Методические указания МУК 4.1.3422-17 "Измерение массовой концентрации (R*,R*)-(+-)-N-[2-гидрокси-5-[1-гидрокси-2-[[2-(4-метоксифенил)-1-метилэт ил]амино]этил]фенил]формамида фумарата (2:1) дигидрата (формотерола фумарат дигидрат) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 февраля 2017 г.)

4.1. Методы контроля. Химические факторы

Методические указания МУК 4.1.3422-17
"Измерение массовой концентрации (R*,R*)--N-[2-гидрокси-5-[1-гидрокси-2-[[2-(4-метоксифенил)-1-метилэтил]амино]этил]фенил]формамида фумарата (2:1) дигидрата (формотерола фумарат дигидрат) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 февраля 2017 г.)

Свидетельство о государственной метрологической аттестации N 205-29/RA.RU. 311787-2016/2016.

1. Назначение и область применения

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовой концентрации формотерола фумарата дигидрата в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,001-0,008 .

Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Характеристика вещества

2.1. Физико-химические свойства

Формотерола фумарат дигидрат

Молекулярная масса: 876,90.

Регистрационный номер CAS: 43229-80-7.

Формотерола фумарат дигидрат - белый или желтоватый кристаллический порошок с температурой плавления 136-142°С. Легко растворим в ледяной уксусной кислоте, растворим в метаноле, малорастворим в этаноле и изопропаноле, малорастворим в воде, практически нерастворим в ацетоне, этилацетате и диэтиловом эфире.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.2. Токсикологическая характеристика

Формотерола фумарат дигидрат - высокоактивное адреномиметическое, бронходилатирующее средство, селективный агонист адренергических длительного действия, применяется ингаляционно в суточных дозах 0,0045-0,054 мг. Умеренно опасен при поступлении внутрь, обладает общетоксическим и неспецифическим антигистаминным действием. Основные побочные эффекты при передозировке: тремор, головная боль, бессонница, тошнота, рвота, тахикардия, гипокалиемия, гипергликемия.

Для формотерола фумарата дигидрата ПДК в воздухе рабочей зоны не устанавливается, в перечень ПДК формотерола фумарата дигидрат вносится с пометкой "++", 1-й класс опасности.

Контроль формотерола фумарата дигидрата в воздухе рабочей зоны следует проводить на уровне чувствительности метода не менее 0,001 .

3. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой при выполнении измерений массовой концентрации формотерола фумарата дигидрата метрологические характеристики не превышают значений, представленных в табл. 1 (при доверительной вероятности Р = 0,95).

Таблица 1

Метрологические характеристики

Диапазон измерений массовой концентрации формотерола фумарата дигидрата,	Показатель точности (границы относительной погрешности), , % при P = 0,95	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), , %	Предел повторяемости, r, %, P = 0,95, n = 2	Критическая разность для результатов анализа, полученных в двух лабораториях, , %
От 0,0010 до 0,006 вкл.	25	8	10	22	23
Св. 0,006 до 0,008 вкл.	23	5	8	14	20

4. Метод измерений

Измерение массовой концентрации формотерола фумарата дигидрата выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым спектрофотометрическим (УФ) детектированием. Метод основан на разделении формотерола фумарата дигидрата и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом, с последующей регистрацией формотерола фумарата дигидрата с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации формотерола фумарата дигидрата.

Измерение проводят при длине волны 214 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на аналитические аэрозольные фильтры.

Минимально определяемое количество формотерола фумарата дигидрата в хроматографируемом объеме раствора пробы - 0,01 мкг.

Нижний предел измерения массовой концентрации формотерола фумарата дигидрата в воздухе 0,001 (при отборе 2 000 воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления лекарственных форм на основе формотерола фумарата дигидрата. Измерению не мешает вспомогательное вещество - лактоза моногидрат.

5. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

5.1. Средства измерений

Хроматограф жидкостный с ультрафиолетовым (УФ) детектором
Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, предел допустимой погрешности взвешивания мг	ГОСТ OIML R 76-1-11
Аспирационное устройство трехканальное с диапазоном расхода 80-400 и пределом допустимой погрешности	ТУ 4215-000-11696625-03
Иономер лабораторный типа рН-121 с пределом рН от -1 до +19 ед.	ГОСТ 22261-76
Колбы мерные, 2-50-2, 2-100-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770-74
Пипетки 1-1-2-1, 1-1-2-5, 1-1-2-10	ГОСТ 29227-91
Пробирки мерные с пришлифованными пробками, П-2-10-14/23 ХС	ГОСТ 1770-74
Цилиндры мерные, 3-100, 3-500, 1-1000	ГОСТ 1770-74
Микрошприц М-50 вместимостью 50	ГОСТ 8043-74

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.2. Реактивы

Формотерола фумарат дигидрат с содержанием основного вещества не менее 99,0% в пересчете на сухое вещество, НД 42-10097-06. Сертификат анализа N 41217D15
Спирт метиловый	ГОСТ Р 51723-01
Ацетонитрил, осч	ТУ 6-09-14-2167-84
Калий фосфорнокислый однозамещенный, хч	ГОСТ 4198-75
О-фосфорная кислота, хч, 85%-й раствор, плотность	ГОСТ 6552-80
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72
Вода осч	ТУ 6-09-2502-77

