Наставление по диагностике бруцеллеза животных (утв. Департаментом ветеринарии 29 сентября 2003 г. N 13-5-02/0850)

Наставление по диагностике бруцеллеза животных
(утв. Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 29 сентября 2003 г. N 13-5-02/0850)

Наставление по диагностике бруцеллеза животных от 29.09.03 N 13-5-02/0850 вводится в действие на территории Российской Федерации с 1 января 2004 г.

1. Общие положения

1.1. Бруцеллез - инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.

Возбудитель - бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (овец и коз), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), канис (собак), овис (баранов и овец) и неотома (кустарниковых крыс).

Микроорганизмы первых четырех видов вызывают бруцеллез животных, а пятого вида - инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ).

От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.

1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом санитарными и ветеринарными правилами по профилактике и борьбе с заразными болезнями, общими для человека и животных.

1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:

- различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида. Бруцеллы видов мелитензис, абортус и суис могут мигрировать на животных других видов;

- клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее часто клиническое проявление болезни у маточного поголовья - аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов.

При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез сопровождается нередко поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок - эндометрит, вагинит, у самцов - орхит, эпидидимит);

- патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно, так называемый "милиарный бруцеллез матки";

- у баранов, больных бруцеллезом, в семенниках и придатках обнаруживают некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенников.

1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое) исследования материала и аллергическое исследование свиней в хозяйствах.

Плановые серологические исследования являются основным методом выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.

Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.

Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) проводят в случае аборта и при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, из хозяйств, благополучных по данному заболеванию.

1.4. При взятии проб крови, молока и патологического материала, а также проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

2. Взятие материала от животных и пересылка его для лабораторных исследований

2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.

2.2. Для бактериологического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее трех плодов) или селезенку, печень, желудок плода с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.

Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут кровь, молоко, содержимое гигром (бурситов) и абсцессов. При диагностическом убое - дополнительно селезенку, печень, подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые лимфатические узлы и половые органы. Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).

При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10 - 15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.

У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-ного спиртоводного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.

2.2.1. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в этот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для серологического исследования на бруцеллез. Если в течение 24 - 30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4 - 5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

2.3. Для серологического исследования в лабораторию направляют кровь (сыворотку крови) и молоко.

2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней - из яремной, ушной или хвостовой; у собак - головной предплечья или латеральной подколенной голени; у лисиц и песцов - из бедренной вены; у норок - путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста в стерильные пробирки по 5 - 7 мл (от пушных зверей по 1 - 2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30 - 38°С в течение 1 ч или при комнатной температуре 8 - 10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4 - 10°С. Через 20 - 24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3 - 4 ч и повторно через 10 - 12 ч).

Консервирование сывороток проводят:

- добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-ного раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при тщательном перемешивании;

- сухой борной кислотой (2 - 4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;

- путем однократного замораживания.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут. со дня взятия крови при условии хранения их при 4 - 8°С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут.; замороженные сыворотки - в течение 3 сут. после однократного оттаивания.

Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.

2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут сборную из каждой доли вымени одного удоя в одну стерильную пробирку в количестве 10 - 15 мл. При этом, если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Молоко исследуют свежее (охлажденное до 4 - 10°С или неохлажденное) или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-ного раствора формалина на 5 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2 - 3 сут. Перед исследованием молоко необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.

При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.

2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.

3. Бактериологическая диагностика бруцеллеза

3.1. Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание.

3.2. Бруцеллы обнаруживают бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.

3.3. Бактериоскопическое исследование

Из доставленного на исследование патологического материала делают по два мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.

Мазки, фиксированные над пламенем горелки, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шину (см. Прил. N 1, п. 1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы - мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину в красный цвет.

3.4. Бактериологическое исследование

3.4.1. Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночный глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночно-сывороточный агар и печеночно-аминопептидный агар, (см. Прил. N 1, п. 2) и другие питательные среды, предназначенные для этой цели.

3.4.2. Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5%-ным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка - в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.

Из печени и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0 х 1,5 х 2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1 - 0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.

Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.

При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

Из плодовых оболочек и плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).

Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3%-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5%-ного спиртоводного раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 12,5 мг на 100 мл среды и др.

Содержимое бурс, гигром высевают на 3 - 4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.

Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1 - 0,2 мл вносят на 3 - 4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом или другими консервантами, высевают на среды без бактериостатических веществ.

3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37 - 38°С.

При исследовании материала от крупного рогатого скота половину засеянных пробирок и чашек культивируют в обычных условиях, другую - в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10 - 15%) в -инкубаторе или эксикаторе (микроанаэростате). Аналогичные условия можно создать в пробирках, закрытых резиновыми пробками или залитых парафином.

Перед парафинированием пробирки закрывают ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5 - 1,0 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.

Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

- заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;

- внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-ного раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);

- сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора. Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Прил. N 1, п. 3).

3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37 - 38°С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 24 - 48 ч. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, обезвреживают путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3 - 4 сут. визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.

При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете - сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов, и делают пересев на чашки с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.

Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов - по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл.

Для постановки пластинчатой реакции агглютинации на стекле необходимы следующие компоненты: испытуемая культура, набор для серологической дифференциации бруцелл (выпускается биопредприятием), 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор рН 7,0 - 7,2.

Для исследования берут двухсуточные агаровые культуры. R- и S-сыворотки бруцеллезные агглютинирующие разводят 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения, указанного на этикетке коробки. Разведенные сыворотки допускается использовать в течение месяца. R-антиген бруцеллезный цветной для РА и антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы в пластинчатой РА применяют неразведенными. Предметные стекла для реакции подготавливают общепринятым способом. Физиологический раствор, пробирки и пипетки должны быть стерильными.

Техника постановки реакции. На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R- и S-сывороток бруцеллезных агглютинирующих и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно эмульгируют в каплях R- и S-сывороток и в капле физиологического раствора для определения самоагглютинации культуры. Параллельно в каждом опыте ставят контроли: R- и S-сыворотки в разведении, указанном на этикетке, с цветным R-бруцеллезным антигеном и с роз бенгал антигеном.

Учет и оценка реакции. Реакцию учитывают невооруженным глазом или с помощью увеличительного стекла в течение 2 минут по следующей схеме:

++++ (4 креста) - полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината - положительная реакция;

+++ (3 креста) - неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом - положительная реакция;

++ (2 креста) - неполное просветление жидкости со слабо выраженным агглютинатом - положительная реакция;

+ (1 крест) - жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом - сомнительная реакция;

- (минус) - просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная - отрицательная реакция.

Следует иметь ввиду, что реакция с R-бруцеллезной сывороткой проходит замедленно; агглютинат, как правило, мелкозернистый. Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях R- и S-бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем 3 креста, а с гетерологичными - отсутствует.

Реакцию с испытуемой культурой считают положительной при наличии агглютинации на 2 креста и более. При отрицательной реакции ее проводят повторно с этой же культурой, взятой из трех-четырех мест посева.

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными и тинкториальными свойствами, а также дающие положительную реакцию агглютинации с R- и S-бруцеллезными сыворотками в отдельности или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, признают бруцеллами.

Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов и бруцеллеза собак, вызванного B. canis, постоянно агглютинируется только R-бруцеллезной сывороткой.

3.5. Биологическое исследование

3.5.1. Биологическое исследование проводят на морских свинках (не менее двух) массой 350 - 400 г, предварительно проверенных на бруцеллез исследованием в РА сыворотки крови в разведении 1:5 с отрицательным результатом.

3.5.2. Для постановки биологической пробы используют тот же материал, что и для бактериологического исследования.

Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят морской свинке подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 1 мл.

Из плаценты и плодовых оболочек, предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами, вырезают кусочки размером 0,5 х 0,5 см, фламбируют на пламени горелки, растирают в ступке со стерильным песком и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке в объеме 1 мл.

Содержимое гигром, бурс вводят морской свинке подкожно в объеме 0,2 - 0,3 мл. При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.

Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Морской свинке вводят подкожно 2 - 3 мл материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.

3.5.3. На 15, 25 и 40-е сут. после заражения у морских свинок берут кровь в количестве 1 - 2 мл из ушной вены путем надреза или из сердца - путем пункции. Сыворотку крови исследуют в пробирочной РА в разведениях от 1:10 до 1:80.

При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически. Высевы делают пастеровскими пипетками в одну пробирку бульона и две пробирки агара из паховых, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (2 высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют, как описано в подпунктах 3.4.3 и 3.4.4.

При отрицательной РА у морских свинок в указанные выше сроки биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бакисследование не проводят.

3.5.4. При выделении культуры бруцелл на питательных средах из исходного материала биологическое исследование по данной экспертизе прекращают, а ранее зараженных морских свинок убивают без бакисследования.

3.6. Результат исследования на бруцеллез считают положительным при выделении культуры возбудителя или при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, если из исходного материала культура не выделена.

При положительных результатах бактериоскопии и отрицательных результатах бактериологического исследования и биопробы материал считают подозрительным на бруцеллез. При сохранении патматериала или возможности взятия нового (кровь, молоко, моча и др.) исследование проводят методом полимеразной цепной реакции. По ее результатам делают заключение о заболевании животных бруцеллезом.

3.7. Сроки исследования:

- бактериологического - до 1 мес.;

- биологического - до 2 мес.

3.8. В ветеринарных лабораториях все выделенные культуры бруцелл после их идентификации подлежат уничтожению путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

3.9. При необходимости определения вида бруцелл выделенные от животных культуры направляют в республиканские, краевые, областные ветеринарные лаборатории или ветеринарные научно-исследовательские учреждения, в которых имеются лаборатории или отделы, занимающиеся изучением бруцеллеза животных и имеющие разрешение органов здравоохранения на работу с микроорганизмами второй группы.

4. Серологическая диагностика бруцеллеза

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции агглютинации (РА) в пробирках, реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), реакции иммунодиффузии с 0-полисахаридным антигеном (РИД), пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба - РБП) и в молоке коров - кольцевой реакции (КР) и других реакциях, утвержденных в установленном порядке.

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации (РА) в пробирках

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

- испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);

- позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием;

- негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная биопредприятием или полученная в лаборатории;

- антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 6);

- 0,5%-ный фенолизированный раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и антигена используют фенолизированный физиологический раствор хлорида натрия (0,85%-ный); при исследовании крови овец и коз - 5%-ный и оленей (маралов) - фенолизированный 10%-ный раствор хлорида натрия (см. Прил. N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации

Реакцию агглютинации проводят в серологических пробирках в объеме 1 мл в четырех разведениях:

- при исследовании сывороток крови овец, коз, оленей (маралов) и собак - 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;

- крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов - 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

- пушных зверей и морских свинок - 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Компоненты реакции вносят индивидуальными мерными пипетками (дозаторами) или групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках первого ряда делают исходное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирку, добавляют к ней 2,4 мл соответствующего раствора хлорида натрия, смешивают и получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови овец, коз, оленей (маралов) и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5). Таким образом делают исходное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления исходного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского или индивидуальных пипеток-дозаторов переносят в пробирки второго и третьего рядов по 0,5 мл исходного разведения сывороток (1:25; 1:12,5 или 1:5). В пробирках третьего ряда сыворотки смешивают, по 0,5 мл этого разведения переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда - в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные разведения сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разведенного 1:10 соответствующим раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается и, в зависимости от вида исследуемых животных, будет составлять 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, они служат контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей) или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл при исследовании сывороток овец, коз, оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена, разведенного соответствующим раствором хлорида натрия 1:20. При этом разведения сывороток будут соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли с негативной и позитивной бруцеллезной сыворотками в таких же разведениях.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при 37 - 38°С на 16 - 20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) - полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде "зонтика", при легком встряхивании "зонтик" разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный "зонтик" (75% агглютинации);

++ (2 креста) - неполное просветление жидкости, "зонтик" умеренно выражен (50% агглютинации);

+ (1 крест) - едва заметное просветление жидкости, "зонтик" выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);

- (минус) - просветления жидкости и образования "зонтика" не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц (МЕ) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 МЕ, 1:200 - 200 МЕ и т.д.).

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности, соответствующие 75, 50, 25 и 0% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания пробирок из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по 0,5 мл физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50 и 25% просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.

При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сывороткой крови крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей, не иммунизированных или иммунизированных неагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), содержащей 200 МЕ антител и выше; овец и коз - 100 МЕ и выше; оленей (маралов) и собак - 50 МЕ и выше; пушных зверей и морских свинок - 10 МЕ и выше.

При выявлении среди не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, а также иммунизированных неагглютиногенными вакцинами крупного рогатого скота, верблюдов и лошадей, животных, реагирующих только в РА с содержанием антител 50 - 100 МЕ, а среди овец, коз, оленей (маралов), собак - 25 МЕ, считают сомнительно реагирующими и исследуют повторно через 15 - 30 сут. При повышении титров заболевание считают установленным. При сохранении титров на прежнем уровне проводят дополнительные исследования по дифференциации, согласно утвержденным методам.

При выявлении в стадах крупного рогатого скота, ранее иммунизированного против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), животных, реагирующих только в РА с содержанием не выше 200 МЕ антител и РСК в разведении сыворотки крови не выше 1:10, их повторно исследуют через 15 - 30 сут. в РА, РСК и РИД. При повышении содержания антител в исследуемых сыворотках в РА и (или) РСК или положительной РИД заболевание считают установленным.

При выявлении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, ранее не иммунизированных или иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, животных, положительно реагирующих в РА с содержанием 100 МЕ антител и выше, признают больными. Реакцию считают сомнительной при содержании 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 - 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительного результата животных признают больными бруцеллезом.

При исследовании в РА неиммунизированных баранов-производителей, козлов, пробников и ярок, содержащихся в благополучных по бруцеллезу отарах, где овцы (козы) иммунизированы против бруцеллеза, реакцию считают положительной, а заболевание установленным при содержании в сыворотке крови животных 100 МЕ антител и выше. Реакцию считают сомнительной при наличии 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 - 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительных результатов животных признают здоровыми, а отару - благополучной по бруцеллезу.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой 2 - 4 креста - "положительная" 200 МЕ; титр сыворотки 1:100 с оценкой 2 - 4 креста - "сомнительная" 100 МЕ).

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его годности, а также титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических исследований.

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК)

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо РСК при исследовании на бруцеллез сывороток крови животных.

4.3.2. Компоненты реакции и их подготовка к работе:

- испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);

- позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от больного бруцеллезом животного;

- негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная на биопредприятии или полученная в лаборатории.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной бане в день постановки реакции: для РСК - при 60 - 62°С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов и мулов - 64 - 65, буйволов - 62 - 64, свиней - 58 - 60°С); для РДСК - сыворотки крови животных всех видов - при 63 - 64°С в течение 30 мин.;

- антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК в рабочем титре, указанном биопредприятием-изготовителем (см. Прил. N 2, п. 6);

- комплемент - сыворотка крови морской свинки, лиофильно высушенная, биофабричного изготовления или нативная (свежая или консервированная добавлением 2 - 4% борной кислоты).

Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором, как указано на этикетке коробки. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта количество комплемента. В каждую ампулу (флакон) вносят физиологический раствор и, не встряхивая, помещают в холодильник на 20 - 30 мин. Растворившийся комплемент осторожно перемешивают путем легкого встряхивания ампул (флаконов), сливают в одну пробирку, смешивают и помещают в холодильник при 4 - 10°С. Непосредственно перед внесением в пробирки для титрования растворенный или нативный комплемент разводят физиологическим раствором 1:20, а остальной - хранят в холодильнике для постановки главного опыта. Рабочее разведение комплемента также готовят непосредственно перед внесением в пробирки главного опыта;

- гемолитическая сыворотка (гемолизин) - сыворотка крови кролика, гипериммунизированного эритроцитами барана, - для РСК и РДСК в удвоенном титре. Титрование гемолизина проводят при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности (см. Прил. N 2, п. 5);

- эритроциты барана - 2,5%-ная от осадка взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе для РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы взвесь эритроцитов и раствор гемолизина в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37 - 38°С в течение 15 - 20 мин. при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК - в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолизина вливают во взвесь эритроцитов;

- физиологический раствор - 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде с рН 6,8 - 7,2 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и кальция (см. Прил. N 2, п. 2). Последний в обязательном порядке готовят в случае использования нативного комплемента (свежей или консервированной сыворотки крови морской свинки).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции и при необходимости проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

Компоненты реакции	Проверка на:
	антикомплементарность	гемотоксичность
		комплемента	гемолизина	антигена	физиологического раствора
Комплемент в разведении 1:20	0,2	0,2	-	-	-
Гемолизин в рабочем разведении	0,2	-	0,2	-	-
Антиген в рабочем разведении	0,4	-	-	0,4	-
Эритроциты 2,5%-ная взвесь	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	-	0,6	0,6	0,4	0,8
водяная баня при 37 - 38°С
Результат	Гемолиз	Полная задержка гемолиза

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.

4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента

Реакцию проводят в водяной бане при 37 - 38°С в объеме 1 мл (по 0,2 мл сыворотки, антигена, комплемента и 0,4 мл гемолитической системы).

Перед каждой постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической системе на сыворотке из опыта, т.е. того вида животных, которых исследуют (см. табл. 1), или в гемолитической системе (см. Прил. 2, п. 4). Если в пробирках с сывороткой и антигеном отмечают задержку гемолиза по сравнению с той же сывороткой без антигена, это означает, что для титрования была взята положительная сыворотка. В таком случае определение титра комплемента проводят по ряду пробирок без антигена.

Сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и вносят по 0,2 мл в два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент.

Для более точной дозировки вначале готовят необходимые разведения комплемента в десятикратных объемах в отдельных пробирках дополнительного ряда. В пробирки вносят комплемент, разведенный 1:20 (1,0 + 19,0 физраствора), в дозах 0,2; 0,4; 0,6 мл и т.д. до 2 мл и добавляют в каждую пробирку недостающее до 2 мл количество физиологического раствора, т.е. соответственно 1,8; 1,6; 1,4 мл и т.д. по следующей схеме:

Доза комплемента	0,02	0,04	0,06	0,08	0,1	0,12	0,14	0,16	0,18	0,2
Комплемент 1:20	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	1,2	1,4	1,6	1,8	2,0
Физиологический раствор	1,8	1,6	1,4	1,2	1,0	0,8	0,6	0,4	0,2	-

Из первой пробирки этого ряда переносят по 0,2 мл жидкости в первые пробирки с сывороткой, взятой для титрования, из второй пробирки - соответственно во вторые пробирки с сывороткой и т.д. Работу можно выполнять аппаратом Флоринского.

Титрование можно проводить путем внесения микропипеткой в пробирки каждого ряда с сывороткой комплемента, разведенного 1:20 (0,1 + 1,9 физраствора), в возрастающих дозах от 0,02 до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и добавления недостающего до 0,2 мл (в каждой пробирке) количества физиологического раствора.

После внесения комплемента в первый ряд пробирок с сывороткой вносят по 0,2 мл антигена в рабочем разведении, а во второй ряд - по 0,2 мл физиологического раствора, смешивают путем встряхивания штатива и ставят в водяную баню при 37 - 38°С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл гемолитической системы, смешивают путем встряхивания и вновь помещают в водяную баню на 20 мин., после чего учитывают результат.

Схема титрования комплемента в бактериолитической системе представлена в таблице 1.

Таблица 1

Схема титрования комплемента в бактериолитической системе

Компоненты реакции	Ряд пробирок	Номера пробирок
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Сыворотка из опыта 1:5	первый	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	второй	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
водяная баня 30 мин. при 58 - 65°С
Антиген в рабочем разведении	первый	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	второй	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Физиологический раствор	первый	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	второй	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Доза комплемента в разведении 1:20	первый	0,02	0,04	0,06	0,08	0,1	0,12	0,14	0,16	0,18	0,2
	второй	0,02	0,04	0,06	0,08	0,1	0,12	0,14	0,16	0,18	0,2
Физиологический раствор	первый	0,18	0,16	0,14	0,12	0,1	0,08	0,06	0,04	0,02	-
	второй	0,18	0,16	0,14	0,12	0,1	0,08	0,06	0,04	0,02	-
водяная баня 20 мин. при 37 - 38°С
Гемолитическая система	первый	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
	второй	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
водяная баня 20 мин. при 37 - 38°С
Примерный результат	первый	ЗГ	ЗГ	ЗГ	ЧГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ
	второй	ЗГ	ЗГ	ЧГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ

Титром комплемента в бактериолитической системе считают его минимальное количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов в пробирках с негативной сывороткой или позитивной сывороткой без антигена в течение 20 мин. в водяной бане при 37 - 38°С.

Учет результатов титрования проводят немедленно после выемки штатива из бани.

В примере, приведенном в таблице 1, титр комплемента в баксистеме равен 0,1. Рабочий титр комплемента для главного опыта на 0,02 больше, т.е. 0,12.

Схема титрования комплемента в гемолитической системе приведена в таблице 1 Приложения N 2.

Титром комплемента в гемолитической системе считают его минимальное количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов в течение 10 мин. в водяной бане при 37 - 38°С.

В приведенном примере титр комплемента в гемолитической системе равен 0,08. Рабочий титр комплемента для главного опыта на 0,04 больше, т.е. 0,12.

Количество комплемента, необходимого для проведения главного опыта, рассчитывают по формуле:

,

где:

Х - количество комплемента;

А - рабочий титр комплемента;

В - количество пробирок в опыте;

20 - исходное разведение комплемента (1:20).

Пример: .

Так как количество комплемента в рабочем разведении, требующемся для всей реакции (на 100 пробирок), равно 20 мл (0,2 х 100), то к 0,6 мл нативного комплемента следует добавить 19,4 мл физиологического раствора.

4.3.4. Проведение главного опыта

Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сывороток), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном (см. таблицу 2).

Необходимые разведения сывороток готовят следующим образом:

- при исследовании в одной пробирке к 0,05 мл испытуемой сыворотки добавляют 0,2 мл физиологического раствора (разведение 1:5);

- при постановке реакции в трех пробирках в первую вносят 0,1 мл испытуемой сыворотки, добавляют 0,4 мл физиологического раствора (разведение 1:5) и смешивают. Из первой пробирки берут 0,3 мл, переносят 0,2 мл во вторую пробирку и 0,1 мл - в третью, в которую затем добавляют 0,1 мл физиологического раствора (разведение 1:10).

Инактивирование разведенных сывороток проводят в порядке, указанном в подпункте 4.3.2.

Сыворотку, физиологический раствор и другие компоненты реакции вносят при помощи индивидуальных пипеток (дозаторов) или аппарата Флоренского и др.

Реакцию проводят по схеме главного опыта (см. таблицу 2).

Таблица 2

Схема главного опыта РСК

Компоненты реакции	При массовом исследовании (разведение в одной пробирке)	При повторном исследовании (разведение в трех пробирках)
	1 (1:5)	1 (1:5)	2 (1:5)	3 (1:10)
Испытуемая сыворотка	0,05	-------------------------- | | | | | | | | 0,1 |0,2 |0,1
Физиологичес- кий раствор	0,2	0,4	-	0,1
водяная баня 30 мин. при 58 - 65°С
Физиологичес- кий раствор	-	0,2	-	-
Антиген в рабочем разведении	0,2	-	0,2	0,2
Комплемент в рабочем разведении	0,2	0,2	0,2	0,2
водяная баня 20 мин. при 37 - 38°С
Гемолитичес- кая система	0,4	0,4	0,4	0,4
водяная баня 20 мин. при 37 - 38°С

Примечание. Допускается смешивание равных объемов рабочих разведений антигена и комплемента непосредственно перед внесением в пробирки.

Главный опыт сопровождается следующими контролями:

- негативной и позитивной бруцеллезной сывороток в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме главного опыта);

- гемолитической системы (0,4 мл гемолитической системы и 0,6 мл физиологического раствора);

- комплемента (0,2 мл комплемента в рабочем разведении; 0,4 мл физиологического раствора и 0,4 мл гемолитической системы);

- антигена (0,2 мл антигена в рабочем разведении; 0,4 мл физраствора и 0,4 мл гемолитической системы).

4.3.5. Постановка реакции длительного связывания комплемента (РДСК)

Реакцию длительного связывания комплемента на холоде проводят в серологических пробирках. Сыворотку, антиген и комплемент вносят по 0,2 мл, гемолитическую систему - в оттитрованной рабочей дозе.

Последовательность постановки РДСК

Первый день	Розлив испытуемых и контрольных сывороток для главного опыта и для титрования гемолитической системы. Инактивирование сывороток. Контроль компонентов реакции на антикомплементарность и гемотоксичность (по схеме 4.3.2). Розлив антигена и комплемента. Приготовление гемолитической системы. Выдерживание пробирок главного опыта, титрации гемсистемы и гемсистемы в холодильнике
Второй день	Выдерживание пробирок главного опыта, титрации гемсистемы и гемолитической системы при комнатной температуре 20 минут. Титрование гемолитической системы. Главный опыт. Розлив гемолитической системы в пробирки с исследуемыми сыворотками. Водяная баня. Учет и оценка результатов реакции

Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном (см. табл. 6). Одновременно разливают сыворотки для титрования гемолитической системы. Разведения сывороток готовят, как указано в подпункте 4.3.3. Инактивирование разведенных сывороток крови проводят, как указано в подпункте 4.3.2, гемсистему готовят по п. 4.3.2.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:20 при титре 0,06 - 0,1 или 1:20 - 1:15 при титре 0,1 - 0,14, указанном на этикетке коробки с препаратом, изготовленным биопредприятием. Если титр комплемента неизвестен или используется сыворотка крови морской свинки, то титр определяют в гемсистеме и разводят, как указано выше.

Перед внесением гемолитической системы в пробирки с исследуемыми сыворотками проводят титрование гемолитической системы на сыворотке из опыта (свежей или консервированной) по схеме, приведенной в таблице 3.

Таблица 3

Схема титрования гемолитической системы

Компоненты реакции	Ряд пробирок в штативе	Номера пробирок
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Сыворотка из опыта в разведении 1:5	первый	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	второй	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
водяная баня 30 мин. при 63 - 64°С
Физиологический раствор	первый	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	второй	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Антиген в рабочем разведении	первый	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	второй	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Комплемент в рабочем разведении	первый	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	второй	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
холодильник 16 - 18 ч при 2 - 6°С
Гемолитическая система	первый	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9	1,0
	второй	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9	1,0
водяная баня 20 мин. при 37 - 38°С
Примерный результат	первый	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ЗГ	НГ	НГ
	второй	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ЗГ	ЗГ	НГ

Учет результатов титрования проводят немедленно после выемки штатива из бани.

Титром гемолитической системы считают наибольшее ее количество, в котором произошел полный гемолиз в обоих рядах пробирок с негативной сывороткой или в безантигенном ряду, если исследуемая сыворотка оказалась позитивной. Рабочая доза на один интервал ниже (например: при титре гемолитической системы 0,7 мл рабочая доза - 0,6 мл).

Внесение компонентов и последовательность постановки реакции проводят по схеме, указанной в таблице 4.

Таблица 4

Схема постановки РДСК

Компоненты реакции	При массовом исследовании (разведение в одной пробирке)	При повторном исследовании (разведение в трех пробирках)
	1 (1:5)	1 (1:5)	2 (1:5)	3 (1:10)
Испытуемая сыворотка	0,05	--------- | 0,1 |		0,1
			| | 0,2
Физиологичес- кий раствор	0,2	0,4	-	0,1
водяная баня 30 мин. при 63 - 64°С
Физиологичес- кий раствор	-	0,2	-	-
Антиген в рабочем разведении	0,2	-	0,2	0,2
Комплемент в рабочем разведении	0,2	0,2	0,2	0,2
холодильник 2 - 6°С 16 - 18 ч и 20 мин. при комнатной температуре
Гемолитичес- кая система в рабочей дозе	0,6	0,6	0,6	0,6
водяная баня 20 мин. при 37 - 38°С

Контроли реакции:

- негативная и позитивная бруцеллезная сыворотки в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме главного опыта);

- гемолитическая система в рабочей дозе без сыворотки, антигена и комплемента (0,6 мл гемсистемы и 0,6 мл физраствора);

- антиген без сыворотки и комплемента (0,2 мл антигена в рабочем разведении; 0,4 мл физраствора и 0,6 мл гемсистемы).

4.3.6. Учет результатов в РСК и РДСК

Реакцию связывания комплемента и реакцию длительного связывания комплемента учитывают визуально. При постановке реакции в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один раз - сразу после извлечения штативов из водяной бани. При исследовании в трех пробирках - через 3 - 4 ч, когда в контрольных пробах с позитивной бруцеллезной сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (в этом случае штативы с пробирками главного опыта оставляют в холодильнике).

Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная, осадок 100% эритроцитов на дне пробирки;

+++ (3 креста) - гемолиз 25% эритроцитов, осадок 75% эритроцитов;

++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов, осадок 50% эритроцитов;

+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов, осадок 25% эритроцитов;

- (минус) - гемолиз 100% эритроцитов, осадок эритроцитов отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Степень гемолиза эритроцитов при необходимости определяют по шкале, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом и жидкость из них сливают в одну.

Из этой жидкости готовят разведение с меньшим процентом гемолиза по следующей схеме:

Номера пробирок	1	2	3	4	5
Гемолизированная жидкость	1,0	0,75	0,5	0,25	-
Физиологический раствор	-	0,25	0,5	0,75	1,0
Процент гемолиза	100	75	50	25	0
Оценка в крестах	-	+	++	+++	++++

Процент гемолиза эритроцитов в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со шкалой и выражают в крестах.

4.3.7. Диагностическая оценка РСК и РДСК

Реакцию считают:

- положительной - при задержке гемолиза на 2 - 4 креста в одном или в двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);

- сомнительной - при задержке гемолиза с оценкой в один крест в одном или двух разведениях сыворотки и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);

- отрицательной - при полном гемолизе эритроцитов в двух (трех) пробирках.

В благополучных по бруцеллезу хозяйствах при получении сомнительного результата сыворотки крови этих животных исследуют повторно через 15 - 30 сут. Животных, сыворотки крови которых дали дважды сомнительную РСК (РДСК), считают реагирующими отрицательно.

В неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах при получении дважды сомнительного результата в РСК (РДСК) животных считают реагирующими положительно.

В благополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, ранее вакцинированного против бруцеллеза, животных, реагирующих положительно только в РСК (РДСК) в разведении сыворотки не выше 1:10, считают реагирующими сомнительно и проводят повторные исследования через 15 - 30 сут. При повышении титра заболевание считают установленным. В случае сохранения титра в РСК (РДСК) на прежнем уровне, животных считают здоровыми, а хозяйство - благополучным по данному заболеванию.

4.4. Постановка и учет реакции иммунодиффузии (РИД) с 0-полисахаридным антигеном

4.4.1. Реакция иммунодиффузии (РИД) с 0-полисахаридным антигеном (0-ПС антиген) основана на выявлении специфических антител, синтезирующихся в организме животных, инфицированных возбудителем бруцеллеза.

4.4.2. Применение РИД с 0-ПС антигеном при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота

4.4.2.1. В благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где противобруцеллезные вакцины не применяют:

- при плановых исследованиях одновременно с РА (РА и РИД);

- для исследования сыворотки крови животных, сомнительно реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);

- для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями.

4.4.2.2. В благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация животных агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами:

- при плановых исследованиях животных одновременно с РА (РА и РИД);

- при контроле эпизоотического состояния животных по бруцеллезу, но не ранее, чем через 1,5 мес. после вакцинации;

- для дифференциации реакций, полученных в РА (не выше 200 МЕ) или (и) РСК (РДСК) не выше, чем в разведении 1:10.

4.4.2.3. В неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах:

- через 1,5 мес. после иммунизации или очередной реиммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;

- для более полного выявления инфицированных животных, особенно среди телок и нетелей, целесообразно проведение 2 - 4-кратных исследований сыворотки крови животных в течение первых 6 месяцев после иммунизации (реиммунизации);

- через 6 месяцев после иммунизации (реиммунизации) животных для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе реакций, предусмотренных нормативными документами по профилактике и борьбе с бруцеллезом;

- при снятии с хозяйств ограничений по бруцеллезу одновременно с РА, РСК (РДСК) и другими реакциями, утвержденными в установленном порядке.

4.4.3. Применение РИД с 0-ПС антигеном при диагностике бруцеллеза северных оленей

4.4.3.1. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах, где противобруцеллезные вакцины не применяют:

- при плановых исследованиях одновременно с РА (РА и РИД);

- для исследования сыворотки крови животных, сомнительно реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);

- для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями.

4.4.3.2. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах, где животных иммунизируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:

- при плановых исследованиях одновременно с РА (РА и РИД) для оценки эпизоотического состояния по бруцеллезу не ранее чем через 2 мес. после иммунизации;

- для исследования сыворотки крови животных, сомнительно реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);

- для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями.

4.4.3.3. В неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах:

- с целью более раннего выявления больных бруцеллезом животных, но не ранее чем через 2 мес. после иммунизации против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами;

- при снятии ограничений с хозяйства одновременно с РА, РСК (РДСК) и другими реакциями, утвержденными в установленном порядке.

4.4.4. Применение РИД с 0-ПС антигеном при диагностике бруцеллеза овец и коз

4.4.4.1. В благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где противобруцеллезные вакцины не применяют:

- при плановых исследованиях одновременно с РА (РА и РИД);

- при исследовании сыворотки крови животных, сомнительно реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);

- для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями.

4.4.4.2. В благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация животных противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами:

- для дифференциальной диагностики бруцеллеза овец и коз не ранее чем через 5 мес., только после однократной их иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;

- для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями.

4.4.4.3. В неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах:

- с целью более раннего выявления больных бруцеллезом животных не ранее чем через 5 мес., только после однократной иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;

- при снятии ограничений с неблагополучных по бруцеллезу хозяйств одновременно с РА, РСК (РДСК) и другими реакциями, утвержденными в установленном порядке.

4.4.5. Компоненты реакции

4.4.5.1. Для постановки РИД применяется тест-система, основой которой является 0-ПС антиген.

4.4.5.2. В состав тест-системы входит:

- 0-ПС антиген;

- контрольная положительная сыворотка;

- хлорид натрия;

- микробиологический агар.

4.4.5.3. Подготовка тест-системы к постановке реакции. Приготовление 10% раствора хлорида натрия. Содержимое пакета с NaCl растворяют в 700 мл дистиллированной воды.

Приготовление 0,8%-ного раствора агара. Навеску агара переносят из флакона в колбу с 700 мл 10%-ного раствора хлорида натрия и помещают в кипящую водяную баню. После расплавления агара содержимое колбы фильтруют через ватный фильтр. Приготовленный агар можно хранить при температуре 2 - 8°С в течение 14 сут.

Приготовление геля для реакции иммунодиффузии. Отфильтрованный раствор агара расплавляют и разливают в чашки Петри, на поверхность стеклянных предметных стекол, стеклянных пластинок, помещенных на горизонтальный столик (в чашки Петри толщиной слоя не менее 2 мм); на предметное стекло - 2,5 мл; на стеклянную пластину размером 6 х 9 см - 12,5 мл. После застывания геля в нем штампом пробивают лунки: центральную диаметром 3 мм и по окружности 6 лунок диаметром по 5 мм. Агаровый гель из лунок удаляют с помощью вакуумного насоса или препаровальной иглы.

