Методические указания МУК 4.1.3431-17 "Измерение массовой концентрации а,а,а',а'-тетраметил-5-(1Н-1,2,4-триазол-1-илметил)-1,3-бензолдиацетонитр ила (анастрозол) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 февраля 2017 г.)

4.1. Методы контроля. Химические факторы

Методические указания МУК 4.1.3431-17
"Измерение массовой концентрации -тетраметил-5-(1Н-1,2,4-триазол-1-илметил)-1,3-бензолдиацетонитрила (анастрозол) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 февраля 2017 г.)

Свидетельство о государственной метрологической аттестации N 01.00225/205-4-16.

1. Назначение и область применения

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерений массовой концентрации анастрозола в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,001-0,01 .

Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Характеристика вещества

2.1. Физико-химические свойства

Анастрозол

Молекулярная масса: 293,4.

Регистрационный номер CAS: 120511-73-1.

Анастрозол - кристаллический порошок белого или кремового цвета с температурой плавления 83-86°С. Хорошо растворим в метаноле, этаноле, ацетоне, тетрагидрофуране. Растворимость в воде - 0,5 при 25°С.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.2. Токсикологическая характеристика

Анастрозол - селективный нестероидный ингибитор ароматазы. Обладает противоопухолевой активностью в отношении эстрогензависимых опухолей молочной железы у женщин в периоде постменопаузы. Блокада активности ароматазы, приводит к максимальному снижению уровня эстрогенов как в периферическом кровотоке, так и в тканях опухоли.

Анастрозол обладает высокой фармако-терапевтической активностью - терапевтическая доза - 1 мг, относится к высокоопасным веществам при поступлении внутрь, оказывает выраженное влияние на репродуктивную систему, показана потенциальная канцерогенная активность вещества.

Для анастрозола ПДК в воздухе рабочей зоны не устанавливается, в перечень ПДК анастрозол вносится с пометкой "++", 1-й класс опасности (требуется защита кожи и глаз). Контроль анастрозола в воздухе рабочей зоны следует проводить на уровне чувствительности метода не менее 0,001 .

3. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой при выполнении измерений массовой концентрации анастрозола метрологические характеристики не превышают значений, представленных в табл. 1 (при доверительной вероятности Р = 0,95).

Таблица 1

Метрологические характеристики

Диапазон измерений массовой концентрации анастрозола,	Показатель точности (границы относительной погрешности), , % при Р = 0,95	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), , %	Предел повторяемости, r, %, Р = 0,95, n = 2	Критическая разность для результатов анализа, полученных в двух лабораториях, , %
От 0,0010 до 0,005 вкл.	25	5	8	14	20
Св. 0,005 до 0,010 вкл.	22	3	5	8	13

4. Метод измерений

Измерение массовой концентрации анастрозола выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым спектрофотометрическим (УФ) детектированием. Метод основан на разделении анастрозола и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом, с последующей регистрацией анастрозола с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации анастрозола.

Измерение проводят при длине волны 215 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на аналитические аэрозольные фильтры.

Минимально определяемое количество анастрозола в хроматографируемом объеме раствора пробы - 0,01 мкг.

Нижний предел измерения массовой концентрации анастрозола в воздухе 0,001 (при отборе 1 000 воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления препаративных форм на основе анастрозола. Измерению не мешают вспомогательные вещества: лактозы моногидрат, повидон, карбоксиметилкрахмал натрия, магния стеарат.

5. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

5.1. Средства измерений

Хроматограф жидкостный с ультрафиолетовым (УФ) детектором
Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, предел допустимой погрешности взвешивания мг	ГОСТ OIML R 76-1-11
Аспирационное устройство трехканальное с диапазоном расхода 40,0-200 и пределом допустимой погрешности	ТУ 4215-000-11696625-03
Колбы мерные, 2-50-2, 2-100-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770-74
Пипетки 1-1-2-1, 1-1-2-5, 1-1-2-10	ГОСТ 29227-91
Пробирки мерные с пришлифованными пробками, П-2-10-14/23 ХС	ГОСТ 1770-74
Цилиндры мерные, 3-100, 3-250	ГОСТ 1770-74
Микрошприц М-100 вместимостью 100	ГОСТ 8043-74

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.2 Реактивы

Анастрозол с содержанием основного вещества не менее 95,0% в пересчете на сухое вещество, НД П N013285/01-030611
Спирт этиловый 96%-й	ГОСТ Р 51723-01
Спирт метиловый, хч	ГОСТ 6995-77
Ацетонитрил, осч	ТУ 6-09-14-2167-84
Трифторуксусная кислота, хч	ГОСТ 6552-80
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72
Вода осч	ТУ 6-09-2502-77

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

5.3. Вспомогательные устройства и материалы

Колонка аналитическая, размером 100х3,2 мм, заполненная сорбентом С 8 с размером частиц 5,0 мкм
Аналитические аэрозольные фильтры гидрофобные на основе перхлорвинила с площадью рабочей поверхности 20 (фильтры)	ТУ 95-1892-89
Фильтродержатели	ТУ 95.72.05-77
Мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм	ТУ 9471-002-10471723-03
Бюксы стеклянные, СВ 24/10	ГОСТ 25336-82
Палочки стеклянные	ГОСТ 25336-82
Воронки химические	ГОСТ 25336-82
Дистиллятор	ГОСТ Р 50444-92
Шкаф сушильный	ТУ 61-1-721-79

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88 с изменением N 1.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004-90.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-09 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК и ОБУВ, установленные ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, имеющий высшее образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедший обучение и владеющий техникой анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, освоивший метод анализа в процессе тренировки и уложившийся в нормативы оперативного контроля при проведении процедур контроля погрешности анализа.

8. Требования к условиям измерений

8.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха	;
- атмосферное давление	(84-106) кПа;
- относительная влажность воздуха, не более	80%.

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб воздуха.

9.1. Приготовление растворов

9.1.1. Основной раствор анастрозола с массовой концентрацией 500 готовят растворением г анастрозола в спирте этиловом 96%-м в мерной колбе вместимостью 100 .

Раствор устойчив в течение двух недель при хранении в холодильнике.

9.1.2. Рабочий раствор анастрозола N 1 с массовой концентрацией 100 готовят разбавлением 10,0 основного раствора анастрозола спиртом этиловым 96%-м в мерной колбе вместимостью 50 .

Раствор устойчив в течение недели при хранении в холодильнике.

9.1.3. Рабочий раствор анастрозола N 2 с массовой концентрацией 10 готовят разбавлением 5,0 рабочего раствора анастрозола N 1 спиртом этиловым 96%-м в мерной колбе вместимостью 50 .

Раствор устойчив в течение недели при хранении в холодильнике.

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

9.1.5. Приготовление подвижной фазы: смесь трифторуксусной кислоты, ацетонитрила, спирта метилового и воды особо чистой в соотношении 0,007:1:2:6,993 (по объему). В мерной колбе вместимостью 1 000 смешивают 0,7 трифторуксусной кислоты, 100 ацетонитрила и 200 спирта метилового. Доводят объем водой особо чистой до метки и перемешивают. Перед использованием подвижную фазу фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и дегазируют.

Хранят в хорошо укупоренной таре в защищенном от света месте в течение недели.

9.2. Подготовка хроматографа

Подготовку хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

9.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания анастрозола в хроматографируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной градуировки по шести сериям измерений по шести концентрациям вещества в каждой серии согласно табл. 2.

Таблица 2

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении анастрозола

Номер градуировочного раствора	Объем рабочего стандартного раствора N 1 с концентрацией анастрозола 100 ,	Объем рабочего стандартного раствора N 2 с концентрацией анастрозола 10 ,	Содержание анастрозола на фильтре, мкг	Массовая концентрация анастрозола в градуировочном растворе,	Содержание анастрозола в хроматографируемом объеме градуировочного раствора, мкг
1	0,00	0,0	0,0	0,0	0,00
2	0,00	0,1	1,0	0,1	0,01
3	0,00	0,2	2,0	0,2	0,02
4	0,00	0,3	3,0	0,3	0,03
5	0,05	0,0	5,0	0,5	0,05
6	0,08	0,0	8,0	0,8	0,08
7	0,10	0,0	10,0	1,0	0,10

Градуировочные растворы используют свежеприготовленные. Растворы устойчивы в течение суток при хранении в холодильнике.

На фильтры, помещенные в бюксы, пипеткой вместимостью 1 наносят рабочий раствор анастрозола N 1 с массовой концентрацией 100 и рабочий раствор анастрозола N 2 с массовой концентрацией 10 в соответствии с табл. 2. Фильтры подсушивают при комнатной температуре, затем, используя пипетку вместимостью 5,0 , приливают по 5,0 спирта этилового 96%-го и оставляют на 10 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтры отжимают, растворы сливают в мерные пробирки вместимостью 10 . Фильтры повторно обрабатывают 5,0 спирта этилового 96%-го и оставляют на 10 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтры тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в те же пробирки, объем доводят до 10,0 спиртом этиловым 96%-м. Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы.

Инжектируют в хроматограф по 0,1 каждого из градуировочных растворов.

По полученным данным строят градуировочную характеристику зависимости площади пика (приборные единицы) от содержания анастрозола в хроматографируемом объеме градуировочных растворов (мкг).

9.4. Условия хроматографирования градуировочных растворов и анализируемых проб

Длина волны детектора	215 нм
Объем вводимой пробы	0,1
Температура колонки	20°С
Расход подвижной фазы	1,0
Время удерживания анастрозола	мин

9.5. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества по п. 9.3 (в начале, середине и в конце измерений) и анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

, где (1)

, - значение площади пика (приборные единицы) анастрозола в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно;

- норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное измерение этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика не стабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировочной характеристики, предусмотренной методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики прибор градуируют заново.

9.6. Отбор проб воздуха

Отбор проб проводят с учетом требований ГОСТа 12.1.005-88 с изменением N 1 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и Р 2.2.2006-05 (прилож. 9) "Общие методические требования к организации и проведению контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны", раздел 2 "Контроль соответствия максимальным ПДК".

Одновременно отбирают две параллельные пробы.

Воздух аспирируют в течение 10 минут через фильтр, помещенный в фильтродержатель, снабженный металлической сеткой. Для определения массовой концентрации анастрозола на уровне 0,001 отбирают не менее 1 000 воздуха.

Отобранные пробы можно хранить в бюксах в течение суток в холодильнике.

10. Выполнение измерений

Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс и с помощью пипетки вместимостью 5 приливают 5,0 спирта этилового 96%-го, помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 10 минут для лучшего растворения вещества. Затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в мерную пробирку вместимостью 10 . фильтр повторно обрабатывают 5,0 спирта этилового 96%-го, помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 10 минут, снова тщательно отжимают и удаляют. Раствор сливают в ту же пробирку, объем раствора доводят до метки спиртом этиловым 96%-м. Далее раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографическую виалу.

Инжектируют в хроматограф по 0,1 раствора анализируемой пробы.

Хроматографический анализ растворов анализируемой пробы выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждого раствора анализируемой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Количественное определение содержания анастрозола (в мкг) в хроматографируемом объеме раствора анализируемой пробы проводят по предварительно построенной градуировочной характеристике.

Примечание. Фильтрование растворов анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в спирте этиловом 96%-м вспомогательных веществ, входящих в состав препаративных форм анастрозола.

11. Вычисление результатов измерений

Массовую концентрацию анастрозола в воздухе рабочей зоны С, , вычисляют по формуле:

, где (2)

а - содержание вещества в хроматографируемом объеме раствора анализируемой пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

В - общий объем раствора анализируемой пробы, ;

б - хроматографируемый объем раствора анализируемой пробы, ;

- объем воздуха, отобранный для анализа и приведенный к стандартным условиям (прилож. 1).

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

, где (3)

, - результаты параллельных определений массовой концентрации анастрозола в воздухе, ;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики измерений.

12. Оформление результатов анализа

Результат количественного химического анализа представляют в виде:

, при Р = 0,95, где

- среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, ;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация анастрозола менее 0,001 (более 0,01 )".

13. Контроль результатов измерений

13.1. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью по формуле:

, где (4)

, - средние значения массовой концентрации анастрозола, полученные в первой и второй лабораториях, ;

- значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.4).

13.2. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-02, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих, отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова