Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 58614-2019 "Продукция пищевая специализированная. Определение фумонизинов В1 и В2 в пищевой продукции для питания детей раннего возраста на основе кукурузы. Метод ВЭЖХ после очистки на иммуноаффинной колонке с предколоночной дериватизацией с флуориметрическим детектированием" (утв. и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2019 г. N 844-ст)

Foods for special dietary uses. Determination of fumonisins B₁ and B₂ in corn based products for infant and young children. Method HPLC after immunoaffinity cleanup with pre-column derivatization and fluorescence detection

ОКС 67.050

Дата введения - 1 апреля 2020 г.
Введен впервые

Предисловие

1 Разработан Федеральным государственным унитарным предприятием "Российский научно-технический центр информации по стандартизации, метрологии и оценке соответствия" (ФГУП "СТАНДАРТИНФОРМ")

2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 036 "Продукция специализированная пищевая"

3 Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2019 г. N 844-ст

4 Настоящий стандарт разработан с учетом основных нормативных положений стандарта DIN EN 16187-2015 "Продукты пищевые. Определение фумонозинов В₁ и В₂ в пищевой продукции для детей раннего возраста, содержащей продукты переработки кукурузы. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с предколоночной дериватизацией с флуоресцентным детектированием после очистки на иммуноаффинной колонке" (DIN EN 16187-2015 "Foodstuffs - Determination of fumonisin B₁ and fumonisin B₂ in foods containing processed maize for infants and young children - HPLC method with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection after pre-column derivatization", NEQ)

5 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения фумонизинов В₁ (ФВ₁) и В₂ (ФВ₂) в продукции детского питания для детей раннего возраста на основе кукурузы. С этой целью используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с предварительной очисткой на иммуноаффинной колонке с флуориметрическим детектированием (ФЛД) после предколоночной дериватизациии. Этот метод валидирован в ходе межлабораторных испытаний путем исследования естественно и искусственно загрязненных проб с содержанием ФВ₁ и ФВ₂ от 112 до 458 мкг/кг, содержанием ФВ₁ от 89 до 384 мкг/кг и содержанием ФВ₂ от 22 мкг/кг до 74 мкг/кг.

Дополнительная информация о валидации приведена в разделе 8 и в приложении А.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4517 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе

ГОСТ 4919.2 Реактивы и особо чистые вещества. Методы приготовления буферных растворов

ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 6995 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 12026 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 33303 Продукты пищевые. Методы отбора проб для определения микотоксинов

ГОСТ ISO 7886-1 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования

ГОСТ EN 13585 Продукты пищевые. Определение фумонизинов В₁ и В₂ в кукурузе. Метод ВЭЖХ с применением очистки экстракта методом твердофазной экстракции

ГОСТ EN 14352 Продукты пищевые. Определение фумонизинов В₁ и В₂ в продуктах на основе кукурузы. Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта

ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 52501 Вода для лабораторного анализа. Технические условия

ГОСТ Р ИСО 5725-1 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-2 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Краткое описание

Фумонизины экстрагируют из пробы смесью цитратно-фосфатного буферного раствора, метанола и ацетонитрила. Отфильтрованный экстракт разбавляют водой и пропускают через иммуноаффинную колонку, содержащую специфические антитела к фумонизинам. Фумонизины элюируют с колонки метанолом и водой и определяют их количество с помощью ВЭЖХ с ФЛД с предварительной дериватизацией с помощью реагента ортофталевого диальдегида (ОФА).

4 Реактивы

Если не указано иное, используют только химические чистые реактивы, например по ГОСТ 4919.2, для анализа (ч. д. а) и воду степени чистоты 1 в соответствии с ГОСТ Р 52501. Кроме того, чистота растворителей должна быть не ниже степени чистоты для ВЭЖХ. Можно использовать имеющиеся на рынке растворы, свойства которых эквивалентны вышеуказанным.

ВНИМАНИЕ! Утилизация отходов растворителя должна быть произведена в соответствии с действующими законами в области защиты окружающей среды и нормативными актами об охране окружающей среды.

4.1 Ацетонитрил.

ВНИМАНИЕ! Ацетонитрил является опасным веществом. Пробы, отобранные в соответствии с ГОСТ 33303, взбалтывают с помощью орбитального шейкера в вытяжном шкафу. После взбалтывания пробы должны быть отфильтрованы в вытяжном шкафу.

4.2 Метанол.

4.3 Ортофталевый диальдегид (ОФА).

4.4 Раствор лимонной кислоты, молярная концентрация с (С₆Н₈O₇   Н₂O) = 100 моль/м³.

21,0 г С₆Н₈O₇  Н₂O растворяют в воде по ГОСТ 6709 и разбавляют водой до объема 1 дм³.

4.5 Раствор натрия фосфорнокислого двухзамещенного с (Na₂HPO₄) = 200 моль/м³.

28,4 г Na₂HPO₄ растворяют в воде и разбавляют водой до объема 1 дм³.

4.6 2-меркаптоэтанол.

4.7 Раствор цитратно-фосфатный буферный.

Один объем раствора лимонной кислоты (4.4) смешивают с одним объемом раствора натрия фосфорнокислого двухзамещенного (4.5).

4.8 Экстрагент.

Два объема цитрат-фосфатного буферного раствора (4.7) смешивают с одним объемом метанола по ГОСТ 6995 (4.2) и одним объемом ацетонитрила (4.1).

4.9 Кислота ледяная уксусная.

4.10 Фосфатно-хлоридный буфер (PBS), с (NaCl) = 137 моль/м³, с (KCl) = 2,7 моль/м³, с (фосфатный буфер) = 10 моль/м³, рН = 7,4 при Т = 25 °С.

Одну таблетку из имеющихся на рынке веществ PBS растворяют в 200 см³ воды.

4.11 Смесь А, состоящая из ацетонитрила и воды.

Один объем ацетонитрила (4.1) смешивают с одним объемом воды. Этот растворитель используют для приготовления растворов по ГОСТ 4517 для доведения до необходимого объема.

4.12 Смесь В, состоящая из ацетонитрила и воды.

Три объема ацетонитрила (4.1) смешивают с семью объемами воды. Этот растворитель используют для приготовления градуировочных растворов и для повторного разведения высушенных экстрактов после очистки на иммуноаффинной колонке.

4.13 Раствор натрия тетраборнокислого с (Na₂B₄O₇  10Н₂О) = 100 моль/м³.

3,8 г Na₂B₄O₇  10Н₂О растворяют в 100 см³ воды.

4.14 Раствор ОФА-реагента.

40 мг ОФА (4.3) растворяют в 1 см³ метанола (4.2) и разбавляют 5 см³ раствора тетрабората натрия (4.13). Добавляют 50 мм³ 2-меркаптоэтанола (4.6) и перемешивают в течение 1 мин. Этот раствор реактива остается стабильным при комнатной температуре без доступа света в закрытом флаконе из темного стекла в течение 1 нед.

4.15 Подвижная фаза для ВЭЖХ.

4.15.1 Подвижная фаза А для ВЭЖХ.

30 объемов ацетонитрила (4.1) смешивают с 69 объемами воды и одним объемом ледяной уксусной кислоты (4.9).

4.15.2 Подвижная фаза В для ВЭЖХ.

60 объемов ацетонитрила (4.1) смешивают с 39 объемами воды и одним объемом ледяной уксусной кислоты (4.9).

4.16 Колонка иммуноаффинная.

Иммуноаффинная колонка должна содержать антитела к ФВ₁ и ФВ₂. Общая сорбционная емкость колонки по отношению к фумонизинам должна составлять не менее 5 мкг; полнота извлечения должна быть не менее 80 % для суммы ФВ₁ и ФВ₂, если будет наноситься стандартный раствор, содержащий по 5 мкг каждого из фумонизинов в PBS. Перед использованием колонки должны быть нагреты до комнатной температуры. С помощью этих колонок достигается рабочий диапазон метода на уровне 5000 мкг/кг суммарного количества фумонизинов. В случае использования колонок с сорбционной емкостью менее 5 мкг фумонизинов, уменьшается и рабочий диапазон данного метода.

4.17 Сертифицированный стандартный раствор фумонизина В₁ (ФВ₁), растворенный в смеси из одной объемной части ацетонитрила и одной объемной части воды, с массовой концентрацией р (ФВ₁) = 50 мкг/см³ (например, Biopure RK 002003 или аналогичный раствор).

4.18 Сертифицированный стандартный раствор фумонизина В₂ (ФВ₂), растворенный в смеси из одной объемной части ацетонитрила и одной объемной части воды, с массовой концентрацией р (ФВ₂) = 50 мкг/см³ (например, Biopure RK 002004 или аналогичный раствор).

ВНИМАНИЕ! Фумонизины являются нефротоксическими, гепатотоксическими и канцерогенными соединениями для крыс и мышей и считаются Международным агентством по изучению рака (IARC) потенциально канцерогенными для человека. С этими препаратами следует обращаться с особой осторожностью. Перчатки и защитные очки следует использовать в течение всех исследований, и все этапы подготовки стандартных растворов и растворов проб должны быть выполнены в вытяжном шкафу в соответствии с ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007, ГОСТ 12.4.021.

4.19 Основной раствор смеси ФВ₁ и ФВ₂.

Приготавливают основной раствор смеси из ФВ₁ и ФВ₂, отмеряя пипеткой по ГОСТ 29227 2000 мм³ сертифицированного стандартного раствора ФВ₁ (4.17) и 500 мм³ сертифицированного стандартного раствора ФВ₂ (4.18) в стеклянный флакон. Флакон закрывают и тщательно встряхивают, получая основной раствор, содержащий 40,0 мкг/см³ ФВ₁ и 10,0 мкг/см³ ФВ₂.

4.20 Разбавленный основной раствор смеси ФВ₁ и ФВ₂.

500 мкл основного раствора смеси (4.19) отмеряют пипеткой в градуированную мерную колбу вместимостью 10 см³. Доводят раствор до метки смесью В, состоящей из ацетонитрила и воды (4.12), и тщательно встряхивают, для того чтобы получить разбавленный основной раствор, содержащий 2,0 мкг/см³ ФВ₁ и 0,5 мкг/см³ ФВ₂. Полученный раствор хранят при температуре ниже 4 °С, и он остается стабильным при таких условиях не менее 6 мес.

4.21 Растворы градуировочные смеси фумонизинов для ВЭЖХ.

Пять градуировочных растворов смеси фумонизинов для ВЭЖХ готовят в градуированных мерных колбах по ГОСТ 1770 вместимостью 5 мл путем дальнейшего разведения разбавленного основного раствора фумонизинов ФВ (4.20) в соответствии с таблицей 1. Каждый градуировочный раствор доводят до метки 5 см³ смесью В, состоящей из ацетонитрила и воды (4.12), и тщательно перемешивают. Данный раствор хранят при температуре ниже 4 °С, и он остается стабильным в таких условиях не менее 6 мес.

Таблица 1 - Приготовление градуировочных растворов смеси фумонизинов для ВЭЖХ

Градуировочный раствор для ВЭЖХ	Разбавленный основной раствор смеси ФВ (4.20) мм3	Конечная концентрация градуировочных растворов смеси ФВ (4.21)		Эквивалентные количества ФВ1 и ФВ2 в пробе 1)
		ФВ1, мкг/см3	ФВ2, мкг/см3	ФВ1, мкг/кг	ФВ2, мкг/кг
1	100	0,04	0,01	20,0	5,0
2	200	0,08	0,02	40,0	10,0
3	400	0,16	0,04	80,0	20,0
4	1 000	0,40	0,10	200,0	50,0
5	2 400	0,96	0,24	480,0	120,0
1) Для экстракта пробы, повторно растворенной в 500 мкл смеси В, состоящей из ацетонитрила и воды (4.12).

5 Оборудование

Используют лабораторную посуду и лабораторное оборудование по ГОСТ 25336.

5.1 Весы аналитические, пригодные для взвешивания, предел погрешности 0,000 1 г.

5.2 Весы лабораторные по ГОСТ OIML R 76-1, пригодные для взвешивания, предел погрешности до 0,1 г.

5.3 Баня водяная с регулируемым термостатом.

5.4 Колбы Эрленмейера, 250 см³, с завинчивающимися крышками.

5.5 Встряхиватель лабораторный орбитальный.

5.6 Центрифуга, обеспечивающая центробежное ускорение до 3000 g.

5.7 Пробирки центрифужные, 250 см³, с завинчивающимися крышками.

5.8 Микрошприцы и микропипетки градуированные вместимостью 100, 200 или 1000 мм³.

5.9 Пипетки вместимостью 5, 10 или 25 см³.

5.10 Устройство для вакуумной фильтрации с возможностью присоединения иммуноаффинных колонок (4.16).

5.11 Резервуары (вместимостью 25 см³) и адаптеры для колонок.

5.12 Насос вакуумный.

5.13 Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026, например качественная, прочная, быстрой пропускной способности, диаметром 24 см и размером пор 30 мкм или аналогичная.

5.14 Фильтры из стеклянного микроволокна размером пор 1,6 мкм или аналогичные.

5.15 Блок нагревательный с подачей азота или воздуха.

5.16 Флаконы стеклянные вместимостью от 4 до 12 см³ и с завинчивающимися крышками.

5.17 Флаконы стеклянные для автоматического пробоотборника для ВЭЖХ вместимостью 1,8 см³ с крышками (виалы).

5.18 Вставка стеклянная вместимостью 250 мм³ для виал.

5.19 Встряхиватель типа "Вортекс" или аналогичное перемешивающее устройство.

5.20 Система для ВЭЖХ в указанной ниже комплектации.

5.20.1 Система ввода проб.

5.20.2 Насос для подвижной фазы (двух-, трех- или четырехканальный), который способен создавать бинарный градиент при скорости потока 1 см³/мин.

5.20.3 Пробоотборник автоматический, способный выполнять автоматическую предколоночную дериватизацию с ОФА-реагентом, указанным в 6.4.1.

5.20.4 Колонка для ВЭЖХ, заполненная обращенно-фазовым сорбентом, например: колонка С18, заполненная обращенно-фазовым сорбентом, размерами 150 х 4,6 мм, 5 мкм, с подходящей предколонкой или с установленным на входе защитным фильтром, который обеспечивает приемлемую способность удерживать и разделять ФВ₁ и ФВ₂.

По результатам исследований признаны подходящими колонки С18 SymmetryShield компании Waters, Zorbax SB-C18 компании Agilent или аналогичные колонки.

5.20.5 Термостат колонок, который может работать при температуре 20 °С.

Примечание - Колонки С18, заполненные обращенно-фазовым сорбентом, также могут быть использованы при комнатной температуре.

5.20.6 Детектор флуоресцентный, снабженный проточной кюветой, позволяющий проводить измерения при длине волны возбуждения 335 нм и длине волны эмиссии 440 нм.

5.20.7 Устройство записывающее, интегратор или система компьютерная обработки данных.

5.21 Настройки линейного градиента.

Условия градиента представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Условия для градиентного элюирования

Время, мин	Скорость потока, см3/мин	Подвижная фаза А, %	Подвижная фаза В, %
0,00	1,00	60	40
5,00	1,00	60	40
26,00	1,00	12	88
29,00	1,00	12	88
29,10	1,00	-	100
30,00	1,00	-	100
30,10	1,00	60	40
38,00	1,00	60	40

Вышеуказанная программа градиента при использовании колонки С18 SymmetryShield компании Waters гарантированно обеспечивает приемлемую степень элюирования ФВ₁ и ФВ₂. Применение другой колонки может потребовать корректировки этих условий до достижения приемлемого разделения пиков.

6 Проведение испытания

6.1 Экстракция

Пробу измельчают до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм, а затем тщательно перемешивают, для того чтобы обеспечить однородную консистенцию.

Измельченную для анализа пробу массой 20 г, измеренной с точностью до 0,1 г, помещают в колбу Эрленмейера (5.4). Добавляют 100 см³ экстрагента (4.8) и закрывают колбу завинчивающейся крышкой. Колбу нагревают в течение 60 мин при температуре 55 °С (в статическом состоянии) на водяной бане с регулируемым термостатом (5.3). Колбу помещают в лабораторный орбитальный встряхиватель (5.5) и встряхивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Пробу переносят в центрифужную пробирку (5.7) и центрифугируют в течение 15 мин при центробежном ускорении 3000 g (5.6). Содержимое колбы фильтруют через фильтровальную бумагу (5.13) и отбирают 10 см³ фильтрата. 10 см³ фильтрата разбавляют 40 см³ воды и перемешивают. Раствор фильтруют через фильтр из стеклянного микроволокна (5.14), отбирают 25 см³ фильтрата (что соответствует 1 г анализируемой пробы) и непосредственно после этого (в течение следующего часа) очищают на иммуноаффинной колонке.

6.2 Очистка экстракта на иммуноафинной колонке

Иммуноаффинную колонку (4.16) соединяют с устройством для вакуумной фильтрации (5.10) и прикрепляют резервуар. Не допускается сливание раствора из колонки для обеспечения его хранения. Разбавленный отфильтрованный экстракт объемом 25 см³ добавляют в резервуар колонки. Экстракт элюируют со скоростью приблизительно одна капля в секунду. Колонку промывают 10 см³ раствора PBS (4.10), а затем 2 см³ воды со скоростью приблизительно одна капля в секунду. Воду удаляют путем пропускания воздуха или азота через колонку в течение 5 с. Стеклянный флакон или пробирку устанавливают под колонкой.

Фумонизины элюируют дважды: метанолом по 1 см³ (4.2) и один раз 2 см³ воды, как указано ниже.

1 см³ метанола добавляют в колонку. Жидкость пропускают через колонку под небольшим давлением (например, с помощью резиновой груши для пипеток Пастера или шприца) до появления первой капли. Кран немедленно закрывают. Через 1 мин кран открывают. Элюату дают протечь под действием силы тяжести до тех пор, пока жидкость не достигнет верхнего слоя колонки. Кран немедленно закрывают. Через 1 мин добавляют вторую порцию метанола объемом 1 см³. Кран открывают, и половине жидкости (около 500 мм³) дают протечь через колонку под действием силы тяжести. Кран закрывают, снова открывают через 1 мин, а оставшаяся жидкость элюируется под действием силы тяжести. Остатки метанола удаляют из колонки, пропуская через колонку воздух или азот.

Добавляют 2 см³ воды, а жидкость элюируют из колонки под действием силы тяжести. Остатки жидкости удаляют из колонки, пропуская через нее воздух или азот. Элюаты упаривают досуха потоком воздуха или азота при температуре около 55 °С (5.15). Остаток повторно растворяют в 500 мм³ смеси В, состоящей из ацетонитрила и воды (4.12). Стеклянный флакон закрывают крышкой и перемешивают во встряхивателе (5.19) в течение 30 с, обеспечивая тщательную промывку нижней части флакона растворителем. Флакон хранят при температуре 4 °С до проведения ВЭЖХ в течение 1 нед.

6.3 Метод искусственного внесения фумонизинов

Для определения полноты извлечения в репрезентативную измельченную пробу продукции детского питания для детей раннего возраста, не содержащего фумонизинов, добавляют раствор смеси фумонизинов. Для его приготовления основной раствор см