Для исследования используют сыворотки крови животных неконсервированные или консервированные (см. п. 2.3.1). Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки крови исследованию в РИД не подлежат.

4.4.5.4. Постановка реакции

Реакцию иммунодиффузии выполняют в чашках Петри или на стеклянных пластинках различных размеров, в зависимости от количества проб. Для исследования 5 - 35 проб используют чашки Петри; до 11 - предметные стекла; до 35 - пластинки размером 6 х 9 см; при большом количестве исследуемых проб можно использовать стекла большего размера.

В центральную лунку вносят 20 мкл 0-ПС антигена, а в периферические - по 40 мкл исследуемых сывороток крови.

На каждой пластинке (стекле) или чашке Петри ставят контроль с положительной сывороткой.

Стекла (чашки Петри) после внесения компонентов помещают во влажную камеру (эксикатор) при 18 - 24°С.

4.4.5.5. Учет результатов

Учет результатов проводят визуально в косом проходящем свете с помощью осветителя ОИ-19 или аналогичного через 24 и 48 ч после постановки реакции.

Линия преципитации между лунками с антигеном и исследуемой сывороткой, сформировавшаяся через 24 ч, свидетельствует о положительной реакции.

Сыворотки крови, давшие линию преципитации через 48 ч, подлежат перестановке.

Линия преципитации, сформировавшаяся через 24 или 48 ч при перестановке, свидетельствует о положительной реакции.

4.4.5.6. Оценка реакции

При получении положительной РИД животное признают больным бруцеллезом.

4.5. Постановка и учет результатов пластинчатой реакции агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (роз бенгал проба или РБП)

4.5.1. Пластинчатую реакцию агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (РБП) применяют как экспресс-метод диагностики бруцеллеза у не иммунизированного противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота, овец, коз, верблюдов, лошадей и северных оленей (маралов).

4.5.2. Компоненты РБП:

- испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

- антиген, окрашенный бенгальским розовым (роз бенгал антиген) (см. Прил. N 2, п. 6);

- позитивная бруцеллезная и негативная сыворотки;

- 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор (см. Прил. N 2, п. 1).

4.5.3. Постановка РБП

Для массовых диагностических исследований используют "Комплект инструментов и приспособлений для проведения серологических исследований на бруцеллез сыворотки крови животных" (КИ), выпускающийся отечественной промышленностью. В состав КИ входят:

- шприц-полуавтомат (капельница) для дозирования сыворотки;

- пипетка-капельница для дозирования антигена;

- ручной смеситель на 25 лунок диагностической пластины;

- аппарат для автоматического покачивания диагностических пластин.

Перед постановкой реакции антиген и исследуемые сыворотки выдерживают 30 - 40 мин. при комнатной температуре. Антиген гомогенизируют путем встряхивания.

Реакцию проводят на чистых сухих эмалированных диагностических пластинах с лунками при температуре не ниже 18°С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки.

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки при помощи шприца-полуавтомата (одна капля), микропипетки или дозатора. После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат (микропипетку) трижды промывают фенолизированным физиологическим раствором и кончик подсушивают фильтровальной бумагой. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов в каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки-капельницы для антигена из КИ или микропипетки вносят 0,03 мл (две капли) антигена, а при исследовании сывороток крови овец, коз и северных оленей (маралов) - 0,015 мл (одну каплю) антигена. Затем антиген в каждой лунке тщательно смешивают с сывороткой активными движениями ручного смесителя до получения однородной жидкости, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. После смешивания сывороток во всех лунках пластинки смеситель ополаскивают фенолизированным физиологическим раствором и просушивают марлевой салфеткой или фильтровальной бумагой.

Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин. осторожными вращательными движениями вручную или при помощи аппарата, предназначенного для этой цели. При положительной реакции в течение 4 мин. появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.

В начале работы ставят контроль антигена с негативной и позитивной бруцеллезной сыворотками в тех же дозах, а также антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 мл физиологического раствора добавляют 0,03 мл антигена).

4.5.4. Учет результатов реакции проводят визуально в течение 4 мин. после смешивания сывороток с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.

Реакцию считают положительной при наличии выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета, выделяющихся на белом фоне лунки.

Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена).

При нечетко выраженной агглютинации проводят повторное исследование данной сыворотки и по его результатам дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).

После учета реакции пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин. в 2,5 - 5%-ный раствор хлорамина, затем обрабатывают моющим средством, промывают водопроводной водой, высушивают на воздухе и используют повторно.

4.5.5. Диагностическая оценка РБП

В благополучных по бруцеллезу хозяйствах все сыворотки крови от животных, с которыми получена положительная РБП, в тот же или на другой день исследуют в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД.

Если при исследовании в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД будут получены отрицательные результаты, то у всех животных, давших положительную РБП, через 15 - 30 сут. вновь берут кровь и исследуют на бруцеллез в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД. При получении отрицательных результатов животных признают здоровыми и исследование на бруцеллез прекращают. В случае получения положительных или сомнительных результатов, их оценку проводят в соответствии с действующими санитарными и ветеринарными правилами.

В неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах при получении положительных результатов исследования в РБП сывороток крови овец, коз и северных оленей (маралов) животных признают больными бруцеллезом; сыворотки крови крупного рогатого скота, верблюдов и лошадей в тот же или на следующий день исследуют в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД. Животных, давших положительные результаты исследований, признают больными бруцеллезом. При получении сомнительных результатов таких животных повторно исследуют в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД через 15 - 30 сут. При получении положительных или сомнительных результатов в одной или двух реакциях их считают больными бруцеллезом.

4.6. Постановка и учет кольцевой реакции с молоком (КР)

4.6.1. Кольцевую реакцию с молоком применяют с целью определения благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота (буйволов) и для проверки молока при продаже его на рынках.

Исследование молока на бруцеллез в КР разрешается проводить в лабораториях или непосредственно в хозяйствах только ветеринарным врачам ветеринарных лабораторий, а также лабораторий ветеринарно-санитарной экспертизы, прошедшим специальную подготовку по постановке и учету данной реакции.

4.6.2. Компоненты реакции:

- исследуемое молоко (см. подпункт 2.3.2);

- антиген бруцеллезный для кольцевой реакции с молоком (см. Прил. N 2, п. 6);

- сыворотка бруцеллезная позитивная.

4.6.3. Постановка кольцевой реакции

Перед исследованием молоко тщательно перемешивают путем энергичного встряхивания для равномерного распределения сливок.

Реакцию ставят в серологических пробирках Флоринского, которые нумеруют в соответствии с описью проб молока. В пробирки вносят по 2 мл молока. После каждой пробы пипетку двукратно промывают теплой водой. Антиген вносят по 0,1 мл в каждую пробирку с пробой молока. После внесения антигена в каждые 10 проб штатив с пробирками энергично встряхивают для равномерного распределения препарата в молоке.

При постановке реакции в уленгутовских пробирках сначала в каждую вносят антиген по 0,05 мл, затем шприцем с иглой длиной 50 - 60 мм, нажимая на поршень слабыми толчками, вливают в них по 1 мл молока и тщательно смешивают его с антигеном. После каждой пробы молока шприц двукратно промывают теплой водой.

При постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами молока ставят следующие контрольные пробы:

- молоко от заведомо здоровой коровы (буйволицы);

- смесь молока здоровой коровы (буйволицы) с позитивной бруцеллезной сывороткой (0,1 мл сыворотки на 2 мл молока).

Штативы с испытуемыми и контрольными пробами молока помещают в термостат или водяную баню при температуре 37 - 38°С на 1 ч и затем выдерживают 30 мин. при комнатной температуре.

4.6.4. Учет и оценка результатов кольцевой реакции

Результаты реакции учитывают визуально через 30 - 40 мин. после извлечения штативов из водяной бани (термостата) в крестах по следующей схеме:

+++ (3 креста) - четко выраженное синее (красно-вишневое) кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;

++ (2 креста) - четко выраженное синее (красно-вишневое) кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый или бледно-розовый цвет;

+ (1 крест) - синее (красно-вишневое) кольцо в слое сливок выражено слабо и весь столбик молока имеет синий (розовый) цвет;

- (минус) - столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий (красно-вишневый) цвет, который был получен сразу после смешивания с антигеном, а слой сливок - белого или слегка желтоватого цвета.

Все пробы молока, давшие кольцевую реакцию с оценкой 3 и 2 креста, считают положительными, 1 крест - сомнительными.

При получении отрицательных результатов КР по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.

При получении положительного или сомнительного результата КР берут кровь от всех животных данного стада (группы, населенного пункта) для исследования на бруцеллез в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД, проводят эпизоотологическое обследование хозяйства, клинический осмотр животных и исследование на заболевание маститами.

Отрицательный результат исследования сывороток крови в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД у всех животных свидетельствует об их благополучии по бруцеллезу, независимо от результатов, полученных в КР.

При получении положительных результатов исследования сыворотки крови на бруцеллез с животными стада поступают в соответствии с действующими санитарными и ветеринарными правилами. При этом изолируют также и животных, выделенных при исследовании молока в КР, если эта реакция не была связана с другими заболеваниями животных.

5. Молекулярно-генетическая диагностика бруцеллеза

5.1. Тест-система предназначена для выявления ДНК бактерий рода Brucella (B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. ovis, B. canis) в биологическом материале от животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, в случае аборта или проявления у них других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты), вызывающих подозрение на бруцеллез, и (или) при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования.

ПЦР-анализ состоит из 3-х этапов: выделение ДНК из исследуемого материала; собственно полимеразная цепная реакция (ПЦР) - амплификация специфического участка ДНК бруцелл; электрофоретический анализ продуктов ПЦР и учет результатов ПЦР-анализа. Амплификация специфического участка ДНК происходит за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Так-полимеразы.

В данной тест-системе используется внутренний контрольный образец (ВКО Brucella sp.), позволяющий контролировать эффективность ПЦР-анализа для каждой исследуемой пробы. ВКО представляет собой фрагмент ДНК фага лямбда.

В состав тест-системы, рассчитанной на проведение 100 анализов, входят:

- набор для выделения ДНК (набор "ДНК-сорб-В");

- набор для проведения ПНР (набор "АмплиСенс-100");

- набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР (набор "ЭФ-200");

- набор контрольных образцов (может быть вложен в набор "Ампли-Сенс-100").

5.1.1. Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:

Лизирующий раствор	1 флакон, 30,0 мл
Раствор для отмывки 1	1 флакон, 30,0 мл
Раствор для отмывки 2	1 флакон, 100,0 мл
Суспензия сорбента	2 пробирки по 1,25 мл
ТЕ-буфер для элюции ДНК	2 пробирки по 5,0 мл.

5.1.2. Набор для проведения ПЦР состоит из следующих компонентов:

ПЦР-смесь-1 "Brucella sp."	1 пробирка, 0,55 мл
ПЦР-смесь-2	1 пробирка, 1,2 мл
Воск для ПЦР	1 пробирка, 1,7 мл
Масло минеральное	1 пробирка, 4,0 мл.

5.1.3. Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР состоит из следующих компонентов:

Концентрат ТБЕ-буфера с бромидом этидия	1 флакон, 50,0 мл
Агароза для электрофореза	2 пробирки по 1,8 г.

5.1.4. Набор контрольных образцов состоит из следующих компонентов:

Положительный контрольный образец (ПКО)
ДНК Brucella abortus	1 пробирка, 0,1 мл
ДНК-буфер для разведения и хранения ДНК	1 пробирка, 1,0 мл
Внутренний контрольный образец (ВКО)	1 пробирка, 1,0 мл
Brucella sp.
Отрицательный контрольный образец (ОКО)	1 пробирка, 1,6 мл.

Допускается другая фасовка компонентов, согласованная в установленном порядке.

5