 4.2.4.1.2.

Таблица 4.2.4.1.2.

Концентрация,	Процент животных, у которых наблюдается эффект

В соответствии с данными таблицы 4.2.4.1.2., на логарифмически пробитной сетке строятся прямые зависимости "концентрация-эффект" (рис. 4.2.4.1.2.). Для выравнивания прямолинейной функции в этом случае также целесообразно использовать метод наименьших квадратов.

Как видно на рис. 4.2.4.1.2., полученные прямые "концентрация-эффект" позволяют определить, какова вероятность (частота) наступления эффекта в зависимоти от концентрации вещества в воздухе, то есть дают возможность установить пороговые концентрации, вызывающие наступление различных функциональных изменений у 10, 20, 30 и любого процента животных.

Для более точного установления вероятностной пороговой величины целесообразно учитывать уровень спонтанных эффектов в параллельном контроле по исследуемому показателю. С этой целью устанавливается, у скольких животных в контроле наблюдалось значимое изменение показателя, выходящее за пределы принятой нормы с учетом аналогичного критерия вредности градированного сдвига, который использовался у животных опытной группы. Полученное число выражается в процентах по отношению к общему числу животных в данной контрольной группе. Затем на уровне установленного спонтанного фона проводится прямая, параллельная оси абсцисс (рис. 4.2.4.1.2.) до пересечения с экспериментально установленной прямой "концентрация-эффект" по изучаемому показателю, и из точки пересечения опускается перпендикуляр до оси абсцисс. На оси абсцисс определяется значение вероятностной пороговой (минимально действующей) концентрации с учетом вариабельности показателя в параллельном контроле. Таким образом могут быть получены вероятностные значения пороговых (минимально эффективных) концентраций по всем изученным показателям.

Итак, в едином хроническом эксперименте установлены величины пороговой и максимальной неэффективной концентраций по среднегрупповым изменениям показателей, учитываемым в градированной форме, а также значение пороговой (минимально эффективной) концентрации по тому же показателю, но при учете эффекта в альтернативной форме. Эти данные заносятся в таблицу 4.2.4.1.3., макет которой представлен ниже.

Таблица 4.2.4.1.3.

Макеты таблицы для регистрации пороговых и недействующих концентраций по различным показателям функционального состояния организма экспериментальных животных

Показатель	Пороговая концентрация, полученная при учете эффекта в градированной форме,	Пороговая концентрация, полученная при учете эффекта в альтернативной форме,	Максимальная неэффективная концентрация,

Полученные значения пороговых концентраций по различным показателям могут отличаться по величине, что зависит от чувствительности выбранных тестов к действию вещества. В соответствии с принципом лимитирующего показателя в качестве порога хронического действия выбирают наименьшую величину.

4.2.5. Обработка результатов эксперимента и обоснование ПДК

Для обоснования ПДК атмосферных загрязнений необходимо определить класс опасности вещества и коэффициент запаса для перехода от пороговых величин к недействующим.

4.2.5.1. Определение класса опасности вещества

Химические загрязнения атмосферного воздуха подразделяются на 4 класса опасности: I - чрезвычайно опасные; II - высокоопасные; III - умеренно опасные; IV - малоопасные.

При определении класса опасности вещества учитываются не только количественные параметры токсикометрии, но и качественные характеристики его действия.

Так, вещества, для которых в эпидемиологических исследованиях достоверно установлено канцерогенное действие на человека, должны относиться к I классу опасности.

В качестве же количественных критериев для обоснования классификации химических загрязнений атмосферного воздуха по общетоксическому действию целесообразно использовать следующие параметры токсикометрии:

- средняя смертельная концентрация ,

- средняя смертельная доза , мг/кг

- зона острого действия -

- зона хронического действия -

- зона биологического действия -

- зона специфического действия -

- порог хронического действия,

- максимальная неэффективная концентрация,

Определение вышеуказанных параметров позволяет более полно охарактеризовать вещество в отношении его реальной опасности, так как, например, абсолютное значение порога вредного действия обратно пропорционально опасности вещества, т.е. чем пороги ниже, тем опаснее вещество; зона острого действия свидетельствует об опасности острого отравления, чем она меньше, тем вещество опаснее для развития острого отравления; такие же показатели как зона хронического или биологического действия являются важнейшими для характеристики опасности хронического отравления, так как они отражают кумулятивные свойства вещества - чем шире величины этих зон, тем кумулятивнее вещество и тем оно опаснее в отношении развития хронических эффектов.

Следовательно, классификация опасности химических загрязнений атмосферного воздуха базируется на следующих критериях (таблица 4.2.5.1.1.).

Таблица 4.2.5.1.1.

Параметры токсикометрии, используемые для установления класса опасности химических загрязнений атмосферного воздуха

Показатели токсикометрии	N	Вес	Количественные критерии для класса опасности
			I	II	III	IV
Средняя смертельная концентрация	1	0,5	<500	500-5000	5001-50000	>50000
Средняя смертельная доза	2	0,5	<15	15-150	151-1500	>1500
Зона острого действия	3	0,75	<6	6-18	18,1-54	>54
Зона хронического действия	4	1,25	>625	625-126	125-25	<25
Зона биологического действия	5	1,25	>50000	50000-5001	5000-500	<500
Зона специфического действия	6	1,25	>9	9-3,1	3-1,0	<1,0
Значение наименьшей величины порога хронического действия	7	1,0	<0,01	0,01-0,1	0,11-1,0	>1,0
Значение максимальной недействующей или минимальной эффективной концентрации (с учетом спонтанного фона)	8	1,0	<0,001	0,001-0,01	0,011-0,5	>0,5

С учетом вышеуказанных параметров (таблица 4.2.5.1.1.) формируется интегральный показатель опасности вещества В (коэффициент опасности). Значения этого показателя заключены между 0 и 1. При этом с увеличением величины коэффициента В в этих пределах опасность вещества возрастает.

Для каждого вещества интегральный показатель опасности В рассчитывается по формуле:

, где (4.2.5.1.1.)