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

5.3. Вспомогательные устройства и материалы

Колонка аналитическая, размером 100 мм х 4,6 мм, заполненная сорбентом C18 с размером частиц 3,5 мкм
Аналитические аэрозольные фильтры гидрофобные на основе перхлорвинила с площадью рабочей поверхности 20 (фильтры)	ТУ 95-1892-89
Фильтродержатели	ТУ 95.72.05-77
Мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм	ТУ 9471-002-10471723-03
Бюксы стеклянные, СВ 24/10	ГОСТ 25336-82
Палочки стеклянные	ГОСТ 25336-82
Воронки химические	ГОСТ 25336-82
Дистиллятор	ГОСТ Р 50444-92
Шкаф сушильный	ТУ 61-1-721-79
Ультразвуковая ванна УВМ-5	ТУ 25-7401

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88 о изменением N 1.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91. Должны быть в наличии средства, пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004-90.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-09 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК и ОБУВ, установленные ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, имеющий высшее образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедший обучение и владеющий техникой анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, освоивший метод анализа в процессе тренировки и уложившийся в нормативы оперативного контроля при проведении процедур контроля погрешности анализа.

8. Требования к условиям измерений

8.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха	;
- атмосферное давление	(84-106) кПа;
- относительная влажность воздуха, не более	80%.

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб воздуха.

9.1. Приготовление растворов

9.1.1. Основной раствор формотерола фумарата дигидрата с массовой концентрацией 500 готовят растворением г формотерола фумарата дигидрата в смеси спирта метилового и воды особо чистой в соотношении 1:1 (по объему) в мерной колбе вместимостью 100 .

Раствор устойчив в течение двух недель при хранении в хорошо укупоренной таре, в холодильнике, в защищенном от света месте.

9.1.2. Рабочий раствор формотерола фумарата дигидрата N 1 с массовой концентрацией 50,0 готовят разбавлением 5,0 основного раствора формотерола фумарата смесью спирта метилового и воды особо чистой в соотношении 1:1 (по объему) в мерной колбе вместимостью 50 .

Раствор устойчив в течение недели при хранении в хорошо укупоренной таре, в холодильнике, в защищенном от света месте.

9.1.3. Рабочий раствор формотерола фумарата дигидрата N 2 с массовой концентрацией 10,0 готовят разбавлением 10,0 рабочего раствора формотерола фумарата дигидрата N 1 смесью спирта метилового и воды особо чистой в соотношении 1:1 (по объему) в мерной колбе вместимостью 50 .

Раствор устойчив в течение суток при хранении в хорошо укупоренной таре, в холодильнике, в защищенном от света месте.

9.1.4. Приготовление смеси для растворения: смесь спирта метилового и воды особо чистой в соотношении 1:1 (по объему). В мерной колбе вместимостью 1 000 смешивают 500 спирта метилового и 500 воды особо чистой в соотношении 1:1 (по объему).

Раствор устойчив в течение месяца при хранении в холодильнике.

9.1.5. Приготовление буферного раствора с рН 3,0. В мерной колбе вместимостью 1 000 растворяют 6,81 г калия фосфорнокислого однозамещенного в воде особо чистой, доводят объем водой особо чистой до метки и перемешивают. Устанавливают рН раствора равным путем прибавления концентрированной о-фосфорной кислоты с потенциометрическим контролем.

Раствор устойчив в течение месяца при хранении в холодильнике.

9.1.6. Приготовление подвижной фазы (элюента). В мерной колбе вместимостью 1 000 смешивают 800 буферного раствора с рН 3,0 и 200 ацетонитрила. Перед использованием подвижную фазу фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и дегазируют, используя ультразвуковую ванну в течение 15 минут.

Раствор устойчив при хранении в хорошо укупоренной таре в защищенном от света месте в течение 7 суток.

9.2. Подготовка хроматографа

Подготовку хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

9.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания формотерола фумарата дигидрата в хроматографируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной градуировки по шести сериям измерений по шести концентрациям вещества в каждой серии согласно табл. 2.

Таблица 2

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении формотерола фумарата дигидрата

Номер градуировочного раствора	Объем рабочего раствора N 1 с концентрацией формотерола фумарата дигидрата 50 ,	Объем рабочего раствора N 2 с концентрацией формотерола фумарата дигидрата 10 ,	Содержание формотерола фумарата дигидрата на фильтре, мкг	Массовая концентрация формотерола фумарата дигидрата в градуировочном растворе,	Содержание формотерола фумарата дигидрата в хроматографируемом объеме градуировочного раствора, мкг
1	0,00	0,00	0,0	0,0	0,000
2	0,00	0,10	1,0	0,10	0,010
3	0,00	0,15	1,5	0,15	0,015
4	0,00	0,20	2,0	0,20	0,020
5	0,00	0,30	3,0	0,30	0,030
6	0,10	0,00	5,0	0,50	0,050
7	0,16	0,00	8,0	0,80	0,080

Градуировочные растворы используют свежеприготовленные. Растворы устойчивы в течение суток при хранении в холодильнике, в защищенном от света месте.

На фильтры, помещенные в бюксы, наносят пипеткой вместимостью 1 объемы рабочего раствора формотерола фумарата дигидрата N 1 с массовой концентрацией 50,0 и рабочего раствора формотерола фумарата дигидрата N 2 с массовой концентрацией 10,0 в соответствии с табл. 2. Фильтры подсушивают при комнатной температуре и с помощью пипетки вместимостью 5,0 приливают по 5,0 смеси спирта метилового и воды особо чистой в соотношении 1:1 (по объему) и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтры тщательно отжимают, растворы сливают в мерные пробирки вместимостью 10 . Фильтры повторно обрабатывают 5,0 смеси спирта метилового и воды особо чистой в соотношении 1:1 (по объему) и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтры тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в те же пробирки и доводят объем до, 10,0 смесью спирта метилового и воды особо чистой в соотношении 1:1 (по объему). Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы.

Инжектируют в хроматограф по 0,05 каждого из градуировочных растворов.

По полученным данным методом абсолютной градуировки строят градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (приборные единицы) от содержания формотерола фумарата дигидрата в хроматографируемом объеме градуировочных растворов (мкг).

9.4. Условия хроматографирования градуировочных растворов и растворов анализируемых проб

Длина волны детектора	214 нм
Объем вводимой пробы	0,1
Температура колонки	40°С
Расход подвижной фазы	1,0
Время удерживания формотерола фумарата дигидрата не менее мин

9.5. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества по п. 9.3 (в начале, середине и в конце измерений) и анализируют в точном соответствии с прописью методики.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

, где (1)

, - значение площади пика (приборные единицы) формотерола фумарата дигидрата в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно;

- норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное измерение этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировочной характеристики, предусмотренной методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики прибор градуируют заново.

9.6. Отбор проб воздуха

Отбор проб проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением N 1 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и Р 2.2.2006-05 (прилож. 9) "Общие методические требования к организации и проведению контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны", раздел 2 "Контроль соответствия максимальным ПДК".

Одновременно отбирают две параллельные пробы.

Воздух аспирируют в течение 15 минут через фильтр, помещенный в фильтродержатель, снабженный металлической сеткой. Для определения массовой концентрации формотерола фумарата дигидрата на уровне 0,001 отбирают не менее 2 000 воздуха.

Отобранные пробы можно хранить в бюксах в течение суток в холодильнике, в защищенном от света месте.

10. Выполнение измерений

Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, с помощью пипетки вместимостью 5 приливают 5 смеси спирта метилового и воды особо чистой в соотношении 1:1 (по объему), периодически помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 15 минут для лучшего растворения вещества. Затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в мерную пробирку вместимостью 10 . Фильтр повторно обрабатывают 5 смеси спирта метилового и воды особо чистой в соотношении 1:1 (по объему), оставляют на 15 минут, периодически помешивая при этом стеклянной палочкой, затем тщательно отжимают и фильтр удаляют. Раствор сливают в ту же пробирку, объем раствора доводят до метки смесью спирта метилового и воды особо чистой в соотношении 1:1 (по объему). Полученный раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографическую виалу.

Инжектируют в хроматограф по 0,05 раствора анализируемой пробы.

Хроматографический анализ растворов анализируемой пробы выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждого раствора анализируемой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Количественное определение содержания формотерола фумарата дигидрата (в мкг) в хроматографируемом объеме раствора анализируемой пробы проводят по предварительно построенной градуировочной характеристике.

Примечание. Фильтрование растворов анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в смеси спирта метилового и воды особо чистой в соотношении 1:1 (по объему) вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственных форм формотерола фумарата дигидрата.

11. Вычисление результатов измерений

Массовую концентрацию формотерола фумарата дигидрата в воздухе рабочей зоны , С, , вычисляют по формуле:

, где (2)

а - содержание вещества в хроматографируемом объеме раствора анализируемой пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

В - общий объем раствора анализируемой пробы, ;

б - хроматографируемый объем раствора анализируемой пробы, ;

- объем воздуха, отобранный для анализа и приведенный к стандартным условиям (прилож. 1).

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

, где (3)

, - результаты параллельных определений массовой концентрации формотерола фумарата дигидрата в воздухе рабочей зоны, ;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики.

12. Оформление результатов анализа

Результат количественного химического анализа представляют в виде:

, при Р = 0,95, где

- среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, ;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация формотерола фумарата дигидрата менее 0,001 (более 0,008 )".

13. Контроль результатов измерений

13.1. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью по формуле:

, где (4)

, - средние значения массовой концентрации формотерола фумарата дигидрата, полученные в первой и второй лабораториях, ;

- значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.4).

13.2. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-02, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова