Методические указания МУК 4.1.3426-17 "Измерение массовой концентрации (1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил]амино}-5-(про пилтио)-3Н-1,2,3-триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил]-5-(2-гидроксиэтокси) циклопетан-1,2-диола (тикагрелор) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 февраля 2017 г.)

Методические указания МУК 4.1.3426-17
"Измерение массовой концентрации (1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил]амино}-5-(пропилтио)-3Н-1,2,3-триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил]-5-(2-гидроксиэтокси) циклопетан-1,2-диола (тикагрелор) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 февраля 2017 г.)

Свидетельство о государственной метрологической аттестации N 01.00225/205-7-16.

1. Назначение и область применения

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерений массовой концентрации тикагрелора в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,2-2,0 .

Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Характеристика вещества

2.1. Физико-химические свойства

Тикагрелор

Молекулярная масса 522,57.

Регистрационный номер CAS: 274693-27-5.

Тикагрелор - порошок белого или бледно-красно-желтого цвета с температурой плавления 138-140°С, практически не растворим в воде, растворим в ацетонитриле.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.2. Токсикологическая характеристика

Тикагрелор - антиагрегантный (антитромботический) препарат, представитель химического класса циклопентилтриазолопиримидинов, обратимо предотвращает АДФ-опосредованную активацию и агрегацию тромбоцитов. Умеренно опасное вещество при поступлении внутрь, обладает функциональной кумулятивной активностью, оказывает влияние на систему гемостаза, функцию печени и почек.

Ориентировочный безопасный уровень воздействия (ОБУВ) тикагрелора в воздухе рабочей зоны 0,4 .

3. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой при выполнении измерений массовой концентрации тикагрелора метрологические характеристики не превышают значений, представленных в табл. 1 (при доверительной вероятности Р = 0,95).

Таблица 1

Метрологические характеристики

Диапазон измерений массовой концентрации тикагрелора,	Показатель точности (границы относительной погрешности), , % при Р = 0,95	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), , %	Предел повторяемости, r, %, Р = 0,95, n = 2	Критическая разность для результатов анализа, полученных в двух лабораториях, , %
От 0,20 до 1,0 вкл.	25	4	6	11	15
Св. 1,0 до 2,0 вкл.	20	2	3	6	7

4. Метод измерений

Измерение массовой концентрации тикагрелора выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым спектрофотометрическим (УФ) детектированием. Метод основан на разделении тикагрелора и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом, с последующей регистрацией тикагрелора с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации тикагрелора.

Измерение проводят при длине волны 242 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на аналитические аэрозольные фильтры.

Минимально определяемое количество тикагрелора в хроматографируемом объеме раствора пробы - 0,05 мкг.

Нижний предел измерения массовой концентрации тикагрелора в воздухе 0,2 (при отборе 250 воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления препаративных форм на основе тикагрелора. Измерению не мешают вспомогательные вещества: маннитол, кальция гидрофосфат, карбоксиметилкрахмал натрия, гипролоза, гипромеллоза, магния стеарат.

5. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

5.1. Средства измерений

Хроматограф жидкостный с ультрафиолетовым (УФ) детектором
Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, предел допустимой погрешности взвешивания мг	ГОСТ OIML R 76-1-11
Аспирационное устройство двухканальное с диапазоном расхода 2,0-20 и пределом допустимой погрешности	ТУ 4215-000-11696625-03
Иономер лабораторный типа рН-121 с пределом рН от -1 до +19 ед.	ГОСТ 22261-76
Колбы мерные, 2-50-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770-74
Пипетки 1-1-2-1, 1-1-2-5, 1-1-2-10	ГОСТ 29227-91
Пробирки мерные с пришлифованными пробками, П-2-10-14/23 ХС	ГОСТ 1770-74
Цилиндры мерные, 1-500, 1-1000	ГОСТ 1770-74
Микрошприц МШ-10 вместимостью 10	ГОСТ 8043-74

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.2. Реактивы

Тикагрелор с содержанием основного вещества не менее 95,0% в пересчете на сухое вещество, НД ПN016075/01-240811
Ацетонитрил, осч	ТУ 6-09-14-2167-84
Натрия дигидрофосфат дигидрат, , чда	ГОСТ 245-76
О-фосфорная кислота, хч, 85%-й раствор, плотность р = 1,698	ГОСТ 6552-80
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72
Вода осч	ТУ 6-09-2502-77

