Методические рекомендации "Экспресс-метод оценки токсичности проб воздуха по водорастворимым компонентам с использованием в качестве тест-объекта спермы крупного рогатого скота" (утв. заместителем Главного государственного санитарного врача РФ 30 мая 2003 г. N 29ФЦ/2688-2003)

Методические рекомендации
"Экспресс-метод оценки токсичности проб воздуха по водорастворимым компонентам с использованием в качестве тест-объекта спермы крупного рогатого скота"
(утв. заместителем Главного государственного санитарного врача РФ 30 мая 2003 г. N 29ФЦ/2688-2003)

Дата введения: с момента утверждения

1. Область применения

Методические рекомендации предназначены для токсикологических испытаний проб воздуха, содержащего водорастворимые токсичные химические вещества. Методика может быть применена в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами для оценки токсичности проб воздуха различного происхождения. Присутствие в воздухе водонерастворимых токсичных веществ данной методикой не оценивается.

Методические рекомендации содержат описание экспресс-метода и определяют порядок проведения токсикологических испытаний проб воздуха с целью обеспечения безопасности человека.

Методические рекомендации предназначены для учреждений и организаций, занимающихся токсикологической оценкой потенциально опасной продукции, воздушной среды (атмосферного воздуха, воздуха жилых и служебных помещений, воздуха рабочей зоны) и осуществлением санитарного-эпидемиологического надзора.

2. Нормативные ссылки

2.1. Порядок разработки, экспертизы, утверждения, издания и распространения нормативных и методических документов системы санитарно-эпидемиологического нормирования. Р1.1.001-1.1.005-96.

2.2. Методические указания по осуществлению государственного санитарного надзора за устройством и содержанием жилых зданий. N 2295-81. Утверждено Минздравом СССР 24.02.81.

2.3. ГОСТ Р 8.568-97 Аттестация испытательного оборудования. Основные положения.

2.4. Биотестирование продукции из полимерных и других материалов. Методические указания МУ 1.1.037-95.

2.5. ГОСТ Р ИСО 10993.5-99 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro.

3. Термины и определения

3.1. Тест - объект - объект изучения, исследования каким-либо способом, методом. По состоянию тест-объекта можно судить о свойствах его среды обитания (естественной или искусственной).

3.2. Тест-функция - изучаемая деятельность или изучаемое свойство клетки или клеток, каким-либо способом, методом.

3.3. Контрольный образец (раствор) - среда, приготовленная в установленном порядке, токсичность которой принята за основу при контроле опытного образца. Контрольный образец служит для установления степени токсичности.

3.4. Опытный образец (раствор) - среда, приготовленная в установленном порядке и подлежащая контролю.

3.5. Рабочий образец - контрольный или опытный образец с внесенным в него тест-объектом.

3.6. Индекс токсичности - величина, отражающая степень токсичности опытного образца, представляющая собой отношение величины тест-функции или результата ее преобразования для опытного образца к величине тест-функции или результату ее преобразования для контрольного образца.

3.7. Испытательное оборудование - средство испытаний, представляющее собой техническое устройство для воспроизведения условий испытаний.

4. Принцип методики

Принцип методики состоит в переводе водорастворимых токсичных химических веществ, содержащихся в воздухе, в жидкую фазу и оценке ее токсичности на клеточном тест-объекте. В качестве тест-объекта выбрана кратковременная суспензионная культура подвижных клеток млекопитающих - сперма крупного рогатого скота. В качестве тест-функции взята зависимость количества подвижных клеток от времени. Индекс токсичности определен как:

,

- i-ое значение количества подвижных клеток,

i - текущий номер оценки количества подвижных клеток.

Сперма быка, замороженная в жидком азоте, производится в соответствии с ГОСТ 26030-83 на станциях искусственного осеменения. Хранится и транспортируется в сосудах Дьюара, наполненных жидким азотом. Срок хранения неограничен.

Анализатор токсичности типа AT (далее анализатор) представляет собой испытательное оборудование, изготовленное в соответствии с Приложением 1. Принцип работы анализатора основан на подсчете подвижных сперматозоидов с использованием объектива микроскопа, компьютера, программ распознавания подвижных клеток, управления и вычисления индекса токсичности. Устройство термостатирования обеспечивают нахождение растворов при постоянной температуре , а устройство перемещения кювет обеспечивает проведение испытаний в автоматическом режиме. Для приготовления растворов используется блок пробоподготовки, представляющий собой сухой термостат с набором гнезд для пробирок. Анализатор токсичности реализует методику контроля по контрольному образцу потребителя. В качестве кювет для помещения образцов используются капилляры, изготовленные в соответствии с Приложением 1. Аттестация анализатора проводится согласно ГОСТ Р 8.568-97.

Для настоящей методики экспериментально установлены следующие нормативные интервалы величины индекса токсичности: - образец нетоксичен, , - образец токсичен. При этом результаты оценки токсичности сложных растворов неустановленного состава настоящей методикой и эталонными методиками на целостном организме млекопитающих (мыши, крысы) совпадают с коэффициентом корреляции .

5. Испытательное оборудование

5.1. Камера-генератор,

5.2. Поглотительный сосуд Рихтера,

5.3. Весы аналитические с погрешностью взвешивания не более 1 мг,

5.4. Сосуд Дьюара типа СДС, объемом не менее 25 л и диаметром горловины не менее 50 мм - 2 шт.,

5.5. Анализатор токсичности типа AT (приложение 1, рекомендуемое).

5.6. Комплект кювет (приложение 1, рекомендуемое).

5.7. Химическое оборудование:

- пробирки с притертыми пробками объемом 1-2 мл - 10 шт.,

- дозаторы пипеточные на объемы 1 мл, 0,2 мл и 0,1 мл,

- мерные колбы с притертыми пробками объемом 50 мл - 2 шт.,

- колбы с притертыми пробками объемом 500 мл - 2 шт.

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

5.7. Пинцет анатомический длиной 250 мм.

6. Реактивы и тест-объект

6.1. Вода дистиллированная ГОСТ 12.4.021.

6.2. Глюкоза ч., ГОСТ 6038-74.

6.3. Цитрат натрия трехзамещенный ч., ГОСТ 22280-76.

6.4. Сперма быка, замороженная в жидком азоте, ГОСТ 26030-83.

7. Отбор проб и приготовление образцов

7.1 Для проведения испытаний производится отбор проб воздуха и получение испытуемого раствора. Испытуемым раствором является вода с поглощенными и растворенными в ней летучими химическими веществами, выделяющимися из исследуемых материалов, или содержащимися в воздушной среде.

7.2. Отбор проб воздуха для испытаний по данной методике следует производить до отбора проб воздуха с использованием поглотительных растворов, отличных от воды.

7.3. Опытный раствор получают в результате отбора пробы воздуха из камеры-генератора с образцами исследуемого материала или из экспериментального помещения, а также из окружающей воздушной среды. Пробу воздуха объемом 30 л отбирают со скоростью 0,6 л/мин последовательно в два поглотительных прибора с пористой пластинкой N 1, заполненных 5 мл дистиллированной воды каждый. После отбора поглотительные растворы сливаются. Для дальнейшего анализа отбирается 8 мл раствора. В камерах-генераторах моделируются условия, требуемые для проведения санитарно-химических испытаний в соответствии с действующими СанПиН, MP, МУ и другой нормативной документацией.

8. Проведение испытаний

8.1. Для определения индекса токсичности сравнивают опытный и контрольный растворы. В качестве контрольного раствора выбрана глюкозо-цитратная среда (глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, дистиллированная вода - 100 мл). Контрольная среда одновременно является разбавителем для оттаивания замороженной спермы. Опытным раствором является испытуемая среда, приготовленная в соответствии с п. 7, доведённая до изотонии сухими реактивами глюкозы и цитрата натрия (глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, испытуемый раствор - 100 мл). Контрольный и опытный растворы по 0,4 мл помещают в пробирки с притертыми пробками и ставят в устройство термостатирования.

8.2. Оттаивают замороженную сперму. Для этого дозируют в пробирку разбавитель согласно паспорту на сперму быка и помещают ее в устройство термостатирования. Охлажденным до температуры жидкого азота анатомическим пинцетом извлекают из сосуда Дьюара гранулу спермы и опускают ее в пробирку с нагретым разбавителем. Через каждые 1-2 минуты содержимое пробирки перемешивают легким встряхиванием. Через 5-6 минут в пробирке образуется маточная суспензия сперматозоидов.

8.3. Приготавливают рабочие контрольный и опытный образцы. В пробирки с контрольным и опытным растворами помещают по 0,1 мл маточной суспензии сперматозоидов.

8.4. Рабочие образцы переносят в кюветы. Для уменьшения случайной ошибки для каждого рабочего образца используют выборку из 3-5 кювет. Кюветы устанавливают в кюветодержатель, который помещают в анализатор токсичности. Нажатием кнопки "СТАРТ" запускают процесс регистрации зависимости количества подвижных клеток от времени для рабочих контрольного и опытного образцов. Процессы, происходящие в кюветах могут контролироваться визуально на мониторе.

8.5. При для всех кювет процесс регистрации зависимости количества подвижных клеток от времени останавливают нажатием кнопки "СТОП".

Анализатор осуществляет усреднение по выборкам рабочих контрольных и опытных образцов, вычисляет индекс токсичности и коэффициенты вариации для выборок рабочих контрольных и опытных образцов. Если для каждой из выборок, то переходят к оценке результатов испытаний. При с > 0,25 хотя бы для одной из выборок испытания повторяют, начиная с п. 8.1.

9. Оценка результатов испытаний

Если индекс токсичности не укладывается в интервал 80-120% (, ), то это свидетельствует о наличии в исследуемом воздухе водорастворимых веществ в токсичных концентрациях. Исследуемый образец или проба воздуха считается токсичным. Если индекс токсичности попадает в интервал 80-120% это свидетельствует об отсутствии в исследуемом воздухе водорастворимых веществ в токсичных концентрациях.

Заместитель главного государственного санитарного врача Российской Федерации

Е.Б. Беляев