Межгосударственный стандарт ГОСТ 34410-2018 "Продукция соковая. Определение D-изолимонной кислоты ферментативным методом" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июня 2018 г. N 366-ст)

Juice products. Determination of D-isocitric acid content by enzymatic method

МКС 67.080.01

Дата введения - 1 июля 2019 г.
Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Разработан Всероссийским научно-исследовательским институтом технологии консервирования - филиалом Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова" РАН (ВНИИТеК - филиал ФГБНУ "ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова" РАН) при участии Общества с ограниченной ответственностью "Компания Стайлаб" (ООО "Компания Стайлаб")

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 мая 2018 г. N 109-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ISO 3166) 004-97	Код страны по МК (ISO 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Россия	RU	Росстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июня 2018 г. N 366-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34410-2018 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2019 г.

5 В настоящем стандарте учтены основные нормативные положения европейского стандарта EN 1139:1994 "Соки фруктовые и овощные. Определение содержания D-изолимонной кислоты спектрометрическим методом с применением NADPH" ("Method for determination of D-isocitric acid content of fruit and vegetable juices. NADPH spectrometric method", NEQ)

6 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на фруктовые и овощные соки, в том числе концентрированные, нектары, сокосодержащие напитки, пюре и концентрированные пюре, морсы и концентрированные морсы (далее - соковая продукция) и устанавливает метод определения (измерения) массовой концентрации D-изолимонной кислоты в виде свободной кислоты или ее соли, включая эфиры и лактоны.

Диапазон измерений массовой концентрации D-изолимонной кислоты от 0,01 до 0,5 г/дм³ включительно.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.0.004-2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-2017* Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

------------------------------

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 12.4.103-83 Система стандартов безопасности труда. Одежда специальная защитная, средства индивидуальной защиты ног и рук. Классификация

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ ISO 2173-2013 Продукты переработки фруктов и овощей. Рефрактометрический метод определения растворимых сухих веществ

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ ISO 3696-2013* Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля

ГОСТ 3760-79 Реактивы. Аммиак водный. Технические условия

ГОСТ 4108-72 Реактивы. Барий хлорид 2-водный. Технические условия

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-2-2003** Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ ИСО 5725-6-2003*** Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

------------------------------

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

** В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002.

*** В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

ГОСТ 10652-73 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-2014 Продукты переработки фруктов и овощей. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 26671-2014 Продукты переработки фруктов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов

ГОСТ 28311-89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 33276-2015 Продукция соковая. Методы определения относительной плотности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины, определения, обозначения и сокращения

3.1 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1 массовая концентрация D-изолимонной кислоты: Содержание D-изолимонной кислоты и ее солей, включая эфиры и лактоны (в пересчете на D-изолимонную кислоту), определенное в соответствии с методом, установленным настоящим стандартом.

3.1.2 стандартная единица активности фермента (Е): Количество фермента, которое является катализатором превращения (образования) 1 мкмоль вещества в минуту при температуре 25 °С.

3.2 Обозначения и сокращения

В настоящем стандарте применены следующие обозначения и сокращения:

ИЦДГ - изоцитратдегидрогеназа, ЕС 1.1.1.42 [1];

НАД (NAD) - никотинамидадениндинуклеотид, окисленная форма;

НАДН (NADH) - никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма;

CAS - уникальный числовой идентификатор химических соединений*.

------------------------------

* По реестру Химической реферативной службы (Chemical Abstracts Service).

4 Сущность метода

Метод основан на осаждении D-изолимонной кислоты в виде соли бария, с последующим перерастворением, и прямом ферментативном декарбоксилировании иона изоцитрата под действием НАД в присутствии фермента ИЦДГ, с последующим фотометрическим измерением количества образовавшегося НАДН, эквивалентного количеству D-изолимонной кислоты.

5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

Весы неавтоматического действия специального (I) класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания  0,001 г.

Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения при длине волны 340 нм с пределами допускаемой абсолютной погрешности измерений коэффициента пропускания не более 1 %, или спектрофотометр, оснащенный ртутной лампой, позволяющий проводить измерения при длинах волн 365 или 334 нм.

Кюветы из оптического стекла или полимерные с длиной оптического пути 10 мм для проведения фотометрических измерений в интервале длин волн от 334 до 365 нм.

Иономер или рН-метр в комплекте с комбинированным микроэлектродом для измерений в растворах объемом не менее 2 см³, с погрешностью измерений не более 0,05 ед. рН.

Дозаторы медицинские лабораторные объемом дозирования 1, 0,2 и 0,02 см³, по ГОСТ 28311.

Баня водяная лабораторная.

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая фактор разделения не менее 1000 g, с ротором и соответствующим адаптером для пробирок.

Мешалка магнитная с угловой скоростью вращения от 400 до 1200 мин^-1.

Секундомер механический или электронный.

Посуда мерная лабораторная стеклянная 2-го класса точности по ГОСТ 1770:

- цилиндры 1-100-2, 1-500-2;

- колбы мерные с пластмассовой пробкой 2а-50-2, 2а-100-2 и 2а-1000-2.

Посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336:

- воронки лабораторные;

- стаканы вместимостью В-1-100, В-1-500;

- колбы конические Кн-3-250-34.

Фильтры мембранные с размером пор 0,45 мкм, диаметром 13 или 47 мм.

Фильтры бумажные.

Шпатели пластиковые или палочки стеклянные оплавленные длиной от 2 до 5 см для перемешивания содержимого кюветы.

Пробирки центрифужные из полимерного материала вместимостью 15, 50 и 100 см³ с завинчивающимися крышками.

Набор реагентов, включающий*:

- реактив 1 - флакон, содержащий буферный раствор на основе имидазола, рН 7,1;

- реактив 2 - флакон, содержащий лиофилизат НАД и сульфат марганца;

- реактив 3 - флакон, содержащий лиофилизат ИЦДГ, активностью 5 Е;

- реактив 4 - контрольный раствор D-изолимонной кислоты.

------------------------------

* Например, готовые к применению наборы для определения D-изолимонной кислоты фирмы R-Biopharm AG, каталожный номер 10414433035. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность применения наборов других фирм или растворов, приготовленных в лаборатории из отдельных реактивов.

Поливинилполипирролидон (ПВПП) низкомолекулярный или полиамид (ПА).

Аммиак водный по ГОСТ 3760, ч. д. а., раствор массовой долей 25 %.

Ацетон по ГОСТ 2603, ч. д. а.

Барий хлорид 2-водный по ГОСТ 4108, х. ч.

Гидроокись натрия по ГОСТ 4328, ч. д. а.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х. ч.

Натрий сернокислый по ГОСТ 4166, ч. д. а.

Трис-(гидроксиметил)-аминометан, массовой долей основного вещества не менее 98 %.

Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль 2-водная по ГОСТ 10652, ч. д. а.

Вода для лабораторного анализа по ГОСТ ISO 3696, не ниже 2-й степени чистоты.

Уголь активированный, специально подготовленный*.

------------------------------

* Например, каталожный номер 102186, Merck. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность применения других марок.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам, а также посуды, материалов и реактивов, по качеству не ниже вышеуказанных.

6 Отбор и подготовка проб

6.1 Отбор проб - по ГОСТ 26313, подготовка проб - по ГОСТ 26671.

6.2 Продукты со стабильной мутной взвесью перед разбавлением тщательно перемешивают и центрифугируют при скорости вращения 4000 мин^-1 в течение 10 мин и фильтруют через бумажный или мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

6.3 Окрашенную соковую продукцию обесцвечивают путем добавления ПА или ПВПП. В центрифужную пробирку вместимостью 15 или 50 см³ к 10 см³ пробы добавляют около 0,1 г ПА или 0,1 г ПВПП, затем интенсивно встряхивают в пробирке в течение 1 мин, центрифугируют при скорости вращения 4000 мин^-1 в течение 10 мин и фильтруют через бумажный или мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Для определения используют прозрачный фильтрат.

6.4 Концентрированную соковую продукцию разбавляют водой до заданного значения массовой доли растворимых сухих веществ в соответствии с [2] (приложение 2). Массовую долю растворимых сухих веществ определяют по ГОСТ ISO 2173 или ГОСТ 33276.

7 Условия проведения измерений

При подготовке к проведению измерений и при проведении измерений соблюдают следующие условия:

- температура окружающего воздуха ... (20  5) °С;

- атмосферное давление ... (97  10) кПа;

- относительная влажность ... не более 75 %;

- напряжение в питающей сети ... (220  20) В;

- частота тока в питающей сети ... (50  1) Гц.

В помещениях, предназначенных для проведения измерений, не допускается загрязненность воздуха рабочей зоны пылью, агрессивными веществами, должны отсутствовать факторы, влияющие на измерения массы и объема.

8 Подготовка к проведению определений

8.1 Подготовка растворов реактивов из готового набора

Приготовление растворов реактивов проводят в соответствии с инструкцией, прилагаемой к набору.

8.2 Подготовка растворов реактивов для осаждения и определения общего содержания D-изолимонной кислоты

8.2.1 Приготовление раствора хлорида бария массовой концентрации 300 г/дм³

Взвешивают 30,0 г 2-водного хлорида бария в стакане вместимостью 500 см³, растворяют в небольшом количестве воды и переносят, ополаскивая стенки стакана, в мерную колбу вместимостью, 100 см³, доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Раствор устойчив при комнатной температуре в течение одного года.

8.2.2 Приготовление раствора сернокислого натрия массовой концентрации 71 г/дм³

Взвешивают 71,0 г сернокислого натрия в стакане вместимостью 500 см³, растворяют в небольшом количестве воды и переносят, ополаскивая стенки стакана, в мерную колбу вместимостью 1000 см³, доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Раствор устойчив при комнатной температуре в течение одного года.

8.2.3 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 1 моль/дм³

Мерным цилиндром вместимостью 100 см³ осторожно переносят 90,0 см³ концентрированной соляной кислоты в мерную колбу вместимостью 1000 см³, в которую добавлено небольшое количество воды, содержимое колбы после охлаждения доводят до метки водой, тщательно перемешивают.

Раствор устойчив при комнатной температуре в течение одного года.

8.2.4 Приготовление буферного раствора 7,4 ед. рН

Взвешивают 2,42 г трис-(гидроксиметил)-аминометана и 35 мг динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, растворяют в стакане вместимостью 100 см³ в 80 см³ воды, доводят добавляя по каплям раствор соляной кислоты до 7,4 ед. рН, регистрируя показания рН-метра, переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки водой, тщательно перемешивают.

Буферный раствор устойчив при температуре 4 °С в течение одного года.

8.2.5 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 4 моль/дм³

Мерным цилиндром вместимостью 500 см³ осторожно переносят 360,0 см³ концентрированной соляной кислоты в мерную колбу вместимостью 1000 см³, в которую добавлено небольшое количество воды, содержимое колбы после охлаждения доводят до метки водой, тщательно перемешивают.

Раствор устойчив при комнатной температуре в течение одного года.

8.2.6 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 4 моль/дм³

Взвешивают 16,0 г гидроокиси натрия в стакане вместимостью 100 см³, растворяют при постоянном перемешивании в небольшом количестве воды и переносят, ополаскивая стенки стакана в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Раствор хранят в емкости из полимерного материала при комнатной температуре не более 2 мес.

9 Порядок проведения измерений

9.1 Осаждение D-изолимонной кислоты из пробы соковой продукции

В пробирке для центрифугирования вместимостью 100 см³ смешивают 10 см³ пробы соковой продукции с 5 см³ раствора гидроокиси натрия (см. 8.2.6) и выдерживают в течение 10 мин при комнатной температуре. Последовательно добавляют 5 см³ раствора соляной кислоты (см. 8.2.5), 2 см³ раствора аммиака массовой долей 25 %, 3 см³ раствора хлорида бария (см. 8.2.1) и 20 см³ ацетона, тщательно перемешивают стеклянной палочкой.

Примечание - Для соковой продукции с высокой кислотностью (грейпфрут, апельсин и т.п.) объем раствора аммиака увеличивают до 2,5 см³ или предварительно нейтрализуют пробу раствором гидроокиси натрия (см. 8.2.6).

Полученный раствор выдерживают в течение 10 мин, затем центрифугируют в течение 5 мин. Супернатант осторожно декантируют, а осадок в стакане для центрифугирования растворяют в 20 см³ раствора сернокислого натрия (см. 8.2.2), перемешивая содержимое центрифужной пробирки стеклянной палочкой. Для ускорения растворения осадка стакан помещают на кипящую водяную баню и выдерживают в течение 10 мин, периодически перемешивая. После охлаждения до комнатной температуры раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³ и доводят буферным раствором (см. 8.2.4) до метки, тщательно перемешивают.

Затем переносят раствор из мерной колбы в коническую вместимостью 250 см³, в которую предварительно добавлен 1 г активированного угля, перемешивают, выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре и фильтруют через складчатый бумажный фильтр.

Прозрачный бесцветный фильтрат используют для ферментативного определения по 9.3.

9.2 Приготовление раствора пробы

Для обеспечения достоверности результатов определения количество D-изолимонной кислоты в кювете должно быть от 3 до 100 мкг для измерений при 365 нм (или от 2 до 50 мкг - для измерений при 334 и 340 нм). Для достижения этого условия фильтрат разбавляют водой в соответствии с требованиями, указанными в таблице 1 или в соответствии с инструкцией к набору реагентов.

Таблица 1

Ожидаемая массовая концентрация в пробе, г/дм3, при измерениях на длинах волн		Разбавление водой	Фактор разбавления (F)
340 нм или 334 нм	365 нм
До 0,5 включ.	До 1,0 включ.	Не разбавляется	1
Св. 0,5 " 5,0 "	Св. 1,0 " 10,0 "	1 + 9	10
" 5,0 "	" 10,0 "	1 + 99	100

Если массовая концентрация D-изолимонной кислоты в фильтрате менее 0,02 г/дм³, то ее объем, вносимый в кювету, может быть увеличен до 2,00 см³. В этом случае следует снизить на соответствующую величину объем воды, добавляемой в кювету, для поддержания на постоянном уровне общего объема инкубационной смеси в кювете.

При высоких значениях начальной оптической плотности (более 1,000) готовят новый раствор, увеличивая разбавление, как указано в таблице 1. Рекомендуется также уменьшить объем раствора фильтрата в кювете, компенсируя снижение общего объема в кювете увеличением объема воды.

При вычислении массовой концентрации D-изолимонной кислоты необходимо учесть измененный объем раствора фильтрата в формуле (2).

9.3 Ферментативная реакция и количественное определение D-изолимонной кислоты

Проводят два параллельных определения в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-1 (подраздел 3.14).

В кювету вносят реактивы 1-3 (см. раздел 5), воду и раствор пробы, приготовленной по 9.2, в соответствии с требованиями, указанными в таблице 2 или в соответствии с инструкцией к набору реагентов.

Таблица 2 - Порядок добавления реагентов для проведения измерений

Наименование растворов, дозируемых в кювету, и последовательность их дозирования	Объем, вносимый в кюветы, см3
	Холостой раствор (контроль)	Раствор пробы
Реактив 1 + ре