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

5.3. Вспомогательные устройства и материалы

Колонка аналитическая, размером 150 мм х 4,6 мм, заполненная сорбентом С18 с размером частиц 5 мкм
Аналитические аэрозольные фильтры гидрофильные на основе перхлорвинила с площадью рабочей поверхности 10 (фильтры)	ТУ 95-1892-89
Фильтродержатели	ТУ 95.72.05-77
Мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм	ТУ 9471-002-10471723-03
Фольга алюминиевая	ТУ 1811-005-53974397-04
Бюксы стеклянные, СВ 24/10	ГОСТ 25336-82
Палочки стеклянные	ГОСТ 25336-82
Воронки химические	ГОСТ 25336-82
Дистиллятор	ГОСТ Р 50444-92
Шкаф сушильный	ТУ 61-1-721-79

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88 с изменением N 1.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004-90.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-09 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК и ОБУВ, установленные ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, имеющий высшее образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедший обучение и владеющий техникой анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, освоивший метод анализа в процессе тренировки и уложившийся в нормативы оперативного контроля при проведении процедур контроля погрешности анализа.

8. Требования к условиям измерений

8.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха	;
- атмосферное давление	(84-106) кПа;
- относительная влажность воздуха, не более	80%.

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб воздуха.

9.1. Приготовление растворов

9.1.1. Основной раствор тикагрелора с массовой концентрацией 1 000 готовят растворением г такагрелола в смеси ацетонитрила и воды особо чистой в соотношении 35:65 (по объему) в мерной колбе вместимостью 50 , обернутой алюминиевой фольгой.

Раствор устойчив трое суток при хранении в холодильнике.

9.1.2. Рабочий раствор тикагрелора с массовой концентрацией 100 готовят разбавлением 5,0 основного раствора тикагрелора смесью ацетонитрила и воды особо чистой в соотношении 35:65 (по объему) в мерной колбе вместимостью 50 , обернутой алюминиевой фольгой.

Раствор устойчив трое суток при хранении в холодильнике.

9.1.3. Приготовление 1,0 М буферного раствора натрия дигидрофосфата дигидрата с рН 3. В мерной колбе вместимостью 1 000 растворяют 156,0 г натрия дигидрофосфата дигидрата в воде особо чистой, доводят объем водой особо чистой до метки и перемешивают. Устанавливают рН раствора равным путем прибавления концентрированной о-фосфорной кислоты с потенциометрическим контролем.

Раствор устойчив в течение двух недель при хранении в холодильнике.

9.1.4. Приготовление смеси ацетонитрила и воды особо чистой в соотношении 35:65 (по объему). В мерную колбу вместимостью 1 000 наливают 350 ацетонитрила, доводят до метки водой особо чистой и перемешивают.

Раствор устойчив в течение двух недель при хранении в холодильнике.

9.1.5. Приготовление подвижной фазы: смесь 1,0 М буферного раствора натрия дигидрофосфата дигидрата с рН 3, воды особо чистой и ацетонитрила в соотношении 1:47:52 (по объему).

В мерной колбе вместимостью 1 000 смешивают 10 1,0 М буферного раствора натрия дигидрофосфата дигидрата с рН 3 и 470 воды особо чистой, добавляют 520 ацетонитрила и перемешивают. Перед использованием подвижную фазу фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и дегазируют.

Хранят в хорошо укупоренной таре в защищенном от света месте в течение недели.

9.2. Подготовка хроматографа

Подготовку хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

9.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания тикагрелора в хроматографируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной градуировки по шести сериям измерений по шести концентрациям вещества в каждой серии согласно табл. 2.

Таблица 2

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении тикагрелора

Номер градуировочного раствора	Объем основного раствора с концентрацией тикагрелора 1 000 ,	Объем рабочего раствора с концентрацией тикагрелора 100 ,	Содержание тикагрелора на фильтре, мкг	Массовая концентрация тикагрелора в градуировочном растворе,	Содержание тикагрелора в хроматографируемом объеме градуировочного раствора, мкг
1	0,0	0,0	0,0	0,0	0,00
2	0,0	0,5	50,0	5,0	0,05
3	0,1	0,0	100,0	10,0	0,10
4	0,2	0,0	200,0	20,0	0,20
5	0,3	0,0	300,0	30,0	0,30
6	0,4	0,0	400,0	40,0	0,40
7	0,5	0,0	500,0	50,0	0,50

Градуировочные растворы используют свежеприготовленные. Растворы устойчивы в течение одного часа.

На фильтры, помещенные в бюксы, обернутые алюминиевой фольгой, пипеткой вместимостью 1 наносят основной раствор тикагрелора с массовой концентрацией 1 000 и рабочий раствор тикагрелора с массовой концентрацией 100 в соответствии с табл. 2. Фильтры подсушивают при комнатной температуре, затем, используя пипетку вместимостью 5,0 , приливают по 5,0 смеси ацетонитрила и воды особо чистой в соотношении 35:65 (по объему) и оставляют на 10 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтры отжимают, растворы сливают в мерные пробирки, обернутой алюминиевой фольгой, вместимостью 10 . Фильтры повторно обрабатывают 5,0 смеси ацетонитрила и воды особо чистой в соотношении 35:65 (по объему) и оставляют на 10 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтры тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в те же мерные пробирки, объем доводят до 10,0 смесью ацетонитрила и воды особо чистой в соотношении 35:65 (по объему). Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы, покрытые алюминиевой фольгой.

Инжектируют в хроматограф по 0,01 каждого из градуировочных растворов.

По полученным данным строят градуировочную характеристику зависимости площади пика (приборные единицы) от содержания тикагрелора в хроматографируемом объеме градуировочных растворов (мкг).

9.4. Условия хроматографирования градуировочных растворов и растворов анализируемых проб

Длина волны детектора	242 нм
Объем вводимой пробы	0,01
Температура колонки	55°С
Расход подвижной фазы	1,2
Время удерживания тикагрелора	мин

9.5. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества по п. 9.3 (в начале, середине и в конце измерений) и анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

, где (1)

, - значение площади пика (приборные единицы) тикагрелора в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно;

- норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное измерение этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика не стабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировочной характеристики, предусмотренной методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики прибор градуируют заново.

9.6. Отбор проб воздуха

Отбор проб проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением N 1 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и Р 2.2.2006-05 (прилож. 9) "Общие методические требования к организации и проведению контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны", раздел 2 "Контроль соответствия максимальным ПДК".

Одновременно отбирают две параллельные пробы.

Воздух с объемным расходом 20 аспирируют в течение 12,5 мин через фильтр, помещенный в фильтродержатель, снабженный металлической сеткой. Для определения массовой концентрации тикагрелора на уровне 0,2 (1/2 ОБУВ) отбирают не менее 250 воздуха.

Отобранные пробы можно хранить в бюксах в течение суток в холодильнике.

10. Выполнение измерений

Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, обернутый алюминиевой фольгой, и с помощью пипетки вместимостью 5 приливают 5,0 смеси ацетонитрила и воды особо чистой в соотношении 35:65 (по объему), помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 10 минут для лучшего растворения вещества. Затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в мерную пробирку вместимостью 10 , обернутую алюминиевой фольгой. Фильтр повторно обрабатывают 5,0 смеси ацетонитрила и воды особо чистой в соотношении 35:65 (по объему), помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 10 минут, снова тщательно отжимают и удаляют. Раствор сливают в ту же мерную пробирку, объем раствора доводят до метки смесью ацетонитрила и воды особо чистой в соотношении 35:65 (по объему). Далее раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографическую виалу, покрытую алюминиевой фольгой.

Инжектируют в хроматограф по 0,01 раствора анализируемой пробы.

Хроматографический анализ растворов анализируемой пробы выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждого раствора анализируемой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Количественное определение содержания тикагрелора (в мкг) в хроматографируемом объеме раствора анализируемой пробы проводят по предварительно построенной градуировочной характеристике.

Примечание. Фильтрование растворов анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в смеси ацетонитрила и воды особо чистой в соотношении 35:65 (по объему) вспомогательных веществ, входящих в состав препаративных форм тикагрелора.

11. Вычисление результатов измерений

Массовую концентрацию тикагрелора в воздухе рабочей зоны С, , вычисляют по формуле:

, где (2)

а - содержание вещества в хроматографируемом объеме раствора анализируемой пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

В - общий объем раствора анализируемой пробы, ;

б - хроматографируемый объем раствора анализируемой пробы, ;

- объем воздуха, отобранный для анализа и приведенный к стандартным условиям (прилож. 1).

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

, где (3)

, - результаты параллельных определений массовой концентрации тикагрелора в воздухе, ;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики измерений.

12. Оформление результатов анализа

Результат количественного химического анализа представляют в виде:

, при Р = 0,95, где

- среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, ;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация тикагрелора менее 0,2 (более 2,0 )".

13. Контроль результатов измерений

13.1. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью по формуле:

, где (4)

, - средние значения массовой концентрации тикагрелора, полученные в первой и второй лабораториях, ;

- значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.4).

13.2. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-02, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова