Методические указания МУК 4.2.3529-18 "Метод микробиологического измерения концентрации Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) Н150 ВКПМ В-12692 в атмосферном воздухе населенных мест" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 1 февраля 2018 г.)

Методические указания МУК 4.2.3529-18
"Метод микробиологического измерения концентрации Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) Н150 ВКПМ В-12692 в атмосферном воздухе населенных мест"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 1 февраля 2018 г.)

1. Назначение и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) Н150 ВКПМ В-12692 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 5 до 50 000 клеток в 1 воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Биологическая характеристика штамма Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) Н150 ВКПМ В-12692 и его гигиенический норматив в атмосферном воздухе населенных мест

Штамм Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) Н150 происходит от одноименного штамма ВКПМ В-12504, продуцент лизина, не является генетически-инженерно-модифицированным штаммом.

Corynebacterium относятся к роду бактерий и порядку Actinomycetales. Виды этого рода являются граммположительными аэробными микроорганизмами и представлены неподвижными овальными или слегка удлиненными палочками, которые не образуют спор.

Штамм растет на средах, обогащенных углеводами: МПА, L-среда, 2LB-среда с мальтозой (20,0 г/л). Колонии интенсивно желтого цвета округлой формы, приподняты над поверхностью, края колоний ровные, консистенция нетягучая, клетки легко отделяются друг от друга. Оптимальная температура - 30°С, время выращивания - 1-2 сут.

Депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика под номером ВКПМ В-12692.

Штамм Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) Н150 ВКПМ В-12692 не является фито- и зоопатогенным, а также не входит в состав 4 групп патогенности в соответствии с Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами" в редакции Дополнений и изменений 2, утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.06.2011 N 86.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 5 000 .

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 5 до 50 000 клеток в 1 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из атмосферного воздуха населенных мест клеток и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений

Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5-790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности мм рт. ст.	ТУ 2504-1799-75
Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности мг	ГОСТ Р 53228-08
Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10	ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50	ГОСТ 1770
Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0-55°С	ТУ 25-2021.003-88
Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха

Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру	ТУ 9452-010-00141798-02
Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру и	ТУ 9452-002-00141798-97
Автоклав электрический	ГОСТ 9586-75
Стерилизаторы паровые медицинские	ГОСТР ЕН 13060-11 ГОСТ Р 51935-02
Дистиллятор	ТУ 4952-007-33142130-2000
Облучатель бактерицидный настенный	ТУ 9444-015-03965956-08
Холодильник бытовой	ГОСТ 26678-85
Микроскоп биологический с иммерсионной системой
Лупа с увеличением х10	ГОСТ 25706-83
Пробирки типов П1, П2	ГОСТ 25336-82
Спиртовки лабораторные стеклянные	ГОСТ 23932-90
Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов	ГОСТ 23932-90
Воронки конусные диаметром 40-45 мм	ГОСТ 25336-82
Груша резиновая	ТУ 9398-005-0576-9082-03
Петля бактериологическая
Марля медицинская	ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая	ГОСТ 25556-81
Бумага фильтровальная лабораторная	ГОСТ 12026-76

Примечание. Допускается использование другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды

Агар микробиологический	ГОСТ 17206-96
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-90
Дрожжевой экстракт, сухой	ГОСТ 17206-84
Натрий хлористый	ГОСТ 4233-77
Патока мальтозная	ГОСТ 55316-12
Спирт этиловый технический	ГОСТ 17299-78
Спирт этиловый ректификованный	ГОСТ Р 51652-2000 или ГОСТ 18300-87
Триптон

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток бактерий в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующие требования.

6.1. Санитарные правила "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней", СП 1.3.2322-08.

6.2. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2518-09.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.4. Требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

- температура, воздуха	;
- атмосферное давление	мм рт. ст.;
- влажность воздуха	не более 80%.

9. Приготовление 2LВ-среды

Для приготовления среды 2LВ используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1 000 ); триптон - 20,0 г; 50%-я патока мальтозная - 20,0 г; дрожжевой экстракт - 10,0 г; агар-агар - 15,0 г; натрий хлористый - 10,0 г; дистиллированная вода - 1 000 .

Сухие компоненты растворяют в 1 000 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250-500 и автоклавируют при 121°С в течение 15 мин.

Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8°С в течение 10 дней не более. Раствор мальтозы 50%-й готовится и стерилизуется отдельно. При разливе среды в чашки Петри добавляется из расчета 40 мл/л 50%-я мальтоза.

10. Проведение измерения

10.1. Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованиую среду (2LВ) расплавляют, остужают до 50-60°С и разливают в чашки Петри. Затем добавляют из расчета 40 мл/л стерилизованный 50%-й раствор мальтозы.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37°С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре 2-8°С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой . Через 1-3 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) Н150 ВКПМ В-12692 высевается на 2-3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2-3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток проводят по формуле:

К = (П х 1000) / С х Т , где

К - концентрация штамма в воздухе, ;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1 000 - коэффициент пересчета на 1 воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т - время аспирации, мин.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по следующей форме:

Протокол N
количественного микробиологического анализа штамма Corynebacterium glutamicum Н150 ВКПМ В-12692 в атмосферном воздухе населенных мест

1. Дата проведения анализа _____________________________________________

2. Рабочее место (профессия работающего) ________________________________

3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) ____________________________________

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

3. Вид пробоотборника _________________________________________________

4. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ______

5. Питательная среда, время инкубации ____________________________________

6. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ________________

7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) ___________________________________________________________

8. Результаты идентификации микроорганизмов Corynebacterium glutamicum Н150 ВКПМ В-12692 (морфологические признаки) ______________________________________

9. Результаты расчёта концентрации штамма _______________________________

10. Соотношение полученных результатов с уровнем ___________________

11. Отбор пробы проведён (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________________

12. Идентификация штамма и расчёт концентрации проведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись) ______________________________________________________________

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова