Межгосударственный стандарт ГОСТ 33819-2016 "Мясо и мясные продукты. Определение состава летучих жирных кислот методом газовой хроматографии" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 октября 2016 г. N 1490-ст)

Meat and meat products. Determination of volatile fatty acids by gas chromatography

Дата введения - 1 января 2018 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Разработан Федеральным государственным бюджетным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности имени В.М. Горбатова" (ФГБНУ "ВНИИМП им. В.М. Горбатова")

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июля 2016 г. N 89-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Казахстан	KZ	Госстандарт Республики Казахстан
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Россия	RU	Росстандарт
Украина	UA	Минэкономразвития Украины

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 октября 2016 г. N 1490-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33819-2016 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2018 г.

5 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на мясо, включая мясо птицы, субпродукты, мясные и мясосодержащие продукты, и устанавливает метод определения состава летучих жирных кислот с помощью газовой хроматографии.

Диапазон измерений содержания летучих жирных кислот составляет от 1 до 1000 мг/кг.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79*(1) Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3022-80 Водород технический. Технические условия

ГОСТ ISO 3696-2013*(2) Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля

ГОСТ 4025-95 Мясорубки бытовые. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-2-2003*(3) Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ ИСО 5725-6-2003*(4) Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 7269-2015 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести

ГОСТ 7702.2.0-95 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям

ГОСТ 9293-74 (ИСО 2435-73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 9792-73 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 17433-80 Промышленная чистота. Сжатый воздух. Классы загрязненности

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 20469-95 Электромясорубки бытовые. Технические условия

ГОСТ 23392-78 Мясо. Методы химического и микроскопического анализа свежести

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26272-98 Часы электронно-механические кварцевые наручные и карманные. Общие технические условия

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ 28165-89 Приборы и аппараты лабораторные из стекла. Аквадистилляторы. Испарители. Установки ректификационные. Общие технические требования

ГОСТ 29224-91 Посуда лабораторная стеклянная. Термометры жидкостные стеклянные лабораторные. Принципы устройства, конструирования и применения

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 летучие жирные кислоты; ЛЖК: Низкомолекулярные карбоновые кислоты, входящие в состав липидов жировой ткани мяса и влияющие на формирование аромата в процессе термической обработки сырья и хранения продукта, способные при кипячении улетучиваться с водяным паром.

3.2 аналит: Вещество, определяемое при анализе.

3.3 аналитическая система: Установка для определения ЛЖК.

4 Требования безопасности

4.1 При подготовке и проведении испытаний необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

4.2 Помещение, в котором проводятся испытания, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004, и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4.3 При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.

5 Сущность метода

Метод основан на выделении летучих жирных кислот из продукта паровой дистилляцией (перегонкой с водяным паром) с последующим их переводом в метиловые эфиры и разделением компонентов с помощью газовой хроматографии.

Количественное определение осуществляют по площади пика идентифицированных соединений методом абсолютной градуировки, полученной при анализе градуировочных растворов известных соединений в аналогичных условиях.

6 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и реактивы

Газовый хроматограф*(5), укомплектованный:

- пламенно-ионизационным детектором с пределом детектирования гС/с в пересчете на содержание углерода, обеспечивающим нагрев до температуры выше температуры колонки;

- масс-спектрометрическим детектором*(6) с ионизацией электронным ударом, позволяющий проводить измерения в диапазоне от 33 до 550 атомных единиц массы (а.е.м.), с разрешением по шкале масс не более 1,0 а.е.м. и чувствительностью в режиме ионизации электронным ударом: при инжекции в колонку 2 пг гексахлорбензола (сканирование в диапазоне от 45 до 359 а. е. м. за 1 с) отношение сигнал/шум на молекулярном ионе с m/z 284 не менее 10/1;

- устройством для введения образца с делением потоков (автосамплер);

- капиллярной колонкой длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщиной пленки 0,25 мкм;

- записывающим устройством с компьютерным управлением и автоматической программой обработки хроматографических данных в соответствии с комплектацией хроматографа.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 или нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт, специального или высокого класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более 0,0001 г.

Баня водяная, обеспечивающая поддержание температуры от 20°С до 100°С, с точностью 0,5°С.

Испаритель ротационный по ГОСТ 28165.

Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025 или электромясорубка бытовая по ГОСТ 20469 и с диаметром отверстий решетки 2-4 мм.

рН-метр с диапазоном измерений от 0 до 14 ед. рН с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более 0,1 ед. рН.

Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.

Часы электронно-механические по ГОСТ 26272.

Термометр по ГОСТ 29224, с диапазоном измерения температуры от 0°С до 100°С и ценой деления 1°С.

Банки стеклянные вместимостью 250 - 500  с крышкой.

Воронки делительные ВД-1-250(500) ХС по ГОСТ 25336.

Холодильник ХСВО 10 ХС по ГОСТ 25336.

Колбы конические Кн 1-100-24/29 ТХС, Кн 2-250-34 ТХС, Кн-2-250-50 ТХС по ГОСТ 25336.

Пипетки градуированные 1-1-1-1 или 1-2-1-1; 1-1-1-2 или 1-2-1-2; 1-1-1-5 или 1-2-1-5; 1-1-1-10 или 1-2-1-10 по ГОСТ 29227 или дозаторы автоматические с переменным объемом дозирования 100 - 1000  и относительной погрешностью дозирования не более 1%.

Флаконы - виалы для жидких проб вместимостью 2,5  в комплекте автосамплера газового хроматографа.

Фильтр мембранный из политетрафторэтилена с диаметром пор 0,45 мкм.

Колбы мерные 2-10-2, 2-100-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

Флаконы - виалы хроматографические из темного стекла вместимостью 2,0 .

Вода дистиллированная, степень чистоты II, по ГОСТ 6709 или вода для лабораторного анализа по ГОСТ ISO 3696.

Азот газообразный по ГОСТ 9293.

Ацетилхлорид, х.ч.

Ацетонитрил для хроматографии, х.ч.

Водород технический по ГОСТ 3022, марки А, или водород электролизный от генератора.

Воздух класса 0 по ГОСТ 17433, из безмасляного воздушного компрессора.

н-Гексан, х.ч.

Гелий газообразный (сжатый) высокой чистоты.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363, х.ч.

Метанол по ГОСТ 6995.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.

Хлороформ по ГОСТ 20015, х.ч.

Этилацетат для хроматографии, х.ч.

Стандартный раствор*(7) смеси метиловых эфиров С6-С24 жирных кислот в метиленхлориде массовой концентрации 10 : капроновой (С6:0), каприловой (С8:0), каприновой (С10:0), деценовой (С10:1), ундециловой (С11:0), лауриновой (С12:0), тридекановой (С13:0), миристиновой (С14:0), миристолеиновой (С14:1), пентадекановой (С15:0), цис-10-пентадеценовой (С15:1), пальмитиновой (С16:0), пальмитолеиновой (С16:1), маргариновой (С17:0), гептадеценовой (С17:1), стеариновой (С18:0), олеиновой (С18:1n9с), элаидиновой (C18:1n9t), линолевой (С18:2n6), гамма-линоленовой (С18:3n6), альфа-линоленовой (С18:3n3), нондекановой (С19:0), арахиновой (С20:0), гадолеиновой (С20:1n9), цис-11,14-эйкозадиеновой (С20:2n6), цис-8,11,14-эйкозатриеновой (С20:3n6),цис-11,14,17-эйкозатриеновой (С20:3n3), арахидоновой (С20:4n6), эйкозапентаеновой (С20:5n3), генэйкозановой (С21:0), бегеновой (С22:0), эруковой (С22:1n9), цис-13,16-докозадиеновой (С22:2n6), клупанодоновой (С22:5n3), докоза-гексаеновой (С22:6n3), трикозановой (С23:0), лигноцериновой (С24:0), нервоновой (С24:1) или стандартные образцы указанных индивидуальных метиловых эфиров жирных кислот, х.ч.

Примечание - Перечень и систематическое международное наименование жирных кислот животного происхождения приведены в приложении А.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также материалов и реактивов по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.

7 Отбор и подготовка проб

7.1 Отбор проб проводят по ГОСТ 7269, ГОСТ 7702.2.0, ГОСТ 9792.

7.2 Пробу измельчают, дважды пропуская через мясорубку с диаметром отверстий решетки 2 - 4 мм, и тщательно перемешивают.

7.3 Часть подготовленной пробы (контрольную пробу) помещают в стеклянную банку вместимостью 250 - 500 , закрывают крышкой и хранят при температуре (4 + 2)°С до окончания анализа.

Допускается хранить подготовленную пробу и контрольную пробу в замороженном состоянии при температуре не выше минус 18°С не более 7 сут.

8 Подготовка к анализу

8.1 Приготовление растворов

8.1.1 Приготовление 15%-ного раствора ацетилхлорида в метаноле

В колбу вместимостью 250  вносят 50  метанола и осторожно по каплям прибавляют 7,5  ацетилхлорида. Во избежание резкого вскипания смеси колбу охлаждают под струей холодной проточной воды или помещая ее в снег или лед.

Раствор хранят в герметично укупоренном сосуде при комнатной температуре не более 2 мес.

8.1.2 Приготовление насыщенного раствора гидроксида калия в метаноле

В колбу вместимостью 250  вносят 16,0 г гидроксида калия и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды (около 10 ). Во избежание резкого вскипания смеси колбу охлаждают под струей холодной проточной воды, а затем добавляют 100  метанола.

Раствор хранят в герметично укупоренном сосуде при комнатной температуре не более 2 мес.

8.1.3 Приготовление насыщенного раствора хлорида натрия

35,0 г хлорида натрия вносят в колбу вместимостью 100  и растворяют в 65  дистиллированной воды.

Раствор хранят в герметично укупоренном сосуде при комнатной температуре не более 2 мес.

8.1.4 Приготовление градуировочных растворов

0,1  стандартного раствора смеси метиловых эфиров или 0,001 г стандартных образцов метиловых эфиров С6-С24 жирных кислот растворяют в 1  метанола или гексана в мерной колбе вместимостью 10  с притертой пробкой и доводят объем раствора гексаном до метки. Полученный раствор имеет концентрацию 0,1  или 100 .

Для градуировки допускается разбавлять 1  полученного раствора в 10 раз, смешивая его с 9  гексана, или использовать готовые растворы метиловых эфиров жирных кислот. Полученный раствор имеет концентрацию 0,01 .

Раствор используют свежеприготовленным.

Допускается хранение смеси метиловых эфиров или индивидуальных С6-С24 жирных кислот в метаноле при температуре минус 20°С в запаянной стеклянной ампуле в течение 2 мес.

Примечание - При использовании смеси метиловых эфиров С6-С24 жирных кислот допускается для последующей хроматографической идентификации использовать стандартные растворы разной концентрации. Величина оптимальной концентрации для сигнала регистрации на экране устанавливается экспериментально для конкретного типа хроматографа. Хорошая идентификация пиков на пламенно-ионизационном детекторе наблюдается при получении выходного сигнала более 10 мВ с общей интенсивностью сигнала в 1000 мВ.

8.2 Градуировка газового хроматографа с пламенно-ионизационным детектором и установление времени удерживания и построение градуировочной зависимости

8.2.1 В хроматограф в автоматическом режиме в соответствии с заданной программой вводят 1  стандартного раствора метиловых эфиров жирных кислот с концентрацией 0,1  в гексане или метаноле.

8.2.2 При калибровке в таблицу автоматического обсчета результатов анализа вносят установленные времена выхода пиков для каждого вещества с отклонением 0,2 мин. Калибровку проверяют и сверяют с ранее полученными калибровками ежедневно, а также после выполнения подряд более десяти анализов.

Для уточнения времени выхода пика для каждой жирной кислоты используют метод внутреннего стандарта. Для этого в раствор пробы вносят известную массовую концентрацию метилового эфира конкретной жирной кислоты, превышающую в три - пять раз уровень ее содержания в пробе, и проводят хроматографирование по 9.4, устанавливая время выхода нового более интенсивного пика, соответствующего времени выхода введенного эфира жирной кислоты.

8.3 Градуировка газового хроматографа с масс-спектрометрическим детектором и построение градуировочной зависимости

8.3.1 Градуировку и настройку масс-спектрометрического детектора в режиме электронной ионизации проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

8.3.2 ГХ-МС анализ приготовленного по 8.1.4 градуировочного раствора смеси метиловых эфиров жирных кислот массовой концентрацией 0,1  проводят в условиях, выбранных в соответствии с 9.3. Проводят по три параллельных измерения для каждой концентрации градуировочных растворов. Полученные хроматограммы обрабатывают с использованием компьютерной системы обработки данных. Определяют абсолютное время удерживания целевых веществ. С использованием средств программного обеспечения строят градуировочную зависимость площади пика определяемых веществ от концентрации аналита в пробе.

Коэффициент линейной корреляции полученной градуировочной зависимости должен быть не менее 0,99. При невыполнении этого условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их. В случае необходимости готовят новые градуировочные растворы.

Проведение градуировки обязательно при замене хроматографической колонки, а также при систематическом получении неудовлетворительных результатов контроля, выполняемого по разделу 12.

8.4 Контроль хроматографической (аналитической) системы

Контроль выполняют с использованием приготовленного по 8.1.4 градуировочного раствора. Полученный результат анализа не должен отличаться от действительного значения концентрации определяемых веществ в градуировочном растворе более чем на 3%, относительное стандартное отклонение времени удерживания аналитов - не более чем на 5%. В случае невыполнения указанного критерия стабильности градуировочной характеристики проводят новую градуировку.

Контроль аналитической системы осуществляют при условиях, указанных в 9.3.1, перед началом проведения измерений, а также при смене хроматографической колонки, чистке блоков аналитического прибора и т.д.

9 Проведение анализа

9.1 Выделение летучих жирных кислот из продукта

9.1.1 Пробу массой 25,0 г используют для выделения летучих жирных кислот, которое проводят по ГОСТ 23392.

9.1.2 К полученному дистилляту добавляют 100  хлороформа в соотношении 1:1. Смесь перемешивают в течение 5 мин для переэкстракции аналита в фазу органического растворителя, отделяют нижнюю половину хлороформного слоя на делительной воронке и упаривают экстракт досуха на ротационном испарителе.

9.2 Метилирование жирных кислот

9.2.1 К полученному после упаривания остатку прибавляют 3  15%-ного раствора ацетилхлорида в метаноле и выдерживают смесь на водяной бане при температуре 100°С в течение 2 ч. В качестве реактора для метилирования используют пробирку с пришлифованным обратным холодильником.

9.2.2 После завершения обработки по переводу образующихся жирных кислот в форму метилового эфира (см. 9.2.1) к охлажденной до комнатной температуры смеси пипеткой прибавляют 1,25  насыщенного раствора гидроксида калия в метаноле до значения 5,0 - 6,0 ед. рН, а затем 3  насыщенного водного раствора хлорида натрия и 3  гексана. Смесь встряхивают и дают ей отстояться в течение 30 мин до получения прозрачного верхнего слоя жидкости, или фильтруют через мембранный фильтр из политетрафторэтилена.

1  прозрачного верхнего гексанового раствора метиловых эфиров жирных кислот помещают в виалы и проводят хроматографический анализ в соответствии с 9.3.

9.3 Условия хроматографирования

9.3.1 Условия проведения хроматографического анализа подбирают в зависимости от вида применяемого хроматографа и хроматографической колонки.

В соответствии с инструкцией по эксплуатации проводят включение газового хроматографа, устанавливая давление газа на входном манометре хроматографа 5 МПа. В соответствии с характеристиками хроматографа задают программируемый метод анализа.

9.3.2 Для хроматографа с пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой при меняют следующие хроматографические условия:

- повышение температуры колонки в термостате от 100°С до 260°С со скоростью 10 °С/мин;

- температура инжектора - 250°С;

- температура детектора - 300°С;

- скорость потока водорода из генератора или из баллона - 35 ;

- скорость потока азота - 20 ;

- скорость потока газа-носителя через колонку - 0,5 ;

- деление потока - 1:100;

- время анализа - 30 мин;

- ввод 1  пробы.

Для промывки шприца в автосамплере и очистки капиллярной колонки применяют последовательное введение этилацетата, ацетонитрила и гексана.

Анализ проб с низким содержанием полиненасыщенных жирных кислот (менее 0,01% от суммы) проводят на хроматографе с масс-спектрометрическим детектором.

9.3.3 Газовый хроматограф*(8) с масс-спектрометрическим детектором включают в соответствии с инструкцией по