N - число учтенных параметров для оценки опасности данного вещества (согласно таблице 4.2.5.1.1.);

i - порядковый номер параметра;

- вес (i-го) параметра, который определяется значимостью показателя в определении опасности вещества;

- численное значение i-го параметра;

- нормировочный множитель (4.2.5.1.1.а)

Систему весов в зависимости от значимости показателя следует учитывать в следующем виде (см. таблицу 4.2.5.1.1.):

для i = 1; для i = 2;

для i = 3; для i = 4;

для i = 5; для i = 6;

для i = 7; для i = 8;

Если при оценке опасности вещества учитываются все восемь показателей токсикометрии (N = 8), то в соответствии с выбранной системой весов нормировочный множитель будет равен:

В тех случаях, когда для установления класса опасности вещества не представляется возможным определить все восемь параметров, то можно проводить оценку его опасности на основе меньшего их числа, но не менее 4-х и с обязательным использованием хотя бы одного показателя, имеющего наибольшую значимость для характеристики кумулятивных свойств вещества и возможной опасности хронического отравления. Тогда отсутствующие члены (i) в суммах для вычисления V и В не учитываются. Например, отсутствует информация о зонах специфического и острого действия. В этом случае нормировочный множитель при N = 6 будет равен:

Для определения численного значения y i-го параметра используются аналитические зависимости:

1. Средняя смертельная концентрация (i = 1)
	(4.2.5.1.2.)
	где С - средняя смертельная концентрация
2. Средняя смертельная доза (i = 2)
	(4.2.5.1.3.)
	где Д - средняя смертельная доза
3. Зона острого действия (i = 3)
	(4.2.5.1.4.)
	где - величина зоны острого действия
4. Зона хронического действия (i = 4)
	(4.2.5.1.5.)
	где - величина зоны хронического действия
5. Зона биологического действия (i = 5)
	(4.2.5.1.6.)
	где - величина зоны биологического действия
6. Зона специфического действия (i = 6)
	(4.2.5.1.7.)
	где - величина зоны специфического действия
7. Порог хронического действия (i = 7)
	(4.2.5.1.8.)
	где - порог хронического действия
8. Максимальная неэффективная или минимальная эффективная концентрация, полученная по альтернативным показателям с учетом спонтанных эффектов в параллельном контроле (i = 8)
	(4.2.5.1.9.)
	где МНК - величина максимальной неэффективной или минимальной эффективной концентрации

Полученные значения y для i-тых параметров представляются в формулу 4.2.5.1.1. и с учетом весовых коэффициентов показателя рассчитывается интегральный показатель опасности вещества В.

Пример расчета интегрального показателя опасности В для анилина.

Установлены следующие токсикометрические показатели анилина (таблица 4.2.5.1.2.).

Таблица 4.2.5.1.2.

Параметры токсикометрии анилина, используемые для расчета интегрального показателя опасности В

Показатель	Порядковый номер i	Вес	Количественное значение
Средняя смертельная концентрация,	1	0,5	1120
Средняя смертельная доза, мг/кг	2	0,5	750
Зона острого действия	3	0,75	5,3
Зона хронического действия	4	1,25	700
Зона биологического действия	5	1,25	3733
Порог хронического действия	7	1,0	0,3
Максимальная недействующая концентрация	8	1,0	0,03

На основании данных таблицы 4.2.5.1.2. рассчитываются численные значения i-тых параметров:

1. Так как С > 500 -

2. При Д > 15 -

3. При -

4. При -

5. При -

6. Зона специфического действия не определилась.

7. При -

8. При МНК > 0,001 -

После определения рассчитывается нормировочный множитель (формула 4.2.5.1.1.а). В связи с тем, что i = 6 отсутствует, нормировочный множитель для N = 7 составляет: ;

С учетом выбранной системы весовых коэффициентов для каждого параметра и рассчитанного нормировочного множителя определяется интегральный показатель опасности В для анилина согласно формуле 4.2.5.1.1.

Таким образом может быть установлен интегральный показатель опасности В для любого изучаемого вещества. В соответствии с различными значениями интегрального показателя опасности В, заключенными между 0 и 1, класс опасности вещества определяется по таблице 4.2.5.1.3.

Таблица 4.2.5.1.3.

Классификация опасности химических загрязнений атмосферного воздуха

Интегральный показатель опасности В	Класс опасности вещества
I	II
>0,72	I класс
0,72 - >0,55	II класс
0,55 -	III класс
<0,38	IV класс

Как видно из таблицы 4.2.5.1.3., анилин, для которого установлен интегральный показатель В, равный - 0,66, может быть отнесен ко 2-му классу опасности.

4.2.5.2. Определение коэффициента запаса

Для перехода от пороговой концентрации, установленной в эксперименте, к недействующей величине необходимо использовать коэффициент запаса или так называемый фактор безопасности. Коэффициент запаса представляет собой отношение величины порога хронического действия к величине предельно допустимой концентрации .

Обоснование количественных критериев коэффициентов запаса в каждом конкретном случае должно осуществляться с учетом: общего представления об опасности вещества как по параметрам токсикометрии, так и по качественным показателям его действия; условий и факторов, влияющих на точность обоснованных в эксперименте пороговых величин; коэффициента экстраполяции данных, полученных на ограниченном числе экспериментальных животных на человеческую популяцию.

Принимая во внимание значение всех факторов, коэффициент запаса должен быть тем больше по величине, чем кумулятивнее вещество и чем оно опаснее в отношении развития хронических эффектов.

Учитывая, что интегральный показатель В характеризует степень опасности вещества, для атмосферных загрязнений, обладающих общетоксическим действием, рекомендуются дифференцированные коэффициенты запаса в зависимости от величины показателя В, которые рассчитываются по формуле: (4.2.5.2.1.).

Как видно из формулы 4.2.5.2.1., наибольший коэффициент запаса, равный 10, будет у веществ, для которых интегральный показатель В = 1, а наименьший - составляет 1 при В = 0.

Следовательно, если для анилина установлен интегральный показатель В = 0,66, то коэффициент запаса, используемый для перехода от пороговой концентрации к недействующей, будет равен:

4.2.5.3. Установление ПДК атмосферных загрязнений.

Для обоснования среднесуточной ПДК берется наименьшая из пороговых величин, установленных по различным градированным показателям (таблица 4.2.4.1.3), на основании которой определяется расчетная недействующая концентрация изучаемости вещества. С этой целью эту величину следует разделить на коэффициент запаса, рассчитанный в соответствии с интегральным показателем опасности вещества В по формуле 4.2.5.2.1.

Полученное значение принимается за основу при обосновании среднесуточной ПДК вещества с учетом его резорбтивного действия на организм. Вместе с тем, для повышения надежности и безопасности для здоровья устанавливаемого норматива полученную расчетную недействующую концентрацию целесообразно сопоставить со значениями вероятностной пороговой (минимально эффективной) концентрации, установленной по альтернативным показателям, с учетом уровня спонтанного фона в параллельном контроле, и максимальной неэффективной концентрации, если таковая выявлена в эксперименте (таблица 4.2.4.1.3), по всем изучаемым показателям функционального состояния организма.

В связи с этим при представлении материалов по обоснованию ПДК в Секцию необходимо указать значения этих трех величин и на основании анализа в каждом конкретном случае Секция будет принимать решение о величине среднесуточной ПДК, рекомендуемой к утверждению МЗ СССР.

В дополнение к установленной среднесуточной ПДК для веществ преимущественно резорбтивного действия устанавливается максимальная разовая концентрация на уровне 98% вероятности ее появления в хроническом эксперименте с учетом того же коэффициента запаса, который использовался при обосновании среднесуточной ПДК.

В приложении 4.2.1 приведена методика расчета средней и 98% концентраций за весь период хронического эксперимента по данным ежесуточных наблюдений, которые являются основой для установления среднесуточной ПДК и в дополнение к ней максимальной разовой концентрации.

4.3. Обоснование ПДК веществ с цчетом специфических эффектов

4.3.1. Методика обоснования ПДК веществ, обладающих аллергенным действием

Изучение опасности развития аллергии при ингаляционном пути поступления веществ имеет в настоящее время чрезвычайно важное значение. Увеличение аллергических заболеваний среди населения приводит к необходимости выявления сенсибилизирующего действия при установлении ПДК вещества в атмосферном воздухе. Тем более, как это установлено, пороги специфического (сенсибилизирующего) действия многих аллергенов ниже порогов токсического действия.

При этом следует оценивать взаимосвязь аллергической, аутоиммунной и антиинфекционной реактивности.

Для выявления сенсибилизации можно использовать методики, изложенные в "Методических рекомендациях по постановке исследований по гигиеническому нормированию промышленных аллергенов в воздухе рабочей зоны" о учетом того, что уровень ПДК рабочей зоны рассчитан на практически здоровых людей, а ПДК атмосферного воздуха должна обеспечить безопасный уровень для всего населения (старики, больные, дети), т.е. должна быть жесткой. Исследование рекомендуется проводить в два этапа.

Исследования можно проводить на различных видах животных, но предпочтение должно отдаваться морским свинкам белой масти или белым крысам. Количество животных в группах должно быть одинаковым и не менее 10-15.

Ингаляционному воздействию подвергают группу животных в течение 4-6 месяцев. При этом концентрация вещества должна соответствовать , и на порядок ниже, что устраняет возможность подавления аллергической реакции при развитии интоксикации и позволяет определить величину пороговой концентрации по сенсибилизирующему объекту .

Выявление и течение возникшей аллергической реакции проводят через 2-4 недели, а в дальнейшем ежемесячно, хотя желательно как можно чаще. Обязательно проведение изучения реакции и в восстановительный период, т.к. возможное снижение уровней аллергических реакций под влиянием токсических свойств вещества затем может проявиться.

Сенсибилизирующий эффект оценивают как по среднегрупповым показателям в сравнении с контрольной группой, так и по числу выявленных сенсибилизированных животных в каждой группе.

Для выявления неспецифического иммунного влияния вещества можно использовать дополнительные методы: изучение количества эозинофилов и базофилов, фагоцитарная активность нейтрофилов, аутофлора кожи и т.д.

Статистическая обработка ведется путем определения критерия (t) - Стьюдента, критерия X.

Неспецифические показатели оцениваются методом "двух сигм".

Опасность аллергенов следует оценивать по результатам всех проведенных опытов. Наибольшую опасность будут представлять вещества, у которых в несколько раз ниже величины и их следует регламентировать по сенсибилизирующему свойству. При достижении недействующей концентрации коэффициент запаса не вводится. Если в результате эксперимента и равны, следует учитывать влияние данного вещества на естественный иммунитет.

При высоких значениях величины пo сравнению с уровень ПДК устанавливается без учета аллергенных свойств.

Согласно существующим требованиям методы оценки аллергенной опасности должны выявлять сенсибилизацию как к сильным, так и слабым аллергенам, быть, по возможности, экономичными и выявлять сенсибилизацию в максимально короткий срок. Оценку аллергенной опасности следует проводить в два этапа.

На первом этапе используется ускоренный метод оценки сенсибилизирующей способности нормируемого вещества, которые позволяет, с одной стороны, установить способность вещества вызвать состояние сенсибилизации, а с другой - выявить тип аллергической реакции на данное вещество. Это дает возможность судить о направленности действия вещества на определенное звено иммунитета и выбрать минимальный набор тестов для дальнейших исследований.

На втором этапе проводится оценка состояния сенсибилизации организма.

Для оценки сенсибилизирующей способности нормируемого химического вещества в эксперименте (I этап) рекомендуются следующие тесты:

- оценка анафилактогенной активности в реакции общей анафилаксии;

- реакция активной кожной анафилаксии;

- реакция повышенной чувствительности замедленного типа (ПЧЗТ).

Для оценки состояния сенсибилизации организма к нормируемому веществу (II этап) рекомендуются следующие технически простые методы исследования:

для выявления клеточной реакции на аллерген in vitro - реакция специфического лизиса лейкоцитов (PСЛЛ), специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ);

- для определения гуморальных антител - реакция специфической микропреципитации (РСМП), определение специфических бляшко- и розеткообразующих лимфоцитов.

4.3.2. Методика обоснования ПДК для веществ, обладающих эмбриотропным действием

Многочислеными исследованиями установлено, что многие токсические вещества, загрязняющие атмосферный воздух населенных мест обладают способностью воздействия на гонады и эмбрион. Все это в свою очередь создает опасность влияния на процессы оплодотворения и зачатия, нарушая репродуктивную функцию.

Полученные в результате этих исследований данные говорят о более высокой чувствительности и ранимости организма в период беременности, а также об изменениях ряда показателей генеративной функции при воздействии токсических агентов в концентрациях на уровне пороговых и подпороговых по общетоксическому действию.

Изучение эмбриотропного действия, учитывая высокую чувствительность метода и короткие сроки эксперимента, может рассматриваться как экспресс-метод при гигиеническом обосновании ПДК атмосферных соединений.

Термин эмбриотропное действие наиболее полно характеризует круг нарушений во время беременности как у матери, так и плода, а поэтому объединяет понятия эбриотоксического и тератогенного действия.

Оценку эмбриотропного действия химических соединений целесообразно проводить на белых беспородных крысах. Это подтверждается рекомендациями изданий ВОЗ и опытом ряда авторов. Эмбрионы крыс обладают большей устойчивостью к альтерирующим агентам, чем эмбрионы, например, мышей. У крыс обычно отсутствуют спонтанные уродства. У самок белых крыс высокая плодовитость (8-10 экземпляров). У них легче устанавливается начало беременности. Плацента и ряд некоторых других систем человека и белых крыс имеют общие структурные и функциональные особенности.

Новые неизученные токсические вещества необходимо испытывать в концентрациях от больших к меньшим, начиная с уровня 1/5 - 1/10 до уровня пороговых концентраций с целью выявления реальной и потенциальной опасности этих веществ и установления порога их действия.

В том случае, когда ПДК химических веществ установлена по общетоксическому действию, для изучения эмбриотропного эффекта выбирают концентрации находящиеся на уровне установленной ПДК, в 5-10 раз ниже и в несколько раз (5-10) выше ПДК.

Путь введения и режим воздействия токсических веществ должен быть адекватен реальным условиям окружающей среды. В частности атмосферному воздуху адекватен ингаляционный путь введения вещества в организм. Поэтому вещество должно быть испытано ингаляционным путем, круглосуточно в течение всей беременности (21 день). В каждой из групп должно быть 20-30 половозрелых самок массой 180-250 г. (статистическая группа).

Для оплодотворения беспородных самок            вечером подсаживают к самцам в соотношении 5:1 без учета стадии эстрального цикла или в соотношении 2:1 в стадии проэструс и эструс. Первый день беременности определяется по наличию сперматозоидов в вагинальных мазках. Целесообразно считать беременными только тех животных, в мазках которых число сперматозоидов превышает 15-20 на 300 эпителиальных клеток без ядер.

Для определения сперматозоидов в вагинальных мазках глазной пипеткой вводится во влагалище несколько капель физраствора или дистиллированной воды. Введенная жидкость отсасывается обратно, наносится на предметное стекло и без окраски рассматривается под малым увеличением микроскопа.

В течение 21 дня оплодотворенные самки находятся в затравочных камерах, в которых подвергаются ингаляционному воздействию исследуемым веществом.

На 21 день беременности 70% самок от общего их количества в каждой группе забиваются. 30% самок оставляются до естественных родов с тем, чтобы иметь возможность проследить за развитием потомства.

Рекомендуемые методы исследования эмбриотропного действия изложены в "Методических указаниях - Методы изучения отдаленных последствий действия химических загрязнений атмосферного воздуха", Владивосток, 1978.

Результаты исследования обязательно подвергаются статистической обработке. Прежде всего результаты оцениваются на достоверность полученных сдвигов по сравнению с контрольными группами животных (вычисление критерия t, V - критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и др. непараметрических критериев).

Конечной целью проводимых экспериментальных исследований является определение количественных уровней пороговых и максимально недействующих концентраций для обоснования ПДК химических веществ в атмосферном воздухе (табл. 4.3.2.2.).

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду "табл. 4.3.2.1."

С помощью вычисления (соотношение порога общетоксического действия к порогу эмбриотропного), можно определить потенциальную опасность (класс опасности) химических веществ по эмбриотоксическому эффекту (табл. 4.3.2.1.).

Таблица 4.3.2.1.

Класс опасности
I	>9
II	3,1-9
III	1,1-3
IV

Итоговая таблица по оценке эмбриотропного действия химических веществ при гигиеническом нормировании

Общетоксическая МНК	Специфическая МНК	ПДК
МНК - максимально недействующая концентрация

4.3.3. Методика обоснования ПДК веществ, обладающих гонадотропным действием

Опасность воздействия химических веществ на живой организм в том, что может натупить поражение половых желез, что в свою очередь приводит к нарушению оплодотворяющей способности, способности к зачатию и к нарушению развития плода. Этим обусловлена необходимость применения метода изучения гонадотропного действия при обосновании ссПДК атмосферных загрязнений.

Наилучшей моделью для изучения гонадотропного действия, по мнению многих исследователей, являются белые беспородные крысы. Они весьма тонко реагируют на изменения внешней среды.

При изучении гонадотропного действия атмосферных загрязнений на самцах и самках белых крыс, токсический изучаемый агент вводится ингаляционно круглосуточно в течение 3-4 месяцев, так же как и при изучении общетоксического действия. На каждую исследуемую концентрацию следует иметь две группы животных (самок и самцов) опытных и группы контрольных на все концентрации. В каждой группе должно быть не менее 20 животных. После 3-4 месяцев затравки самок и самцов спаривают и определяют оплодотворяющую способность и способность к зачатию. При более глубоком изучении определяют состояние потомства (см. 4.3.2.).

Исследования на самках включают изучение эстрального цикла, морфологии и биохимии яичников и способность самок в зачатию.

Изучение эстрального цикла проводится у самок белых крыс массой 160-180 г одного возраста (4-5 месяцев) с установившимся половым циклом. Перед началом эксперимента у животных в течение 10-14 дней проводится определение длительности всех стадий эсктрального цикла методом влагалищных мазков.

Большое влияние на продолжительность цикла могут оказывать время года, возраст животных, климатический пояс и условия содержания животных, поэтому необходимо параллельное исследование контрольной группы.

После окончания хронической интоксикации проверяют способность самок к зачатию. Часть подопытных самок спариваются с интактными самцами. Во время спаривания и всего течения беременности самки подвергаются действию токсических веществ. Они находятся в условиях чистого воздуха. Оценивается процент забеременевших самок, продолжительность беременности и плодовитость. Потомство, полученное от затравленных до беременности самок обследуется в обычном порядке (см. 4.3.2.).

Исследования на самцах включают изучение функционального состояния семенников, их морфологию и биохимию. После окончания хронической интоксикации проверяют способность самцов к оплодотворению. Для этого часть затравленных самцов каждой группы спаривают с интактными самками. Во время спаривания, а затем во время периода беременности самок не подвергают воздействию токсических веществ. Учитывается процент забеременевших самок, продолжительность беременности, плодовитость. Потомство обследуется в обычном порядке (см. 4.3.2.).

Рекомендуемые методы изучения гонадотоксического действия изложены в "Методических указаниях...".

Таблица 4.3.3.1.

Итоговая таблица по оценке гонадотропного действия химических веществ при гигиеническом нормировании

Подпороговая (МНК) по общетоксическому действию	Подпороговая (МНК) по гонадотропному действию	ПДК

4.3.4. Методика обоснования ПДК веществ, обладающих мутагенным действием

Одним из опасных видов отдаленных эффектов является способность веществ вызывать наследуемые изменения генетического материала в клетках человека (мутации). Мутации в половых клетках могут приводить к спонтанным абортам, мертворождениям, врожденным порокам развития, повышению числа наследственных заболеваний. Мутации в соматических клетках связаны с процессами канцерогенеза, старения, с нарушениями эмбрионального развития и др.

Общими положениями при изучении мутагенного действия являются:

- анализ мутагенной активности - обязательная составная часть исследований по гигиеническому обоснованию ПДК;

- этапность исследований: I этап - выявление мутагенов,

II этап - количественная оценка эффекта в опытах на млекопитающих,

III этап - установление "допустимой концентрации" мутагена;

- использование для регламентирования только данных экспериментов на млекопитающих. Оценка мутаций в соматических и половых клетках;

- обязательный анализ зависимости мутагенного эффекта от концентрации вещества. Определение по результатам экспериментов "допустимой концентрации" мутагена, которая, наряду с другими показателями неблагоприятного действия вещества, должна учитываться при обосновании ПДК;

- определение на каждом этапе основных и дополнительных методов. К основным относятся современные методы, отвечающие задачам этапа, чувствительные, воспроизводимые, практически и технически выполнимые в лабораториях. Дополнительные методы также отвечают задачам этапа, но в силу методических сложностей, высокой трудоемкости, недостаточной воспроизводимости и, в ряде случаев, меньшей чувствительности не могут в настоящее время широко внедряться в гигиеническую практику;

- используемые методы требуют высокой квалификации и должны проводиться сотрудниками, прошедшими специализацию в этой области.

Данные положения были положены в основу этапной схемы оценки мутагенной активности загрязнителей атмосферного воздуха при их гигиеническом регламентировании (табл. 4.3.4.1.).

Таблица 4.3.4.1.

Этапная схема оценки мутагенной активности химических загрязнителей атмосферного воздуха при их гигиеническом регламентировании

Этап	Цель этапа	Основные методы	Решение
I	Выявление мутагенов	1. Анализ данных литературы 2. Учет рецессивных летальных мутаций у дрозофилы или тест Эймса 3. Микроядерный тест в остром опыте на мышах	1. Вещество не мутаген - регламентирование без учета мутагенности 2. Вещество мутаген - исследование на этапе II
II	Количественная оценка мутагенной активности в опытах на млекопитающих	1. Метафазный анализ аберраций хромосом в клетках костного мозга 2. Учет доминантных летальных мутаций у самцов	Установление минимально-действующей концентрации мутагена
III	Определение допустимой концентрации мутагена		Регламентирование содержания вещества с учетом мутагенной активности

Этап I - выявление мутагенов

Большое число не изученных на мутагенную активность химических соединений, незначительная доля ожидаемых среди них мутагенов и трудоемкость количественных исследований на млекопитающих делает необходимым этап выявления мутагенов в системе оценки мутагенной активности загрязнителей атмосферного воздуха. Методы, используемые на этом этапе, должны быть информативны, просты и нетрудоемки. В качестве основных методов рекомендованы: 1) анализ данных литературы; 2) учет регрессивных летальных мутаций у дрозофилы или полуколичественный метод учета генных мутаций на S. tuphimurium; 3) анализ полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в костном мозге мышей (микроядерный тест).

Вещества, не проявившие мутагенную активность на этапе, регламентируются без учета мутагенных свойств. Вещества, обнаружившие мутагенный эффект в исследованиях на этапе I, относятся к потенциальным мутагенам и должны быть изучены на этапе II.

По результатам этапа I можно составить приоритетный список веществ очередности исследований на этапе II.

В первую (высокоприоритетную) группу входят вещества:

а) показавшие по данным литературы мутагенную активность в наблюдениях на человеке и в опытах на млекопитающих;

б) проявившие мутагенную активность с выраженной зависимостью "доза-эффект" на ряде тест-объектов (по данным литературы);

в) индуцирующие мутации на всех тестах этапа.

Вторая группа (средней приоритетности) включает вещества, мутагенная активность которых показана по данным литературы на одном или двух тест-объектах (клетки млекопитающих и человека in vitro, дрозофила, микроорганизмы) или одном тесте этапа с выраженной зависимостью эффекта от дозы (концентрации).

К третьей группе (низкоприоритетные) относятся вещества, мутагенность которых показана в одном из тестов этапа или по данным литературы на 1-2 тестах (за исключением опытов на млекопитающих) при действии доз (концентраций), близких к летальным, без выраженной зависимости эффекта от дозы (концентрации).

Очередность изучения вещества на этапе II зависит от степени его распространения в окружающей среде. Широко распространенные вещества, относящиеся ко второй и даже третьей группе, должны исследоваться в первую очередь.

Этап II. Количественная оценка мутагенной активности в опытах на млекопитающих

На втором этапе исследуется мутагенная активность веществ, показавших положительный эффект на этапе I. Ососнование методов и схем экспериментов (концентрации, длительность) даны в работе В.С. Журкова (1986 г.). В качестве основных тестов рекомендованы анализ аберраций хромосом в клетках костного мозга млекопитающих и анализ доминантных летальных мутаций в половых клетках самцов млекопитащих.

По результатам исследований на этапе II вещества подразделяются на 2 группы: а) не показавшие мутагенной активности; б) обнаружившие мутагенный эффект. Для последней группы устанавливается минимально действующая концентрация мутагена (МДК мут.) - та концентрация вещества, при которой отмечено статистически значимое повышение частоты мутаций в опытной группе по сравнению с контрольной. По возможности дается аналитическое описание зависимости "концентрация-эффект".

Этап III - определение "допустимой концентрации" мутагена и обоснование ПДК веществ, обладающих мутагенным эффектом

Для веществ, показавших эффект на этапе II, устанавливается "допустимая концентрация" мутагена. Принимается, что максимальное превышение спонтанного уровня мутаций от действия отдельного средового мутагена не должно превышать 1%. Поскольку используемые на этапе II основные методы и схемы экспериментов на млекопитающих позволяют достоверно выявлять повышение частоты мутационных событий в опыте над контролем на 100-200%, то "допустимая концентраци" мутагена (ДК мут.) может быть рассчитана по формуле:

,

где - минимально-действующая концентрация, при которой было статистически значимое повышение частоты мутаций под контролем в наиболее чувствительном тесте. Если зависимость "концентрация-эффект" описана аналитически, то вычисление ДКмут проводится по соответствующему уравнению.

При регламентировании химических загрязнителей, обладающих мутагенной активностью, проводится сравнение ДКмут с ПДК вещества, установленной по лимитирующему показателю вредности. При ДКмут = ПДК регламент не меняется. При ДКмут > ПДК регламент устанавливается на уровне ДКмут, т.е. мутагенный эффект является лимитирующим.

Рекомендуемые методики изучения мутагенной активности на разных этапах изложены в "Методических указаниях по изучению мутагенной активности химических веществ" при обосновании их ПДК в воде", утв. ГСЭУ МЗ СССР 12 июня 1986 г. N 4110-86.

4.3.5. Методика обоснования ПДК веществ, обладающих канцерогенным действием

Отбор химических веществ для нормирования их в атмосферном воздухе с учетом канцерогенной опасности следует осуществлять на основании принципа приоритетности. Критериями очередности такого отбора являются:

1) установленный в эпидемиологических наблюдениях за профессиональными группами или контингентами населения, контактирующими с определенным химическим веществом, повышенный риск заболеваемости злокачественными новообразованиями;

2) наличие и степень бластомогенной активности химических соединений, выявленных при экстремальных исследованиях (тестировании);

3) масштабы производства и использования химических веществ, обладающих бластомогенным действием;

4) распространенность и стабильность химических канцерогенов в окружающей среде, возможность их включения в природные цепи и т.п.

Схема определения допустимого уровня содержания канцерогенных веществ в атмосферном воздухе включает следующие этапы:

- испытание различных доз канцерогена в диапазоне от оптимальной до минимально эффективной и максимально неэффективной при условии наблюдения за животными в течение естественной продолжительности жизни;

- математическое моделирование зависимостей "доза (концентрация) - эффект" и "доза (концентрация) - время проявления эффекта";

- прогнозирование вероятного риска возникновения опухолей от воздействия малых доз канцерогена, не испытанных в эксперименте, во времени, выходящем за пределы среднестатистической продолжительности жизни животных;

- перенос экспериментальных данных на популяцию в целом;

- экстраполяция допустимой дозы канцерогена с животных на человека;

- расчет ПДК канцерогена в атмосферном воздухе.

4.3.5.1. Выбор животных и условия проведения опыта

При выборе животных необходимо прежде всего учитывать чувствительность их к определенным группам химических веществ и среднюю продолжительность жизни. Наиболее подходящими для испытания химических канцерогенов при введении в органы дыхания являются мыши, крысы, хомячки. Группы рекомендуется формировать на животных обоего пола, в возрасте 1-2 мес. Число животных в группе должно быть достаточным, чтобы получить статистически достоверные результаты (см. прилож. 4.3.5.1, 4.3.5.2).

При испытании малых, близких к пороговым доз (концентраций) вещества, когда в условиях длительных наблюдений возможна гибель животных в связи с интеркуррентными заболеваниями, группы должны состоять не менее чем из 50 животных.

В опыте рекомендуется испытывать не менее 3-4 доз (концентраций), разрыв между которыми в вариационном ряду не должен быть меньше 2-5 кратностей.

Ориентиром при выборе уровней вещества для испытания может служить ожидаемый общетоксический эффект или данные литературы о возможной частоте новообразований.

При определении вариационного ряда доз (концентраций) в качестве исходных следует использовать величины, близкие к порогу общетоксического действия, а также максимально переносимые уровни.

Основным способом испытания канцерогенных веществ при их нормировании в атмосферном воздухе остается ингаляционный. Ингаляционная затравка животных канцерогеном должна осуществляться в специальных камерах, обеспечивающих надежную защиту воздушной среды помещения и обслуживающего персонала от воздействия испытываемого канцерогена, а также эффективную очистку пылегазовоздушной смеси, выбрасываемой из камеры в атмосферу.

Однако, учитывая техническую сложность осуществления таких экспериментов, в частности, при создании концентраций для полициклических ароматических углеводородов, нитрозаминов и др., может быть применено многократное интратрахеальное введение. Учитывая, что метод интратрахеальных инстилляций связан с определенным риском травмирования легких, оптимальным интервалом между отдельными введениями, обеспечивающими восстановление возможных повреждений, является 14-20 дней.

Испытание химических веществ, обладающих канцерогенным действием, должно проводиться в хроническом опыте.

Продолжительность воздействия составляет не менее одной трети продолжительности жизни, что для наиболее распространенных экспериментальных животных (мыши, крысы) составляет 12 мес.

Наблюдение за животными необходимо осуществлять до их естественной гибели.

4.3.5.2.Оценка результатов исследований

Все павшие животные подвергаются тщательному патоморфологическому исследованию. При этом применяются общепринятые, а при необходимости и элективные методы окраски гистологических срезов органов и тканей. Особенное внимание уделяется критическим органам и системам с использованием серийных срезов.

При проведении гигиенической оценки химических канцерогенов следует учитывать, что их действие может проявляться в виде специфических и неспецифических реакций организма, степень выраженности которых находится в зависимости от силы раздражителя. Критерием вредного действия химических канцерогенов является возникновение опухоли.

Анализируя полученные результаты, необходимо прежде всего сравнить частоту, локализацию опухолей и время их появления в опыте и контроле, а при исследовании на линейных животных и с имеющейся характеристикой спонтанных новообразований.

Показателями канцерогенной активности химического вещества являются:

а) частота индуцируемых опухолей;

б) увеличение числа спонтанных новообразований;

в) сокращение латентного периода возникновения опухолей;

г) число опухолей на одно животное.

Расчет неэффективной дозы (концентрации) канцерогена осуществляется на основе выявленных зависимостей "доза (концентрация) - эффект" и "доза (концентрация) - время проявления эффекта", что позволяет определить такую величину вещества, которая не окажет даже "теоретически возможного" бластомогенного действия в пределах естественной продолжительности жизни.

В качестве примера возможных математических моделей, пригодных для описания указанных зависимостей, приводятся модели, использованные при определении ПДК бенз(а)пирена в атмосферном воздухе (см. приложение 4.3.5.3).

Для целей гигиенического нормирования возможно использование и других моделей, выбор которых обуславливается особенностями билогического эксперимента. Комитетом по канцерогенным веществам и ГСЭУ МЗ СССР одобрены и рекомендуются модели логит-преобразования и лог-нормальная, а при расчете ПДК - метод доверительных интревалов, основанный на сравнении результатов с уровнем спонтанного опухолеобразования, метод вероятностных оценок, ориентированный на выявление доз, эффект которых не будет превышать допустимого риска (Методические рекомендации по экспериментальному обоснованию гигиенических регламентов химических канцерогенных веществ: М. МЗ СССР, ГСЭУ. Комитет по канцерогенным веществам, 1985, N 3864-85.).

5. Морфологическое исследование при изучении общерезорбтивного действия атмосферных загрязнений

Общие положения

При морфологическом изучении действия химических веществ атмосферных загрязнений на организм экспериментальных животных необходимо как минимум исследовать верхние дыхательные пути (слизистую носа) и легкие с внутрилегочными разветвлениями бронхов, а также основные органы детоксикации и выведения как печень и почка.

К интегральным показателям токсического действия веществ относится функциональная активность коркового вещества надпочечников, связанная с продукцией кортикостероидных гормонов, а также состояние тучноклеточной системы подкожной соединительной ткани.

В связи с реактивностью этих биосистем целесообразно использовать их изучение при гигиенической оценке атмосферных загрязнений. Изучение морфофункционального состояния обонятельной луковицы, сенсомоторной коры значительно расширяет представления о характере действия химических веществ.

При проведении морфологического анализа необходимо учитывать важность динамического наблюдения. В подострых опытах целесообразно исследование в первые часы и сутки и далее через каждые 3 дня, в хроническом эксперименте возможны продолжительные интервалы между исследованиями (1-1,5 месяца). Для проведения морфо-функционального анализа следует использовать как минимум по 5 животных из каждой группы. Для выявления биологического действия воздушных загрязненй необходимо использовать обзорные методы гистологического анализа и методы функциональной морфологии. К ним относятся качественные гистохимические методы для выявления белков и их функционально-активных групп, нуклеиновых кислот, липидов, мукополисахаридов, аргирофильных структур соединительной ткани, а также гистоферментативные методы изучения активности окислительных и гидролитических ферментов. Изучение окислительных ферментов должно предусматривать оценку ферментов тканевого дыхания, анаэробного гликогенолиза и гексомонофосфатного пути окисления глюкозы. Исследование этих ферментов дает возможность оценить интенсивность различных путей энергообразования в тканях. "Помимо окислительных ферментов очень показательным является активность гидролаз, в частности, неспецифической монофосфатазы-АТФ-азы, являющейся гистохимическим маркером активности плазматических мембран эпителиальных клеток, эндотелия сосудов. АТФ-аза, осуществляющая фосфорилирование макроэрга АТФ, позволяет оценить интенсивность трансформации химической энергии фосфорно-эфирных связей и другие виды энергии".

Помимо применения методов качественной гистохимии целесообразно применение количественных гистохимических методов исследования, гистоавторадиографии, цитофотометрии, интерферометрические, а также электронно-микроскопические методы исследования.

Методология и методические подходы к структурно-функциональному анализу в гигиенических исследованиях, вопросы выбора информативных показателей по отдельным системам нашли отражение в 2-х монографиях, II выпусках методических рекомендаций и методических указаниях/см.           к разделу 5/.

Список литературы

К разделу 2.

2.1. Бартенев В.Д. Микрогазодозатор. Гигиена и санитария, 1963, 7, 46-48.

2.2. Буштуева К.А. Материалы к установлению предельно допустимой концентрации аэрозоля серной кислоты в атмосферном воздухе. В кн.: Предельно допустимые концентрации атмосферных загрязнений. М., Медгиз, 1957, вып. 8, 23-48.

2.3. Гильденскиольд Р.С., Егоренков Г.А. Микродозатор пыли. Бюллетень изобретений, 1970, 15. Авторское свидетельство 269517.

2.4. Гильденскиольд Р.С. Горизонтальная камера для хронической затравки животных мелкодисперсной пылью и газами. Гигиена и санитария, 1971, 3, 79-83.

2.5. Гринь Н.В. Некоторые показатели функционального состояния организма животных при затравке кремнийсодержащей пылью в атмосферном воздухе. Гигиена и санитария, 1969, 6, 97-99.

2.6. Диденко Л.Г. и др. Установка для ингаляционной затравки мелких лабораторных животных субмикронными аэрозолями. Гигиена и санитария, 1982, N 4, 72 с.

2.7. Колеров Д.К. Метрологические основы газоаналитических измерений. М., 1967.

2.8. Кротов Ю.А., Лыкова А.С, Сачков А.В. и др. Санитарно-токсикологическая характеристика эфиров диэтиленгликоля применительно к охране атмосферного воздуха. Гигиена и санитария, 1981, 2, 14-16.

2.9. Пазынич В.М., Хлебников В.В. К методике проведения затравки животных аэрозолями конденсации. Гигиена и санитария, 1978, 1, 113.

2.10. Петров A.M. Автоматический дозатор для непрерывной подачи малых концентраций газов при экспериментальных исследованиях. Гигиена и санитария, 1968, 1, 81.

2.11. Печенникова Е.В., Иродова Е.В. К вопросу о создании концентраций веществ при проведении хронического токсикологического эксперимента. В сб.: Вопросы гигиены труда, профессиональной патологии, промышленной и сельскохозяйственной токсикологии. Тбилиси, НИИ гигиены труда и профзаболеваний им. Н.И. Махвиладзе, 1976, 182-183.

2.12. Радченко Г.А., Белобородов Ю.И. Усовершенствованный прибор для равномерной подачи тонкодисперсной пыли. Гигиена и санитария, 1960, 8, 56.

2.13. Рязанов В.А., Буштуева К.А., Новиков Ю.В. К методике экспериментального обоснования предельно допустимой концентрации атмосферных загрязнений. В кн.: Предельно допустимые концентрации атмосферных загрязнений. М., Медгиз, 1957, вып. 3, 117-151.

2.14. Садилова М.С., Петин Л.М. Экспериментальная установка для затравки животных аэрозолями конденсации. Гигиена и санитария, 1967, 7, 62.

2.15. Саноцкий И.В., Максимов Г.Г. Ингаляционная затравка животных. В кн.: Методы определения токсичности и опасности химических веществ. М., 1970, 69.

2.16. Стренк Ф., Хаба А., Роховецкий А. Дозирование малых количеств пыли с помощью дозатора с зернистым носителем. Гигиена и санитария, 1970, 7, 87.

2.17. Широков Ю.Г. Прибор для распыления порошкообразных веществ в целях их токсикологического исследования. Авторское свидетельство N 133990, 1960.

2.18. Фукс H.A., Мурашкевич Ф.Ф. Лабораторный распределитель. Заводская лаборатория, 1978, 1, 112-114.

2.19. Экштат Б.Я., Степаненко В.Е., Помазова Е.Н. Диффузионный метод получения малых концентраций летучих веществ в гигиенических исследованиях. Гигиена и санитария, 1976, 9, 55-58

К разделу 3.

3.1. Рязанов В.А., Буштуева К.А., Новиков Ю.B. К методике экспериментального обоснования предельно допустимой концентрации атмосферных загрязнений. В кн.: Предельно допустимые концентрации атмосферных загрязнений. М., Медгиз, вып. 3, 117-151.

3.2. Андреещева Н.Г. Методика определения порога запаха атмосферных загрязнителей и статистическая обработка результатов исследования. В кн.: Методические и теоретические вопросы гигиены атмосферного воздуха. М., ИОКГ им. А.Н. Сысина, 1976, 72-74.

3.3. Андреещева Н.Г. Анализ материалов по определению порога запаха веществ при обосновании их максимально разовых ПДК в атмосферном воздухе и вероятностная оценка их методом пробит-анализа. Гигиена и санитария, 1977, 8, 69-74.

3.4. Андреещева Н.Г., Пинигин М.А. О классификации опасности атмосферных загрязнений и выборе коэффициента запаса при обосновании их разовых ПДК. В сб.: Гигиенические аспекты охраны окружающей среды М., ИОКГ им. А.Н. Сысина, 1977, 5, 40-41.

3.5. Андреещева Н.Г., Пинигин М.A. Обоснование максимально разовых ПДК атмосферных загрязнителей по их вероятностным порогам запаха, классам опасности и коэффициентам запаса. Там же, 1978, 6, 75-76.

3.6. Андреещева Н.Г. Гигиеническое регламентирование производных бензола в атмосферном воздухе с учетом класса опасности и коэффициента запаса и сопоставление их с принятыми уровнями максимальных разовых ПДК. Там же, 1978, 6, 76.

3.7. Методические указания по разработке и научному обоснованию предельно допустимых концентраций вредных веществ в воде водоемов. М., МЗ СССР, 1976.

3.8. Тепикина Л.А. К методике вероятностной оценки порога обонятельного ощущения. В кн.: Гигиенические аспекты охраны окружающей среды. М., ИОКГ им. А.Н. Сысина, 1974, 2, 45-47.

3.9. Тепикина Л.А., Щербаков Б.Д. Об аналитическом подходе к оценке порога запаха химических веществ. Там же, 1976, 3, 30-35.

3.10. Тепикина Л.А. и др. Идентификация летучих продуктов пиролиза бурых углей и их гигиеническое нормирование в атмосферном воздухе. Гигиена и санитария, 1988, 9, 66-67.

К разделу 4.

4.1. Беленький М.А. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л., Медицина, 1963, 149.

4.2. Гигиена окружающей среды. (Под ред. Г.И. Сидоренко). М., Медицина, 1985, 303.

4.3. Голиков С.И., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. Л., Медицина, 1986.

4.4. Елизаров О.Н. Определение пороговых доз промышленных ядов при пероральном введении. М., Медицина, 1971, 42-54.

4.5. Каган Ю.C. О вероятностном подходе к установлению пороговых и неэффективных доз при действии химических веществ. Гигиена и санитария, 1978, 12, 74-78.

4.6. Количественная токсикология. Л., Медицина, 1973.

4.7. Красовский Г.Н., 1969 (цит. по кн.: Методические указания по разработке и научному обоснованию предельно допустимых концентраций вредных веществ в воде водоемов. М., МЗ СССР, 1976, 51).

4.8. Курляндский Б.А. и соавт. Вероятностная оценка сравнительной чувствительности систем организма к отравлению винилхлоридом. Гигиена и санитария, 1978, 8, 51-55.

4.9. Курляндский Б.А. Концепция пороговости и реактивность организма. В кн.: Проблема пороговости в токсикологии. М., 1979, 11-18.

4.10. Любимов А.В., Айнбиндер Н.Е. Прогнозирование параметров опасности галогенпроизводных бензола по электронно-ядерной структуре соединений. Гигиена и санитария, 1986, 7, 19-23.

4.11. Методические указания к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию ПДК избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны. М., МЗ СССР, 1980.

4.12. Пинигин М.А., Значение вероятностного подхода при решении вопросов гигиенического регламентирования атмосферных загрязнений. В кн.: Медицинские проблемы охраны окружающей среды, М., 1981, 95-102.

4.13. Пинигин М.А., Авалиани С.Л., Печенникова Е.В. Критерии перевода градированных показателей в альтернативные при гигиеническом регламентировании химических загрязнений. В сб.: Состояние окружающей среды промузлов и оптимизации природоохранных мероприятий. Пермь, 1983, 47-50.

4.14. Пинигин М.А., Красовский Г.Н. Проблема пороговости при гигиенической оценке факторов окружающей среды. В кн.: Проблема пороговости в токсикологии. М., 1979, 7-10.

4.15. Принципы и методы токсикологической оценки химических веществ. Часть I. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Женева, ВОЗ, 1981, 312.

4.16. Руководство по гигиене атмосферного воздуха. Под редакцией К.А. Буштуевой. М., Медицина, 1976, 66-81.

4.17. Саноцкий И.В., Уланова И.П. Критерии вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений. М., Медицина, 1975, 382.

4.18. Сидоренко Г.И., Меркурьева Р.В. Современные биохимические методы в гигиене окружающей среды. М., 1982.

4.19. Токсикометрия химических веществ, загрязняющих окружающую среду. Программа ООН по окружающей среде, МРПТХВ, ЦМП ГКНТ, М., 1986.

4.20. Трахтенберг И.М. Проблемы нормы в современной профилактической токсикологии. Профилактическая токсикология (сб. учебно-методических материалов), т. I, М., 1984, с. 244-255.

4.21. Химические загрязнители воздушной среды и работоспособность человека. Киев, Здоровье, 1985, Е.Н. Панасюк и др.

4.22. Штабский Б.М., Каган Ю.С., Кацнельсон Б.А. Определение безвредных уровней воздействия химических веществ как диагностическая задача гигиены. Гигиена и санитария, 1983, II, 74-79.

4.23. Методические указания к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны. - М., - МЗ СССР. - 1980.

4.24. Западнюк и соавт. Лабораторные животные. - Киев. - Вища школа. - 1983. - С. 380.

Литература к разделу 5.

5.1. Бонашевская Т.И., Беляева Н.Н., Кумпан Н.Б., Панасюк Л.В., Морфофункциональные исследования в гигиене. - М., Медицина, 1984. - 159 с.

5.2. Меркурьева Р.В., Судаков К.В., Бонашевская Т.И., Журков В.С. Медико-биологические исследования в гигиене. М., Медицина, 1986. - 268 с.

5.3. Методические рекомендации к проведению морфологических исследований по гигиенической оценке токсичных веществ. Выбор объектов исследования. Условия взятия и обработки мтериалов. М., 1980. - 17 с.***

5.4. Методические рекомендации к проведению морфологических исследований при гигиенической оценке токсических веществ. Методы исследования. М., 1980. - 29 с.

5.5. Методические рекомендации к проведению морфологических исследований при гигиенической оценке токсичных веществ. Критерии оценки биосистем разного уровня интеграции. М., 1982. - 23 с.

5.6. Методические рекомендации "Система биохимических, цитологических, цитохимических и электронно-микроскопических критериев оценки функционального состояния альвеолярных макрофагов человека и экспериментальных животных при действии факторов окружающей среды. М., 1983. - 35 с.

5.7. Методические рекомендации к морфологическому изучению влияния химических факторов окружающей среды на дыхательную систему. М., 1984. - 40 с.

5.8. Методические рекомендации к морфобиохимическому изучению влияния химических факторов окружающей среды на фетоплацентарную систему. М., 1984. - 38 с.

5.9. Методические рекомендации к морфологическому изучению нейротоксического действия химических факторов окружающей среды. М., 1985. - 19 с.

5.10. Методические указания к оценке по системе биохимических, морфологических, иммунологических и физиологических показателей ранних изменений функциональных реакций организма человека при воздействии факторов окружающей среды (под редакцией академика Г.И. Сидоренко и профессора Р.В. Меркурьевой. Пермь-Москва, 1986. - 138 с.

5.11. Методические рекомендации для структурно-функциональной оценки процессов адаптации при воздействии химических факторов окружающей среды. М., 1987. - 24 с.

5.12. Методические рекомендации по использованию информативных методов и показателей для морфологической оценки действия на организм химических и биологических факторов окружающей среды. М., 1988. - 16 с.

______________________________

* Методы установления допустимых уровней воздействия. Доклад Комитета экспертов ВОЗ с участием МОТ (ВОЗ. Серия технических докладов, N 601, Женева, 1978.

** Англо-русский глоссарий избранных терминов по профилактической токсикологии, Центр Международных Проектов, 1982

*** Все методические рекомендации утверждены Проблемной комиссией союзного значения "Научные основы гигиены окружающей среды"

ГАРАНТ:

Здесь и далее по тексту нумерация приложений приводится в соответствии с источником