Вход
Правила генетической экспертизы племенного материала крупного рогатого скота
Общие положения
1.1. Генетическая экспертиза племенного материала (племенной продукции) проводится в целях:
подтверждения истинности происхождения (принадлежности) племенной продукции (или соответствия происхождения племенного материала данным первичного зоотехнического и племенного учета);
выявления генетических аномалий;
контроля генетической безопасности (безвредности);
оценки генетического потенциала животных.
1.2. Генетическую экспертизу (генетическое тестирование) осуществляют центры по генетическому тестированию и лаборатории иммуногенетики, аккредитованные Центральным органом Системы сертификации.
1.3. Генетической экспертизе подлежит вся племенная продукция животных: крупного рогатого скота, свиней, овец, лошадей, зверей и кроликов, а также птиц, рыб, пчел, тутового шелкопряда.
1.4. Результаты генетической экспертизы могут быть признаны действительными, если данная экспертиза осуществлялась методами, предусмотренными настоящими "Правилами генетической экспертизы племенной продукции".
Методика генетической экспертизы и оценки племенной продукции крупного рогатого скота
Генетической экспертизе подлежат:
все быки-производители на станциях искусственного осеменения и племпредприятиях;
в племенных хозяйствах и племзаводах:
маточное поголовье коров,
ремонтный молодняк, введенный в основное стадо,
бычки, подлежащие продаже на племпредприятия в возрасте 6 месяцев.
Генетическая экспертиза и оценка племенной продукции включает в себя:
подтверждение соответствия происхождения племенного материала данным племенного учета;
выявление генетических аномалий;
заключение о племенной ценности животного.
1. Подтверждение истинности происхождения крупного рогатого скота по группам крови
Наиболее информативным и самым отработанным и доступным методом подтверждения достоверности происхождения особи является метод иммуногенетического контроля, который проводится путем определения групп крови у родителей и потомков с последующим анализом их соответствия (достоверности происхождения).
Метод основан на законах кодоминантного наследования и неизменяемости антигенного состава крови в течение жизни животного. Выявление у потомков групп крови, отсутствующих у отца или матери, является основанием для исключения из родословной одного из родителей.
Подтверждение истинности происхождения животных проводится в два этапа:
первый - паспортизация животных, включающая выявление антигенов эритроцитов в крови свиней и определение генотипов по локусам групп крови.
второй - выявление соответствия происхождения животных данным племенного учета по генотипам групп крови.
Антигены эритроцитов в крови крупного рогатого скота определяют гемолитическими тестами с помощью реагентов, содержащих специфические к ним антитела.
Каждому антигену соответствует строго определенное антитело. Для определения групп крови используют стандартные сыворотки-реагенты, полученные от животных-доноров и содержащие маркированные антитела на определенные антигены.
1.1. Необходимые материалы
Реагенты для определения групп крови крупного рогатого скота. Комплемент из кроличьей сыворотки, консерванты крови, реактивы.
Реагенты
Это моноспецифические сыворотки, полученные путем сложной изоиммунизации крупного рогатого скота, предназначенные для определения групп крови.
Технические условия (ТУ)
1. Должны быть высокоспецифичными, т.е. реагировать только с одним антигеном.
2. Проходят обязательную унификацию в головном центре по экспертизе племенной продукции (материала).
3. Набор реагентов включает не менее 50 наименований сывороток для определения антигенов 10 систем.
4. Расфасованы во флаконы емкостью 10-20-50 мл по 125-250-500 доз в каждом.
5. Маркировка флаконов: указывается предприятие-изготовитель, наименование иммуноспецифической сыворотки к определенному антигену, титр, количество в мл и дозах, номер серии, дата изготовления (месяц, год), срок годности, номер госконтроля, условия хранения.
6. Дозой реагента считается 0,1 мл (две капли) рабочего раствора в замороженном состоянии.
7. Реагент должен обладать высокой активностью, т.е. иметь концентрацию антител, достаточную для выявления соответствующих антигенов в любом образце крови.
8. Физические свойства: жидкость соломенно-желтого цвета до светло-коричневого. Не должно быть механических примесей и плесени. При длительном хранении допускается наличие осадка на дне.
9. Хранят реагенты в морозильных камерах при температуре не выше -20°С.
10. Срок годности - 2 года со дня изготовления при соблюдении правил хранения.
Комплемент
Это вещество, которое катализирует реакцию гемолиза при соединении антител, содержащихся в сыворотках, с антигенами эритроцитов крови. Комплемент содержится в нормальной сыворотке крови животных.
В реакции гемолиза при определении антигенов крови крупного рогатого скота используют кроличий комплемент.
Техника приготовления кроличьего комплемента
1. Кровь у кроликов можно брать двумя способами:
а) непосредственно из сердца - (кролика фиксируют на спине, вводят в ушную вену 1 мл теопентала, животное через 1-2 мин засыпает); из сердца длинной иглой берут 40-50 мл крови.
б) из ушной вены - (смазывают край уха ксилолом или толуолом, делают продольный разрез ушной вены размером 3-5 мм, кровь собирают в чашку Петри).
2. Кровь выдерживают при комнатной температуре 1,5-2 ч до свертывания и выделения сыворотки.
3. Отстоявшуюся сыворотку сливают в центрифужные стаканы и центрифугируют при 3000-3500 - 10 мин.
4. Сыворотку рекомендуется абсорбировать эритроцитами крупного рогатого скота, так как у некоторых кроликов встречаются естественные антитела типа гемолизинов.
5. Готовую сыворотку расфасовывают во флаконы по 10-20 мл.
Для повышения качества и активности комплемент готовят путем смешивания сывороток крови, полученных в один и тот же день от 10 и более кроликов.
ТУ на комплемент
1. Хранят комплемент при температуре -20°С до 6 месяцев.
2. Комплемент, сохранявшийся более 6 месяцев, используют после усиления его активности путем смешивания в различных соотношениях (1:1, 1:2, 1:3 и 1:4) со свежеполученным. Соотношение зависит от истинной активности хранившегося и свежеполученного комплемента.
3. Активность комплемента проверяют первый раз после трехмесячного хранения путем постановки реакции гемолиза с 10-20 образцами крови.
Консерванты крови
Образцы крови для определения эритроцитарных антигенов необходимо консервировать антикоагуляционным раствором (антикоагулянтом).
Прописи антикоагулянтов
Техника приготовления антикоагуляционных растворов
На аналитических весах делают навески всех ингредиентов.
В мерную колбу на 1000 мл вносят: навески лимоннокислого натрия и глюкозы, 300-400 мл кипяченой дистиллированной воды, температуру раствора доводят до температуры 36-37°С, вносят навески альбуцида и риванола, доводят объем раствора до метки 1000 мл дистиллированной водой при температуре 36-37°С, смесь перемешивают и фильтруют через ватно-бумажный фильтр.
Раствор хранится в холодильнике при температуре 4°С в течение 1-1,5 месяцев.
Реактивы
|
1. Глюкоза кристаллическая гидратная |
ГОСТ 975-75 |
|
2. Хлористый натрий по 0,9 г в таблетках |
|
|
3. Лимоннокислый натрий трехзамещенный |
|
|
4. Риванол (этакридин лактат) |
ГФ, Х, СТ27 |
|
5. Альбуцид (сульфацил натрия) |
ГФ, Х, СТ641 |
|
6. Левомицетин |
ГФ, Х, СТ371 |
|
7. Спирт ректификат |
|
|
8. Кислота серная техническая удельным весом |
1,82-1,84 |
|
9. Двуххромовокислый калий |
|
|
10. Сода кальцинированная |
1.2. Правила получения и хранения образцов крови
Пробы крови для генетической экспертизы у крупного рогатого скота берут из яремной вены по общепринятой методике специалисты ветеринарной службы хозяйства в присутствии зоотехника-селекционера.
Получение образцов крови
Образцы крови берут в стерильные пробирки.
Перед взятием крови пробирки номеруют и вносят в них по 3-6 мл антикоагулянта и расставляют в штатив;
осторожно по стенке пробирки приливают кровь в объеме 1-2 мл (соотношение антикоагулянта и крови 3:1);
пробирку закрывают пробкой и несколько раз переворачивают для перемешивания содержимого;
в ведомость взятия крови сразу записывают индивидуальный номер животного, у которого взята кровь.
Доставка и хранение образцов крови
Образцы крови помещают в сумку-холодильник или термос при температуре 2-4°С и направляют в лабораторию в течение 1-2 суток со дня взятия крови.
К образцам крови прилагается ведомость с указанием даты взятия крови, клички, индивидуального номера животного, возраста, породы, родителей. Образцы крови хранят в холодильнике при температуре 2-4°С не более 1-2 недель.
1.3. Метод и правила определения антигенного спектра эритроцитов
Антигенный состав крови крупного рогатого скота определяют по результатам постановки серологических реакций с помощью моноспецифических сывороток реагентов.
Сущность реакции состоит в том, что антитела, содержащиеся в сыворотках-реагентах, соединяются с гомологичными антигенами эритроцитов крови исследуемого животного. Соединение антигена с антителом в присутствии комплемента (нормальной кроличьей сыворотки) вызывает разрушение оболочек эритроцитов (гемолиз) и освобождение гемоглобина, который окрашивает жидкость в красноватый ("лаковый"). При отсутствии антигена реакция не происходит, эритроциты остаются неповрежденными и оседают на дно.
Подготовка материалов для постановки реакции гемолиза
Перед проведением иммунологической реакции необходимо подготовить к работе реагенты, суспензии эритроцитов, серологические тесты, штативы с пробирками и т.д.
Подготовка реагентов
1. Для размораживания реагенты переносят в лабораторное помещение с комнатной температурой. Для ускорения процесса флаконы можно поставить в теплую воду с температурой не выше 36-37°С.
2. Готовят рабочие титры в соответствии с маркировкой на флаконах. Сыворотки разбавляют физиологическим раствором на одну-две ступени ниже их предельного титра, указанного на флаконе. Например, если реагент имеет титр 1:32, то для работы его надо разбавить не более, чем в 16 раз.
Реагенты с рабочим титром должны быть использованы в течение одного дня. Неиспользованные реагенты замораживают, затем используют в течение ближайших двух-трех дней.
Подготовка комплемента
Перед постановкой реакции гемолиза размораживают необходимый объем комплемента, поместив стеклянный пузырек с ним в теплую воду (28-30°С).
Комплемент, оставшийся после постановки реакции, необходимо уничтожить, так как он резко теряет активность и приходит в негодность при повторном замораживании.
Приготовление суспензии эритроцитов
Для постановки серологических реакций необходимо приготовить 2,5%-ную суспензию эритроцитов из образцов крови исследуемых животных. Техника приготовления суспензий состоит из следующих операций.
1. Трехкратное отмывание эритроцитов.
Отмывание эритроцитов производят физиологическим раствором (0,85%-ный раствор хлористого натрия при pH = 6,7-7,0) для удаления белков: на чистые центрифужные пробирки наносят номера образцов крови; в каждую пробирку вносят 1,5-2 мл хорошо перемешанной консервированной крови и 7-8 мл физиологического раствора; перемешивают содержимое пробирки путем осторожного переворачивания и центрифугируют при 2000-2500 в течение 5-7 мин; водоструйным насосом удаляют надосадочную жидкость и верхний слой эритроцитов с белой пленкой (оставшиеся белки); к осадку эритроцитов вновь добавляют физиологический раствор и проводят повторное отмывание не менее 3 раз, пока надосадочная жидкость не станет светлой и прозрачной.
2. Приготовление стандартной суспензии.
В пробирку наливают 9,75 мл физиологического раствора. Вносят 2,5 мл отмытых эритроцитов любого образца, предварительно перемешав их легким встряхиванием. Содержимое пробирки перемешивают, переворачивая 5-6 раз.
Полученная 2,5%-ная суспензия эритроцитов является эталоном (стандартом) для приготовления рабочих суспензий.
3. Приготовление 2,5%-ной рабочей суспензии эритроцитов.
На чистые пробирки наносят номера отмытых образцов крови. В каждую пробирку наливают 9,75 мл физиологического раствора и вносят каплями отмытые эритроциты соответствующего образца. Готовят 2,5%-ную суспензию путем сравнения со стандартом по интенсивности окраски.
Суспензию можно хранить пять-шесть дней при температуре 2-4°С.
Подготовка бланка серологического теста
Серологический тест - это основной рабочий документ при тестировании животных по группам крови, в котором фиксируются результаты серологических реакций. Бланк теста заполняют перед постановкой реакции (кроме результатов читки). В шапке документа указывается:
хозяйство, из которого поступили образцы крови;
порядковый номер теста;
дата постановки реакции;
время начала отдельных операций при постановке реакции.
В левой полосе записывают номера образцов крови, индивидуальные номера и клички животных, у которых определяют тип крови.
В верхней полосе слева направо вписывают наименования реагентов (с указанием их титра) строго посистемно, согласно алфавиту (А, В, С, F, J, L, М, S, Z, R-S').
Правила постановки реакции гемолиза для определения эритроцитарных антигенов
Выявление антигенов эритроцитов крупного рогатого скота производят путем постановки реакции гемолиза.
Принцип реакции заключается в связывании антитела с антигеном в присутствии комплемента, в результате чего происходит гемолиз эритроцитов и выход гемоглобина в жидкую фазу с окрашиванием ее в красноватый цвет.
Степень гемолиза отмечают в протоколе (серологическом тесте) при первом и втором чтениях реакции.
Техника постановки реакции гемолиза
Реакция гемолиза проводится в блоках или пластинах из прозрачного оргстекла с круглыми глубокими ячейками (гнездами), предназначенными для внесения и смешивания компонентов, участвующих в реакции.
Подписывают блоки: по горизонтали сверху пишут наименование реагентов или их порядковый номер, согласно серологическому тесту, по вертикали с левой стороны - номера образцов крови исследуемых животных.
В каждый ряд лунок вносят по вертикали по две капли определенной сыворотки-реагента, по горизонтальным рядам - по одной капле 2,5%-ной суспензии эритроцитов. Последний вертикальный ряд является контрольным, в каждую лунку которого вносят по две капли физиологического раствора вместо сыворотки. Блоки со смесью энергично встряхивают до полного растворения осадка на дне лунки. В бланке гемолитического теста отмечают время начала постановки реакции. Инкубируют при комнатной температуре 20 мин. В каждую лунку вносят по одной капле комплемента. Блоки тщательно встряхивают и помещают в термостат при температуре 26-28°С на 30 мин. Проводят повторное встряхивание и инкубацию в термостате 1,5-2 ч. Проводят первое чтение реакции с записью результатов в серологический тест. После тщательного перемешивания инкубируют еще 1-2 ч в термостате. Проводят вторую читку реакции с записью ее результатов в тот же серологический тест.
Оценка реакции гемолиза
Оценка реакции проводится по пятибалльной системе:
0 - реакция отрицательная. Полное отсутствие гемолиза. Эритроциты оседают на дно в виде крупной красной точки, с резко очерченными краями, надосадочная жидкость прозрачная, соломенно-желтого цвета.
4 балла - реакция положительная. Полный гемолиз всех эритроцитов. Совершенно нет осадка, надосадочная жидкость равномерно окрашена в розово-красный цвет.
3 балла - реакция положительная. На дне небольшое количество эритроцитов (1/3 от контроля) в виде просвечивающейся пленки. Надосадочная жидкость окрашена в слабо-розовый цвет. Вокруг осевших эритроцитов хорошо виден ореол окрашенной жидкости.
2 балла - реакция сомнительная. На дне лунки половина осевших эритроцитов. Жидкость вокруг осадка в виде круга окрашена в розово-красный цвет. Остальная надосадочная жидкость прозрачна.
1 балл - реакция сомнительная. Большинство эритроцитов осело на дно лунки (примерно 3/4 величины точки в контроле). Надосадочная жидкость слабо окрашена в соломенно-розовый прозрачный цвет.
Сомнительные реакции подлежат перепроверке.
1.4. Определение генотипов животных по группам крови
Генотип каждого животного складывается из наследственных задатков родителей. В зависимости от степени изученности и сложности систем антигенов, количества аллельных форм и их сочетаемости в стадах возможно выявлять разное число генотипических классов крупного рогатого скота.
При определении генотипов по группам крови в каждой системе выявляют оба аллеля, унаследованные от родителей. Обозначают генотипы в виде дроби: первая группа факторов унаследована от отца, вторая - от матери (например, BIOIУ2D'A'0').
Системы групп крови по генетической структуре подразделяются на простые, включающие не более двух антигенов, и сложные, состоящие из трех и более антигенов.
В однофакторных системах (I, L, М, Z, N', Т) различают два аллеля: один обуславливает присутствие, другой - отсутствие соответствующего антигена.
В двухфакторных системах (F, R'-S') каждый антиген представляет группу крови.
Для многофакторных систем (А, В, С, S) характерно широкое разнообразие групп крови. Большинство их состоит из нескольких факторов, наследуемых как единое целое.
При регулярном исследовании групп крови, когда генотипы быков и коров уже известны, определение генотипов потомков и проведение контроля достоверности их происхождения значительно упрощается. Уточнения могут потребоваться лишь при получении новых реагентов, которыми отцы и матери ранее не исследовались.
Выявленные генотипы заносятся в компьютер.
На основании расписанных генотипов составляется ведомость - "тест", которая является выходным документом N 1 при генетической экспертизе племенной продукции.
1.5. Определение достоверности происхождения
Определение соответствия происхождения животных записям в племенных документах осуществляет квалифицированный специалист.
Иммуногенетический контроль происхождения животных основан на принципе исключения, независимости наследования групп крови одной системы относительно другой. Животное может иметь только те аллели, которые есть у его родителей. Выявление у потомков групп крови, отсутствующих у отца и матери, является основанием для исключения из родословной одного (чаще отца) или обоих родителей.
Точный анализ достоверности можно сделать только по генотипам.
Основную информацию для оценки достоверности происхождения животных дают многофакторные системы, так как в них вероятность комбинаций одинаковых аллелей и генотипов наименьшая.
1.6. Необходимое оборудование
|
1. Компьютер с периферией |
1 шт. |
|
2. Центрифуга С-70, (К-60) |
2 |
|
3. Центрифуга Т-23 |
1 |
|
4. Термостат ЭТ-1 |
1 |
|
5. Сушильный шкаф |
2 |
|
6. Морозильники: "Стинол", "Минск" |
2 |
|
7. Холодильник бытовой |
2 |
|
8. Дистиллятор |
2 |
|
9. Весы ВЛКТ-500 |
1 |
|
10. Весы торсионные |
1 |
|
11. Сумка-"термос" |
1 |
|
12. Иммунологические блоки из оргстекла |
20 |
|
13. Водоструйный насос |
2 |
|
14. Капельницы полиэтиленовые (10-20 мл) |
1000 |
|
15. Шприцы ветеринарные (10 мл) |
50 |
|
16. Штативы металлические на 40 пробирок (капельниц) |
20 |
|
17. Посуда лабораторная из термостойкого стекла: стаканы, цилиндры, колбы, воронки |
10-20 |
|
18. Градуированные пипетки |
10 |
|
19. Эмалированные емкости для мытья посуды |
3-4 |
1.7. Нормы и стоимость генетического тестирования по группам крови
Нормы (в расчете на 1 чел.-день, головы)
1.8. Выходные документы
1. Генетические тесты.
2. Протокол генетической экспертизы.
3. Генетический паспорт.
2. Определение полиморфных систем белков и ферментов крови крупного рогатого скота
Для расширения спектра диагностикумов при определении достоверности происхождения животных исследования по группам крови можно дополнить изучением полиморфности белков и ферментов крови.
У крупного рогатого скота анализируют трансферрин (Tf), посттрансферрин (Ptf), постальбумин (Pta) в плазме (сыворотке) крови.
2.1. Необходимые материалы
реактивы;
оборудование.
Реактивы
1. Акриламид.
2. Аммоний надсернокислый (персульфат аммония).
3. Бром-феноловый синий.
4. Глицин.
5. Кумасси R-250.
6. Метилен-бис-акриламид.
7. Сахароза.
8. Соляная кислота.
9. Тетраметиэтилендиамин (ТЕМЭД).
10. Трис-оксиметил-аминометан (трис).
11. Уксусная кислота.
12. Этиловый спирт.
2.2. Правила получения и хранения образцов крови
Пробы крови отбирают так же, как и для иммуногенетического анализа. Далее образцы плазмы (сыворотки) и эритроцитов отбирают в мелкие полиэтиленовые пробирки или планшеты и хранят в морозильной камере бытового холодильника в течение месяца. Для более длительного хранения образцов их необходимо поместить в морозильную камеру с температурой -17°С.
Для электрофоретического разделения образцы сыворотки (плазмы) крови необходимо оттитровать 40%-ной сахарозой с индикатором в соотношении 1:2 (сыворотка:сахароза).
2.3. Методы и правила определения полиморфных систем белков крови
Для проведения электрофореза необходимые растворы готовят на дистиллированной воде заранее. Растворы всех буферов, сахарозы и персульфата аммония хранят в холодильнике, остальные растворы можно хранить при комнатной температуре.
Растворы
|
1. 20%-ный акриламид с 8%-ной сшивкой: |
|
|
акриламид |
96 г |
|
метилен-бис-акриламид |
4 г |
|
вода |
до 500 мл |
|
2. Гелевый буфер: |
трис-НСl, рН 7,2 |
|
трис |
6 г |
|
1 N HCl |
40 мл |
|
вода |
до 90 мл |
|
проверить рН, при необходимости довести |
|
|
1 N HCl |
|
|
вода |
до 100 мл |
|
Гелевый буфер для постальбумина: |
|
|
а) трис |
8,67 г |
|
лимонная кислота |
1,5 г |
|
вода |
до 100 мл |
|
б) смешать 1 объем электродного буфера (см. далее) и 5,25 объема раствора а). | |
|
3. Электродный буфер: трис-глицин, рН 8,3 |
|
|
трис |
6 г |
|
глицин |
28,8 г |
|
вода |
1000 мл |
|
Перед употреблением разводят 1:10. |
|
|
Электродный буфер для постальбумина: |
|
|
лития гидроокись |
21 г |
|
борная кислота |
118 г |
|
глицин |
28,8 г |
|
вода |
1000 мл |
|
Перед употреблением разводят 1:10. |
|
|
4. Раствор аммония надсернокислого: |
|
|
аммоний надсернокислый (персульфат аммония) |
1,6 г |
|
вода |
до 100 мл |
|
5. 40%-ная сахароза с индикатором: |
|
|
сахароза |
40 г |
|
бром-феноловый синий |
0,1 г |
|
вода |
60 мл |
|
6. 7%-ная уксусная кислота: |
|
|
уксусная кислота |
70 мл |
|
вода |
до 1000 мл |
|
7. Раствор красителя |
|
|
кумасси R 250* |
1 г |
|
7%-ная уксусная кислота |
100 мл |
|
Перед употреблением этот раствор разбавляют 7%-ной уксусной кислотой 1:100. | |
|
8. Смесь для отмывки: |
|
|
этиловый спирт, вода, уксусная кислота в соотношении 10:10:1 или 5:5:1. Смесь для отмывки можно заменить 7%-ной уксусной кислотой. | |
______________________________
* Кумасси R 250 можно заменить амидочерным 10 Б.
Методика постановки электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ)
Приготовление ПААГа
Необходимую концентрацию геля готовят так, как указано в табл. 1. Необходимо строго соблюдать последовательность и количество добавления компонентов.
Таблица 1
Схема приготовления ПААГа различной концентрации
|
N |
Компоненты |
Концентрация геля, % |
|||||
|
5 |
7,5 |
8 |
10 |
11 |
12,5 |
||
|
1. |
20%-ный акриламид, мл |
20 |
30 |
32 |
40 |
44 |
50 |
|
2. |
Гелевый буфер, мл |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
|
3. |
ТЕМЭД, мкл |
75 |
75 |
75 |
75 |
75 |
75 |
|
4. |
Вода, мл |
до 75 |
до 75 |
до 75 |
до 75 |
до 75 |
до 75 |
|
5. |
Персульфат |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
Указанные соотношения компонентов рассчитаны на общий объем геля 80 мл. Если для работы необходимо большее или меньшее количество геля, то соотношение компонентов следует пересчитать на нужный конечный объем.
Техника проведения электрофореза
1. Приготовить камеры для заливки геля. Способ сборки камер указан в инструкциях предприятий-изготовителей.
2. Приготовить 10%-ный гель (см. табл. 1) непосредственно перед заливкой камер.
3. Гель заливают в камеры с помощью стеклянного стаканчика с носиком. Во избежание образования воздушных пузырьков эту процедуру проводят следующим образом: камеру слегка наклоняют (от себя), кончик стакана прислоняют к стеклянной пластине камеры и медленно заполняют камеру гелем примерно на 3/4 объема. Затем на гель наслаивают дистиллированную воду. Гель оставляют для полимеризации в течение 20-40 мин при комнатной температуре. Заполимеризовавшийся полиакриламид слегка опалесцирует. После полимеризации воду слить.
4. Приготовить 5%-ный гель (см. табл. 1) и залить камеры до верха. Вставить гребенки.
5. Гель оставляют для полимеризации. При медленной полимеризации геля в зимнее время используют термостат.
6. После успешной полимеризации нижнюю часть камеры разгерметизируют для свободного контакта геля с анодным буфером.
7. Камеры с гелем вставляют в поддоны (при необходимости камеры специально закрепляют) и заливают охлажденные электродные буферы таким образом, чтобы конец гелевой пластинки с гребенками находился в катодном буфере, а противоположный конец - в анодном.
8. Вынимают гребенки.
9. В ячейки автоматической пипеткой наносят по 5-10 мкл исследуемых образцов, оттитрованных 40%-ной сахарозой с индикатором 1:2.
10. Подключают источник питания.
11. Проводят электрофорез в два этапа:
1) при напряжении 100 В - 20 мин,
2) при напряжении 230-250 В в течение 1,5-2 ч.
12. Отключают источник питания.
13. Электродные буферы сливают в емкость и ставят в холодильник. Этот раствор используют в качестве анодного буфера в следующем электрофорезе.
14. Камеру разбирают до гелевых пластинок.
15. При необходимости удаляют лишние участки геля (ячейки и т.п.)
16. Отмечают начало геля, отрезая уголок гелевой пластинки со стороны начала нанесения проб. Когда гель находится вне камеры, легко перепутать начало геля, поэтому возможен другой способ. В последнюю ячейку не наносить образец - в этом случае пустая дорожка на геле будет маркировать конец нанесения проб.
17. Гелевую пластинку переносят в кювету с раствором красителя.
18. Гелевые пластинки помещают в раствор Кумасси на ночь для окрашивания.
19. На следующее утро краску сливают.
20. Гелевые пластинки промывают дистиллированной водой и заливают смесью для отмывки.
21. Смесь для отмывки меняют несколько раз.
22. Идентифицирование генотипов (чтение фореграмм) проводят на хорошо отмытых от фона пластинках геля над лампой искусственного освещения, закрытой матовым фильтром.
23. Результаты вносят в рабочий журнал и выходные документы. Для избежания ошибок или выяснения их причин необходимо рабочий журнал вести с особой тщательностью, отражая в записях постановки методики не только все непредвиденные изменения, но и реальную информацию о режиме проведения электрофореза (напряжение, время), концентрации гелей, рН буферов, титры и количества нанесения образцов и другое, а также в рабочем журнале должен быть отражен календарь приготовления растворов и фирмы - изготовители реактивов.
2.4. Определение генотипов животных по полиморфным белкам
Трансферрин у крупного рогатого скота представлен четырьмя аллелями. На гелевой пластинке (фореграмме) аллели расположены по мере снижения электрофоретической подвижности в следующем порядке: Tf A, Tf , Tf
, Tf E (у аллеля Tf А максимальная скорость миграции). Гомозиготы имеют по три полосы, гетерозиготы представляют собой совмещенную картину гомозиготных составляющих (рис. 1).
Поспрансферрин у крупного рогатого скота представлен двумя аллелями: Ptf А - быстромигрирующий, Ptf В - медленномигрирующий. Гомозиготы (рис. 2) имеют по две полосы, гетерозиготы - три (одна из полос разных гомозигот совпадает по подвижности).
Постальбумин у крупного рогатого скота представлен двумя аллелями: Pta А - быстромигрирующий, Pta В - медленномигрирующий. Гомозиготы (рис. 3) имеют по одной полосе, гетерозиготы - две.
2.5. Необходимое оборудование
1. Автоматические пипетки.
2. Весы на 0,5-1 кг.
3. Весы торсионные на 500 мг.
4. Вытяжной шкаф.
5. Дистиллятор.
6. Источник питания.
7. Камеры для вертикального электрофореза.
8. Лабораторная посуда.
9. Магнитные мешалки.
10. Морозильная камера.
11. рН-метр.
12. Термостат.
13. Холодильник.
3. Выявление генетических аномалий у крупного рогатого скота глазомерно-аналитическим методом
Под термином "генетические аномалии" следует понимать любое отклонение от норм в геноме и генотипе животного, создающее реальную угрозу для жизни, вызывающее предрасположенность к опасным заболеваниям, предопределяющих потерю способности к воспроизводству и снижение продуктивных качеств как самого пробанда, так и его потомков.
Генетические аномалии - это морфофункциональные нарушения в организме животных, возникающие в результате генных и хромосомных мутаций.
"Генетическая аномалия представляет собой наследственно обусловленное, нежелательное с точки зрения здоровья популяции и племенного использования, отклонение от типичного (от нормы), в возникновении которого определенную роль сыграл генотип животного" (Майер, 1967).
Породные и семейные аномалии обусловлены тем, что они сцеплены с хозяйственно полезными признаками данной породы или родственной группы животных. Их частота увеличивается при отборе животных по селекционируемому признаку.
Генетические аномалии у крупного рогатого скота выявляются следующими методами: глазомерно-аналитическим, цитогенетическим, методами ДНК-диагностики.
Глазомерно-аналитический метод позволяет обнаружить аномалии на основе морфофункциональных изменений в организме животных, выявляемых при глазомерной оценке (табл. 2).
Таблица 2
Международный список наиболее часто встречающихся аномалий у крупного рогатого скота (по Стормонту и Визнеру)
|
Индекс |
Наименование |
Фенотип |
Тип наследования |
|
|
Ахондроплазия 1 |
Бульдоговидные телята (тип декстер) Гомозиты появляются на свет большей частью на 5-6 мес. стельности и нежизнеспособны. Мопсообразная голова. Скелет туловища в основном нормален, конечности укорочены как при карликовости |
Доминантный с рецессивным летальным действием |
|
|
Несовершенный эпителиогенез (Epitheliogenesis imperfecta) |
Неравномерные дефекты наружной кожи. Вторичные бактериальные инфекции |
Простой рецессивный |
|
|
Ахондроплазия 2 |
Не такой экстремальный, как |
То же |
|
|
Врожденный гипотрихоз (Hypotrichosis congenita) |
Телята рождаются большей частью совершенно безволосыми и погибают спустя несколько минут после рождения |
-"- |
|
|
Врожденное отсутствие конечностей (Acroteriasis congenita) |
Грудные конечности присутствуют только до локтя, тазовые - до скакательного сустава. Редукция нижней челюсти, атрофия верхней челюсти, водянка головы, волчья пасть. Телята рождаются мертвыми или гибнут вскоре после рождения |
-"- |
|
|
Мумификация (плода) |
Дегенерация и сморщивание плода и плодных оболочек. Мумифицированный плод отмирает в последнюю треть беременности, выкидыша не происходит |
-"- |
|
|
Паралич тазовых конечностей |
Телята нормально развиты, однако у них полностью парализованы задние конечности |
-"- |
|
|
Мышечная контракта |
Артрогрипозы всех конечностей |
Простой рецессивный |
|
|
Анкилоз челюсти |
Окостенение нижнечелюстного сустава |
То же |
|
|
Укорочение позвоночника ("лосевидный теленок") |
Редукция зачатков позвонков, срастание ребер с позвонками, наличие всего 6-7 ребер. Телята рождаются мертвыми или гибнут во время родов |
-"- |
|
|
Летальный фактор Лютикова |
Выкидыши и мертворождения; у телят не отмечается никаких особых отклонений от нормы |
-"- |
|
|
Общая водянка (Hydrops universalis) |
Скопление жидкости в подкожной соединительной ткани, грудной и брюшной полостях. Телята донашиваются или рождаются на 1-2 месяца раньше срока |
-"- |
|
|
Общий анкилоз |
Анкилоз всех суставов, волчья пасть |
Простой рецессивный или доминантный с неполной пенетрантностью |
|
|
Аномалии моляров |
Сдвигание и смещение зубов нижней челюсти. Гибель в первые дни жизни |
Простой рецессивный |
|
|
Ахондропластическое укорочение конечностей |
Пороки развития нижней челюсти в сочетании с укорочением конечностей |
То же |
|
|
Атрезия ануса (Atresia ani) |
Отсутствие анального отверстия. Редкая аномалия |
-"- |
|
|
Артрогрипоз грудных конечностей |
Ноги искривлены и часто анкилозированы. Телята не способны стоять или рождаются мертвыми |
Вероятно, простой рецессивный |
|
|
Мозговая грыжа (Hernia cerebralis) |
Образование расщеплены в крыше черепа. Содержимое грыжи состоит из твердой мозговой оболочки или частей мозга с паутинной и мягкой мозговыми оболочками, а также спинномозговой жидкости |
Простой рецессивный |
|
|
Укорочение нижней челюсти (Brachignathia inferior) |
Нижняя челюсть укорочена, неспособность к сосанию |
То же |
|
|
Синдром агнатии (отсутствие челюсти) |
Сильная степень микрогнатии, агнатия или нижнечелюстнолицевые нарушения |
-"- |
|
|
Антимаскулинический летальный фактор |
Сдвиг соотношения полов |
Сцепленный с полом, рецессивный |
|
|
Двусторонняя непроходимость носа |
Заращение ноздрей. Телята погибают при рождении или вскоре после этого |
Простой доминантный |
|
|
Отсутствие задних конечностей |
"Ползающие телята" |
Вероятно, рецессивный |
|
|
Гидроцефалия |
Макроцефалия. Увеличение количества и ненормальное распределение спинномозговой жидкости. Атрофия от давления мозгового вещества, изменения костей |
Простой рецессивный |
|
|
Врожденные судороги и атаксия |
Судороги головы и шеи. Телята погибают вскоре после рождения. В мозгу определяются микроскопические дефекты |
То же |
|
|
Удлинение срока |
Продолжительность беременности увеличивается на 20-90 дней. Телята нормальны, рождаются мертвыми или погибают во время родов. У коров почти незаметно предвестников родов |
Простой рецессивный |
|
|
Удлинение срока |
Аналогично |
Простой рецессивный |
|
|
Антимаскулинический летальный фактор и зональная (полосная) бесшерстность |
Носителями признака являются только женские особи, у которых на туловище обнаруживались участки, лишенные волосяного покрова, в виде полос. Соотношение полов 2-00:1-00) |
Сцепленный с полом, доминантный |
|
|
Ахондроплазия |
Более легкая форма с очень изменчивым фенотипом |
Простой рецессивный |
|
|
Порфирия |
Полулегальна. Выделение порфирина с мочой и калом. Светочувствительность |
То же |
|
|
Дисфункция щитовидной железы |
У телят укороченная голова и укороченная аномальная нижняя челюсть. Смерть в течение 14 дней после рождения |
|
|
|
Врожденный ихтиоз (Ichthyosis congenita) |
Общий гиперкератоз. Телята погибают вскоре поле рождения |
Простой рецессивный |
|
|
Анадонтия (отсутствие зубов) |
Наблюдалась всего лишь у трех бычков. У животных отсутствовал волосяной покров и совершенно не было зубов. Передняя доля гипофиза недоразвита |
Сцепленный с полом |
|
|
Удлинение срока беременности вследствие аплазии передней доли гипофиза |
Аплазия передней доли гипофиза. Плод вынашивается 256-500 (в среднем 401) дней, вторичные эндокринопатии |
Простой рецессивный |
|
|
Контрактуры мышц конечностей |
Контрактуры мышц только конечностей, вследствие чего они вывернуть, назад. Сходны с |
То же |
|
|
Редукция числа позвонков и удлинение остистых отростков ("Бизоновидные телята") |
Число шейных и грудных позвонков меньше |
Рецессивный |
|
|
Паралич задних конечностей со слепотой |
Параличу сопутствуют воспаление роговой оболочки, тремор, кривошея |
Простой рецессивный |
|
|
Полицитемия |
Полулетальность. Гиперемия кожи и слизистых оболочек, одышка, нарушения роста |
То же |
|
|
Атрезия подвздошной кишки (Atresia ilei) |
Непроходимость подвздошной кишки, укорочение срока стельности |
Простой рецессивный |
|
|
Пробатоцефалия |
"Баранья голова", полулетальность, смерть в результате хронической тимпании или нарушения сердечной деятельности |
Простой доминантный с неполной пенетрантностью или рецессивный |
|
|
Расщепление позвоночника |
Насечки на грудных и поясничных позвонках. Мертворождения |
Рецессивный |
|
|
Выкидыш |
Выкидыш в середине беременности |
Простой рецессивный |
|
|
Паракератоз |
Генетически обусловленное нарушение обмена цинка. Образование на коже чешуек и струпьев |
То же |
4. Метод генной диагностики мутации ВLAD крупного рогатого скота
Генетическая диагностика основана на идентификации фрагмента гена BLAD (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency - дефицит адгезивности лейкоцитов крупного рогатого скота), ответственного за состояние иммунной системы, из генома животного. Идентификация осуществляется с помощью специфических праймеров или затравок, ограничивающих данный фрагмент. Ген BLAD может содержать в своей структуре точковую мутацию, являющуюся причиной иммунодефицита, предрасположенности животных к респираторным инфекциям, диарее и низкой естественной резистентности организма к бактериальным инфекциям. Носители мутантного гена в гомозиготе не поддаются лечению. Наличие мутации в выделенном фрагменте определяется с помощью специфического фермента, реагирующего на измененный мутацией фрагмент.
Генетический тест включает в себя следующие этапы:
взятие проб биологического материала для тестирования (кровь, ткань или сперма);
выделение и оценка качества ДНК;
проведение амплификации (метод ПЦР - полимеразная цепная реакция) фрагмента гена BLAD и оценка качества амплификата;
обработка полученного продукта специфическими ферментами (метод ПДРФ - полиморфизм длин рестриктных фрагментов);
оценка результатов реакции.
Реактивы
1. Трис-(оксиметил)-аминометан .
2. Этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты динатриевая соль, 2-водная (Трилон Б, ЭДТА; ).
3. Натрий хлористый (NaCl).
4. Магний хлористый шестиводный .
5. Додецилсульфат натрия (додециловый эфир серной кислоты натриевая соль, натрия лаурилсульфат SDS; ).
6. Бромистый этидий (ethidium bromide или homidium bromide).
7. Концентрированная соляная кислота.
8. Гидроокись натрия (NaOH).
9. Фенол .
10. Ацетат натрия .
11. Борная кислота .
12. Ферменты: протеиназа К, РНКаза А.
13. Набор для амплификации:
a) реакционный 10xбуфер;
b) фермент Tag-полимераза;
c) смесь, состоящая из четырех дезоксирибонуклеотидов (A,T,G,C), или каждый из нуклеотидов может быть представлен в наборе по отдельности;
d) минеральное масло (можно заменить вазелиновым).
Все реактивы можно приобрести отдельно, не в наборе.
14. Праймеры или затравки для синтеза нужного фрагмента ДН.
15. Рестриктазы TagI, HaeIII с соответствующим буфером. Хорошая активность ферментов наблюдается в присутствии бычьего сывороточного альбумина (BSA) в концентрации 0,1 мг/мл.
16. Цитрат натрия.
17. Гепарин.
18. Сахароза.
Правила получения и хранения биологического материала
Ген BLAD-синдрома выделяют из проб крови (3-5 мл), кожи (площадью приблизительно 0,1 или 0,1-0,3 г) или спермы (20 мкл).
Образцы крови необходимо консервировать одним из консервантов:
гепарин - 0,01 мл на пробирку;
цитрат натрия - 1,5 мл на пробирку раствора следующего состава:
|
цитрат натрия |
50 г |
|
сахароза |
0,5 г |
|
дистиллированная вода |
до 1000 мл |
Кусочки кожи и сперму не консервируют.
Образцы крови, кожи, спермы транспортируют в охлажденном виде при температуре от 0°С до +4°С в течение одних суток.
Образцы хранятся при температуре -20°С в течение одного месяца.
Приготовление основных растворов
1M Трис-HCl, рН = 7,6. Растворяют 121,1 г трис-HCl в 800 мл дистиллированной воды. Доводят рН до необходимого значения добавлением концентрированной соляной кислоты. Для достижения pH 7,6 необходимо добавлять постепенно при перемешивании приблизительно 60 мл концентрированной НСl. При этом постоянно измерять значение рН pH-метром или универсальной индикаторной бумагой (pH 0-12). Перед окончательным доведением рН дают раствору остыть до комнатной температуры. Доводят объем раствора до 1 л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве.
0,5М ЭДТА, рН = 8,0. Добавляют 186,1 г двухзамещенной соли к 800 мл дистиллированной воды. Интенсивно размешивают на магнитной мешалке. Доводят постепенно рН до 8 с помощью концентрированного раствора NaOH, не забывая постоянно проверять значение рН. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве. Динатриевая соль не растворяется до тех пор, пока рН раствора не будет доведен добавлением NaOH приблизительно до 8.
5M NaCl. Растворяют 292,2 г NaCl в 800 мл дистиллированной воды. Доводят объем до 1 л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве.
1M . Растворяют 203,3 г
в 800 мл дистиллированной воды. Доводят объем до 1 л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве.
гигроскопичен.
3М ацетат натрия, рН = 5,2. Растворяют 408,1 г в 800 мл дистиллированной воды. Доводят pH до 5,2 ледяной уксусной кислотой. Доводят объем до 1 л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве.
1М дитиотрейтол (DTT). Растворяют 3,09 г DTT в 20 мл 0,01М ацетата натрия рН = 5,2. Стерилизуют фильтрованием, разливают на порции по 1 мл и хранят при -20°С.
10%-ный додецилсульфат натрия (SDS), называемый также лаурилсульфатом натрия. Растворяют 100 г химически чистого SDS в 900 мл дистиллированной воды. Нагревают до температуры 68°С, чтобы ускорить растворение. Доводят pH до 7,2 добавлением нескольких капель концентрированной НС1. Доводят объем до 1 л. Разливают на порции. Раствор не стерилизуют.
Бромистый этидий, 10 мг/мл. Добавляют 1 г бромистого этидия к 100 мл дистиллированной воды. Размешивают на магнитной мешалке несколько часов, пока краситель не растворится. Завертывают колбу в алюминиевую фольгу или переливают в темную склянку и хранят при температуре 4°С. Бромистый этидий - мутаген (работают в перчатках).
Растворы ферментов протеиназы К и РНКазы А. Растворить сухую панкреатическую протеиназу К в дистиллированной воде в концентрации 20 мг/мл. Концентрация в реакции 0,2-0,5 мг/мл. Температура реакции 37°С. Предварительная обработка фермента не требуется. Хранить при температуре -20°С.
Растворить панкреатическую РНКазу А в концентрации 10 мг/мл в дистиллированной воде или в 10 мМ Трис-Hcl, рН 7,5 и 15 мМ NaCl. Прогреть 10 мин при температуре 95-100°С для разрушения ДНКазы и медленно охладить до комнатной температуры. Разлить на порции, хранить при -20°С. Концентрация в реакционной смеси 0,1 мг/мл.
Выделение ДНК из крови
- К 3-5 мл крови добавляют по капле, непрерывно помешивая, 40-60 мл охлажденного 0,1 мМ ЭДТА;
- центрифугируют при 3000 в течение 15-20 мин с охлаждением (тип центрифуги К70D или К23D), осаждая ядра лейкоцитов;
- удаляют супернатант;
- осадок, состоящий из ядер лейкоцитов, отмывают рядом следующих друг за другом ресуспендирований и центрифугирований в буфере 1хТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5-8) до исчезновения примеси гемоглобина;
- центрифугируют при 3000 15-20 мин с охлаждением;
- отмытый осадок ядер лейкоцитов подвергается лизису. Для этого к осадку добавляют 1xSTE буфер (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5-8, 100 мМ NaCl), 10% SDS до конечной концентрации 1%, протеиназу К до конечной концентрации 200-500 мкг/мл;
- лизирование ядер лейкоцитов проводится при комнатной температуре в течение ночи;
- лизат обрабатывают РНКазой в течение 1 ч при температуре 37°С для разобщения ДНК с РНК, добавляя фермент до конечной концентрации 100 мкг/мл;
- проводят экстракцию ядерной ДНК из лизата фенольно-хлороформным методом. Для этого к полученному объему лизата добавляют равный объем свежеприготовленного насыщенного буфером фенола;
- тщательно размешивают, пока не образуется эмульсия;
- центрифугируют при 3000 в течение 10 мин;
- если органическая и водная фаза хорошо разделились, соберите водный слой (если недостаточно, то центрифугируйте еще раз более продолжительное время или при большей скорости). Промежуточную и нижнюю органическую фазы отбросить;
- добавляют к собранной водной фазе равный объем экстракт-буфера (смесь равных частей фенола и хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 24:1);
- тщательно размешивают, пока не образуется эмульсия;
- центрифугируют при 3000 в течение 10 мин;
- отсасывают пипеткой водную фазу;
- добавляют равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1);
- тщательно размешивают, пока не образуется эмульсия;
- центрифугируют при 3000 в течение 10 мин;
- отсасывают пипеткой водную фазу;
- осаждают ДНК этанолом, добавив два объема охлажденного 95%-ного этанола к объему полученного раствора ДНК;
- перемешивают переворачиванием;
- если ДНК выделилась сразу в виде "медузы", то ее переносят в 70%-ный спирт с помощью пипетки с расширенным носиком;
- переносят выделенную ДНК в чистую микроцентрифужную пробирку;
- высушивают ДНК на воздухе, стараясь не пересушить;
- высушенную ДНК разбавляют в 1хТЕ буфере либо в дистиллированной воде. Объем буфера или дистиллированной воды выбирают в зависимости от количества ДНК.
Выделение ДНК из ткани
- 0,1 г ткани измельчают ножницами, перекладывают в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют два объема буфера 1хТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5-8);
- в пробирку добавляют 10% SDS (додецилсульфат натрия) до 1%-ной концентрации, протеиназу К (20 мг/мл) до концентрации 200 мкг/мл. Пробу инкубируют при температуре 37°С в течение 2 ч. Можно проводить лизис при температуре 37°С в течение ночи;
- добавляют к лизату РНКазу (10 мг/мл), свободную от ДНКаз, до концентрации 100 мкг/мл и инкубируют лизат 1 ч при температуре 37°С. Центрифугируют при 3000 10 мин;
- к супернатанту добавляют равный объем фенола (pH 8), перемешивают, центрифугируют при 6000 10 мин;
- добавляют к водной фазе равный объем экстракт-буфера (смесь фенола, хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 25:24:1), центрифугируют в том же режиме. Собирают водную фазу;
- добавляют равный объем хлороформа (смесь хлороформа с изоамиловым спиртом 24:1), центрифугируют, отбирают водную фазу. Эту стадию повторяют до исчезновения белой интерфазы;
- ДНК из водной фазы осаждают двойным объемом 95%-ного этанола, дважды промывают 70%-ным этанолом, подсушивают на воздухе и растворяют в таком объеме воды, чтобы концентрация ДНК составила примерно 0,5 мкг/мл.
Выделение ДНК из спермы
- Небольшое количество спермы объемом не более 20 мкл промывают буфером (100 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 50 мМ (рН 8) для освобождения от семенной жидкости;
- осаждают центрифугированием при 10000 на микроцентрифуге в течение 5 мин;
- лизис препарата проводят в лизис-буфере объемом 700 мкл (состав буфера 10 мМ DTT, 1% SDS, 100 мМ EDTA, 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, рН 8 с добавлением протеиназы К до конечной концентрации 1 мг/мл) при температуре 55-60°С в течение ночи. Причем в течение первого часа инкубации препарат тщательно перемешивают встряхиванием каждые 5 мин;
- проводят экстракцию водной фазы поочередно: равным объемом фенола, смесью равных частей фенола и хлороформа с изоамиловым спиртом (25:24:1), смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), дважды эфиром;
- для осаждения ДНК к водной фазе добавляют 0,7 объема изопропанол;
- центрифугируют при 12000 в течение 10 мин;
- осадок растворяют в 100-200 мкл воды;
- добавляют 3М ацетат натрия до концентрации 0,3 м;
- осаждают ДНК 2,5 объемами 95%-ного этанола;
- осадок промывают 70%-ным этанолом;
- переосаждают центрифугированием;
- растворяют в воде.
Примечания. 1. Для лизирования ядер лейкоцитов, полученных из крови, и разрушения белков, связанных с ДНК, достаточно использовать 10% SDS. Для качественного выделения ДНК из кожи необходимо использовать оба фермента - протеиназу К и РНКазу. Объем лизата выбирается в зависимости от количества осадка с ядрами лейкоцитов (в пределах 0,75-2 мл).
2. Если при экстрэкции ядерной ДНК из лизата белая интерфаза достаточно большая, ее нужно вновь экстрагировать.
3. Органическую и водную фазы при выделении крупных ДНК (>20 kb) нужно смешивать осторожным качанием, переносить ДНК из одной пробирки в другую следует пипеткой с расширенным носиком.
4. Если ДНК сразу не выделилась, необходимо охладить раствор до -20°С и выдержать при этой температуре 30-60 мин. Если ДНК присутствует в небольших количествах (меньше 0,1 мкг/мл), необходимо увеличить время охлаждения или понизить температуру до -70°С. Центрифугируют при температуре +4°С. Удаляют надосадочную жидкость. ДНК высушивают на воздухе и растворяют в 1хТЕ буфере либо в дистиллированной воде.
Проверка ДНК на концентрацию, нативность, подвижность
Концентрацию и нативность ДНК определяют в 1%-ном агарозном геле электрофоретическим методом.
К 2-5 мкл выделенной ДНК добавляется соответствующее количество десятикратного буфера (0,25% бромфеноловый синий, 0,25% ксиленцианол, 25% фикол) до однократной концентрации. Приготовленный препарат ДНК вносят в лунки геля. Электрофорез проводят при напряжении 40-60 В в течение 1-2 ч. Визуализируют ДНК на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете при длине волны 260 нм. Концентрацию оценивают по яркости свечения полосы высокомолекулярной ДНК в геле в сравнении с известной концентрацией маркерной ДНК. О нативности (отсутствие деградации) ДНК свидетельствует отсутствие шлейфа. ДНК должна выйти из лунки в гель (подвижность). Наличие примесей РНК проявляется в виде пятен в низкомолекулярной зоне.
Амплификация фрагмента гена ВLAD (метод ПЦР)
Используют праймеры: 5'-TGAGACCAGGTCAGGCATTGCGTTCA-3', (сенс-праймер) и 5'-CCCCCAGCTTCTTGACGTTGACGAGGTC-3' (антисенс-праймер), позволяющие получать ПЦР-продукт длиной 132 п.н.
ПЦР проводят в объеме 25 мкл с 50-100 нг геномной ДНК. Реакционная смесь содержит также 50 мМ KСl; 10 мМ Tris, pH 8,4; 2 мМ MgCl2; 25 пкМ праймеров; 100 мкМ каждого dNTP и 1 ед. акт. Тaq-полимеразы.
Реакционную смесь без dNTPs прогревают 3 мин при температуре 93°С, добавляют dNTPs и проводят амплификацию в следующих условиях: при 93°С - 60 с, при 62°С - 60 с, при 72°С - 50 с, 35 циклов.
Оценка результатов ПЦР
Концентрация и специфичность амплификата (фрагмент гена BLAD) оценивается электрофоретическим методом в 2%-ном агарозном геле, при напряжении 40 В в течение 1 ч.
Для идентификации амплифицированного фрагмента, полученного из 100 нг геномной ДНК, достаточно нанести на гель 5 мкл амплификата, смешанного с 1 мкл 10 х буфера для нанесения проб нагель.
Визуализируют амплифицированный фрагмент с помощью трансиллюминатора в проходящем УФ-свете с длиной волны 260 нм. В качестве маркера используется ДНК плазмиды pBR322, расщепленной AluI. Амплифицированный фрагмент гена BLAD имеет яркое, четко видимое свечение. Длина фрагмента составляет 132 п.н., он располагается в геле между полосами маркера 226 и 100 п.н.
Анализ амплификатов на наличие мутации гена ВLAD
Продукты ПЦР делят на две части. Одну аликвоту обрабатывают TaqI, другую - НаеIII. Электрофорез проводят в 4-5%-ном агарозном геле.
В реакционную смесь вносят:
2 мкл 10 х буфера для данной рестриктазы;
1 мкл фермента;
BSA до конечной концентрации 0,1 мг/мл;
5 мкл амплификата;
объем доводится водой до 20 мкл.
Реакционную смесь ставят на ночь в термостат при температуре 37°С.
Фрагменты рестрикции разделяются электрофоретическим методом при напряжении 40 В в течение 2 ч.
В качестве маркера используется ДНК плазмиды pBR322, расщепленной рестриктазой AluI.
Результаты анализа гена ВLAD методом ПЦР - ПДРФ
Амплификаты из ядерной ДНК должны представлять собой полосу длиной 132 п.н.
После рестрикции полученных амплификатов на электрофореграмме должна наблюдаться следующая картина:
|
Аллели |
Фрагменты рестрикции (п.н.) |
|
|
TaqI |
НаеIII |
|
|
NN |
71, 61 |
87, 45 |
|
NB |
132, 71, 61 |
87, 68, 45, 19 |
|
ВВ |
132 |
68, 45, 19 |
Животные, гомозиготные по нормальному аллелю гена BLAD, имеют генотип NN (нормальный аллель обозначают как N). Они здоровы и не являются носителями мутации.
Появление дополнительных сайтов рестрикции и, соответственно, появление дополнительных фрагментов ДНК на электрофорезном геле свидетельствует о том, что в результате точковой мутации произошла замена основания А-аденина на основание G-гуанин в гене, ответственном за проявление BLAD-синдрома. Мутантный аллель обозначается как В.
У гетерозиготной особи в геноме присутствуют два аллеля гена BLAD, один - поврежденный мутацией (В), другой - неповрежденный (N). Это генотип NB. Фенотипически такие животные являются здоровыми, но несут в своем генотипе рецессивный мутантный аллель.
Животные с двумя мутантными аллелями (генотип ВВ) являются носителями мутации и неизлечимо больны.
Необходимое оборудование
1. Низкоскоростная центрифуга с охлаждением.
2. Микроцентрифуга типа "Эппендорф".
3. Термостат.
4. Прибор для горизонтального гель-электрофореза с источником постоянного тока, кювета для формирования агарозного геля, гребенки для формирования лунок в геле, подложки для геля.
5. Трансиллюминатор с фотоаппаратом или видеокамерой.
6. Морозильник (-20°С).
7. Электрическая плитка.
8. Бидистиллятор.
9. Весы технические до 500 г.
10. pH-метр или универсальная индикаторная бумага.
11 Аппарат для перегонки фенола (круглодонная колба с тремя шлифами, суховоздушный холодильник, асбест для изоляции холодильника, электрическая плитка).
12. ДНК-амплификатор (термоциклер).
13. Пробирки типа "Эппендорф" на 1,5 мл и 0,5 мл.
14. Вариационные пипетки 0,5-10 мкл, 5-40, 40-200, 100-1000 мкл.
15. Мерные колбы на 2, 1, 0,5 л, мерные стаканы на 1 л, 0,5 л, цилиндры мерные 100 мл, пипетки на 1, 5, 10 мл.
16. Перчатки резиновые.
Нормы
Производительность труда по данной методике составит 50 проб в месяц на одного сотрудника лаборатории.
5. Цитогенетический метод выявления аномалий у крупного рогатого скота
Позволяет выявить численные нарушения кариотипа и хромосомные перестройки у аномальных потомков и их родителей.
Для предотвращения распространения вредных аберраций, повреждений хромосом необходим систематический контроль (мониторинг) за состоянием кариотипов у основной воспроизводящей части популяций.
Изучение кариотипа у аномальных животных и их родителей проводят для обнаружения хромосомных и геномных мутаций, структурных изменений хромосом и количественных изменений кариотипа как причины фенотипических аномалий.
5.1. Необходимые материалы
1. Питательные среды для культивирования лейкоцитов (игла, N 199, RPMI 1640 или их смесь).
2. Реактивы.
Реактивы
1. Митогены (фитогемагглютинин, Concanavalin А).
2. Гепарин.
3. KСl.
4. Метиловый или этиловый спирт.
5. Ледяная уксусная кислота.
6. Антибиотики (пеницилин и стрептомицин).
7. Красители азур и эозин (краситель Романовского).
8. Краситель Гимза.
9. Краситель акридиновый оранжевый.
5.2. Правила получения и хранения биологического материала для цитогенетического анализа
Биологическим материалом для проведения цитогенетического анализа служат лейкоциты и лимфоциты периферической крови. Общим правилом взятия биологического материала является обязательное соблюдение стерильности при взятии крови.
Взятие и доставка образцов крови
Периферическая венозная кровь в количестве 5-10 мл забирается в стерильный одноразовый шприц и переносится в стерильную пробирку или флакон с 0,05-0,1 мл стандартного раствора гепарина (5000 ЕИ в 1 мл). У крупного рогатого скота кровь берется стерильной одноразовой системой во флакон из яремной вены.
Перед взятием крови поверхность кожи в месте введения иглы стерилизуют 70%-ным спиртом. Вся процедура взятия крови должна быть проведена с максимальным соблюдением стерильности.
Образцы крови помещают в сумку-холодильник или термос при температуре 2-4°С и направляют в лабораторию в течение 1-2 ч с момента взятия биологического материала.
К образцам прилагается ведомость с указанием даты взятия крови, клички, индивидуального номера животного, родителей, возраста, породы.
5.3. Правила и методы проведения цитогенетического анализа
Цитогенетический анализ животных проводят в несколько этапов:
культивирование лимфоцитов для получения достаточного количества клеток на стадиях ранней метафазы, метафазы;
фиксация клеток и приготовление препаратов хромосом;
окраска препаратов хромосом;
анализ препаратов хромосом, кариотипирование;
заключение о генетическом состоянии животного.
Культивирование лейкоцитов периферической крови
Постановка культуры клеток
Постановка культуры лейкоцитов должна происходить в стерильных условиях в культуральном боксе или в настольном ламинарном боксе.
Во взятой крови осаждают эритроциты центрифугированием в течение 5-10 мин при скорости 1000 . Образовавшийся слой лейкоцитов и плазму собирают и переносят во флаконы. Для культивирования лейкоцитов во флаконы добавляют по 5-6 мл культуральной среды, содержащей митоген, в пропорции, соответствующей типу и марке митогена, и антибиотики.
При культивировании лейкоцитов свиней в качестве митогена используют фитогемагглютинин. Для некоторых видов крупного рогатого скота, лошадей, кроликов целесообразнее использовать конконовалин А или смесь нескольких митогенов. При культивировании лейкоцитов обычно используют смесь пенициллина со стрептомицином из расчета 50-100 МЕ/мл.
Флаконы с клетками в культуральной среде плотно закрывают крышками и помещают в термостат при температуре 37,5-38,5-39,0°С на 72 ч.
Постановка культуры лейкоцитов должна происходить в стерильных условиях в культуральном боксе или в настольном ламинарном боксе.
За 1-3 ч до окончания культивирования в каждый флакон добавляется колхицин из расчета 0,35 мкг на 1 мл культуры (обычно используют маточный раствор с концентрацией 0,1 мг/мл). Завершение культивирования колхицинированных клеток проходит в термостате при заданной температуре.
Все последующие обработки клеток выполняют без соблюдения условий стерильности.
По окончании культивирования взвесь клеток центрифугируют в течение 5-10 мин при 1000 . Надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,075 М KСl, затем клетки подвергают гипотонической обработке в течение 5-15 мин при температуре 38°С, или 30-55 мин при комнатной температуре.
Фиксация клеток
После гипотонической обработки суспензию клеток центрифугируют в течение 10 мин при 1000 , надосадочную жидкость удаляют, осадок фиксируют в свежеприготовленном и охлажденном фиксаторе - смеси метанол-уксусная кислота (3:1). Клетки ресуспендируют в фиксаторе, затем центрифугируют в течение 10 мин. Фиксацию проводят 2-3 раза. Зафиксированные клетки ресуспендируют и хранят в фиксаторе в холодильнике. Сохранять зафиксированные клетки перед приготовлением препаратов можно в течение 1-3 дней. Увеличение срока хранения приводит к ухудшению качества метафазных пластинок на препаратах.
Приготовление препаратов хромосом
Перед приготовлением препаратов необходимо поменять в пробирках фиксатор. Зафиксированные клетки тщательно ресуспендируют в свежеприготовленном и охлажденном фиксаторе. Несколько капель клеточной суспензии с помощью пастеровской пипетки наносят на предметное стекло. Предметные стекла для хромосомных препаратов должны быть тщательно вымыты и затем обезжирены в растворе хромпика. Перед приготовлением препаратов стекла тщательно промываются в проточной воде и затем в нескольких сменах дистиллированной воды. Отмытые стекла охлаждают в дистиллированной воде в холодильнике.
Клеточную суспензию раскапывают на мокрое и холодное стекло и высушивают при комнатной температуре. От одного животного готовят, по возможности, от четырех до десяти стекол. Готовые препараты хранят в плотно закрытых коробках при комнатной температуре или в холодильнике, в зависимости от дальнейших обработок.
Окраска и анализ препаратов хромосом
Окраска препаратов хромосом
При анализе кариотипа сельскохозяйственных животных используют несколько типов окраски хромосом. Рутинная окраска, при которой хромосомы окрашены однородно, позволяет провести первоначальный анализ хромосомного набора животного. При обнаружении каких либо нарушений структуры или количества хромосом в наборе необходимо проводить более детальный анализ, используя методы дифференциального окрашивания. Наиболее приемлемыми вариантами дифференциальной окраски для генетической экспертизы являются G-окраска и R-окраска, позволяющие выявить четкую дисковую исчерченность строго специфичную для каждой хромосомы.
Рутинная окраска
Для рутинного анализа хромосом на световом микроскопе препараты окрашивают азур-эозином по Романовскому или красителем Гимза. Для этого препараты помещают на 6-10 мин в 2%-ный раствор красителя Гимза в фосфатном буфере , рН 6,8. Контроль окрашивания проводят под микроскопом. Окрашенные препараты промывают дистиллированной водой и высушивают. Анализировать с помощью микроскопа можно только полностью высушенные препараты, используя объективы 25 и 90.
Дифференциальная окраска G-тип
G-окраска может выполнятся несколькими методами. Наиболее приемлемым является метод Раджабли и Крюкова (1973), разработанный на основе методов Seabright (1971) и Evans et al. (1971). Препараты на 10-60 с помещают в 0,25%-ный раствор трипсина, нагретый до температуры 35°С. После обработки трипсином препараты отмывают в буфере 2-SSC (0,6 М NaCl - 0,06 М цитрат натрия), переносят в чашку Петри со свежей порцией того же буфера, и инкубируют в течение 1 ч при температуре 62°С. После инкубации препараты прямо из буфера переносят в раствор красителя Гимза, приготовленного следующим образом: 2 мл основного красителя разводят в 50 мл дистиллированной воды и добавляют 1 мл 0,1% . Препараты окрашиваются в вертикальном положении в течение 5-15 мин при контроле под микроскопом. После окрашивания препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают. Хромосомный анализ проводят на световом микроскопе при увеличении
, используя стандартные карты G-исчерченных хромосом.
Дифференциальная окраска R-типа
Дифференциальная сегментация хромосом R-типа по своей картине в точности противоположна G-сегментации: негативные диски при G-окраске соответствуют позитивным дискам при R-окраске. Варьируя температуру или рН среды при обработке препаратов, можно добиться перехода G-окрашивания в R-окрашивание. Вместе с тем R-окрашивание представляет интерес, а в ряде случаев более информативно, поскольку в отличие от G-метода интенсивно окрашиваются терминальные участки хромосом. Это позволяет получить отчетливо обозначенные концы хромосом, что важно при описании делеций и точек разрывов в хромосоме при транслокациях.
Среди ряда методов R-окрашивания наиболее информативным является RBA метод с использованием акридинового оранжевого. Принцип этого метода заключается в преимущественном окрашивании участков хромосом содержащих тимидин. Для этого за 7 ч до завершения культивирования, то есть во вторую половину s-фазы цикла клеточного деления, в культуру вводится бромдезоксиуридин (БДУ) в конечной концентрации 25 мкг/мл, который встраивается в поздно реплицирующие участки хромосом.
Для получения максимального числа дисков на хромосомах и хорошо различимого чередования позитивных и негативных дисков целесообразнее использовать для дифференциального окрашивания не метафазные, а профазные и прометафазные хромосомы. Для этого за 1-3 ч до завершения культивирования вместе с колхицином во флаконы необходимо ввести этидиум бромида в конечной концентрации 10-15 мкг/мл. Это позволяет накопить в культуре клетки, находящиеся преимущественно на ранних стадиях митоза.
Препараты для получения данного типа окрашивания высушиваются на воздухе, без применения высокой температуры, и выдерживаются при комнатной температуре в течение 10-12 дней для лучшего окрашивания хромосом.
Готовые препараты окрашиваются 0,2%-ным раствором акридинового оранжевого на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0) в течение 1-3 мин под покровным стеклом. Затем стекла промываются проточной дистиллированной водой.
Анализ препаратов с R-дифференциальной исчерченностью проводится на флуоресцентном микроскопе при увеличении и
используя стандартные карты R-исчерченных хромосом.
Анализ препаратов хромосом
Анализ препаратов хромосом проводят на световом или люминесцентном (в случае использования дифференциальной окраски хромосом) микроскопе визуально при увеличении и
, а также на микрофотографиях.
Визуальный анализ хромосом
Для визуального анализа препаратов хромосом применяют рутинную окраску по Гимза.
Метафазные пластинки для хромосомного анализа (как визуального анализа, так и для кариотипирования) должны соответствовать ряду требований. На стекле выбирают метафазные пластинки только округлой формы, с хорошо заметной границей кариоплазмы. Хромосомы должны быть равномерно распределены внутри метафазной пластинки, не должны иметь накладок и выбросов за пределы кариоплазмы. Вблизи анализируемой метафазной пластинки не должно быть единичных хромосом или групп из нескольких хромосом. Степень спирализации хромосом должна позволять достоверно идентифицировать самые маленькие хромосомы набора.
При первоначальном анализе (используется рутинная окраска по Романовскому-Гимза) в 30-40 метафазных пластинках, визуально подсчитывают число хромосом. На этом этапе подсчитывают модальное число хромосом, определяют маркерные хромосомы и генетический пол животного по составу половых хромосом. Затем фотографируют несколько типичных метафазных пластинок. На микрофотографиях проводят анализ кариотипа и подтверждают данные первоначального визуального анализа. В случае, если возникает подозрение на присутствие конституциональных аномалий или значительных спонтанных изменений кариотипа, фотографируют от 30 до 50 метафазных пластинок.
Микрофотографирование препаратов хромосом
Микрофотографирование проводят на фотопленку микрат Орто (микрат 200) или микрат 300 (в зависимости от применяемой окраски хромосом). Для проявления фотопленок и печати фотографий используют стандартные проявители и закрепители.
На основании визуального анализа дают следующие характеристики животного: модальное число хромосом; генетический пол; наличие или отсутствие конституциональных нарушений кариотипа (транслокаций, центрических слияний, делеций и инверсий хромосом); частоту гипо- и гиперплоидных клеток; частоту полиплоидных клеток; частоту клеток со спонтанными структурными аберрациями хромосом.
Эти характеристики позволяют с высокой степенью точности оценить генетическое состояние животного, наличие или отсутствие у него генетического груза и племенной ценности.
При наличии у животного конституциональных аномалий хромосом, а также при высоком уровне спонтанных нарушений кариотипа используют дифференциальное окрашивание хромосом и проводят кариотипический анализ на 30-40 микрофотографиях для каждого животного.
Кариотипический анализ
Кариотипический анализ позволяет точно идентифицировать каждую хромосому набора, определить гомологичные хромосомы и пронумеровать хромосомы, согласно стандартной номенклатуре кариотипа.
В зависимости от предполагаемого типа аномалии хромосом выбирают один из предложенных типов дифференциального окрашивания. Если предполагаются нарушения дистальных участков хромосом, то необходимо использовать дифференциальную окраску R-типа.
При кариотипическом анализе используют карты дифференциально исчерченных хромосом стандартного кариотипа. Дифференциальный рисунок каждой хромосомы исследуемого животного сопоставляют со стандартным рисунком, находят гомологичные хромосомы и присваивают каждой паре хромосом порядковый номер.
Кариотипический анализ позволяет точно определить у каждого животного: модальное число хромосом; генетический пол; наличие или отсутствие хромосомных аберраций; номер и участок хромосомы, с точностью до одного диска, затронутой обнаруженной аберрацией; частоту гипо- и гиперплоидных клеток; номера утраченных или дополнительных хромосом в клетке; частоту клеток со спонтанными структурными аберрациями хромосом; номер хромосомы со структурной аберрацией и точное местоположение измененного участка хромосомы.
5.4. Описание хромосомного набора крупного рогатого скота
Кариотип крупного рогатого скота состоит из 60 хромосом, 29 пар аутосом и половые хромосомы - 2n = 60, XY. Все аутосомы данного кариотипа представлены акроцентрическими хромосомами, постепенно убывающих в размерах. Поэтому идентификация отдельных аутосом крупного рогатого скота при рутинной окраске невозможна, для идентификации хромосом применяют дифференциальную окраску. X хромосома - крупный субметацентрик, у-хромосома - самая маленькая хромосома - субметацентрик. Эти хромосомы возможно идентифицировать при рутинной окраске. При рутинной окраске возможно идентифицировать только половые хромосомы: Х-хромосому - крупный субметацентрик и у-хромосому - самая маленькая хромосома набора. Идентификация отдельных аутосом крупного рогатого скота при рутинной окраске невозможна. Для идентификации всех хромосом набора применяют дифференциальную окраску.
Для идентификации каждой дифференциально исчерченной хромосомы используют карты стандартного кариотипа, издаваемые Международной конференцией по стандартизации кариотипов животных.
5.5. Необходимое оборудование
1. Одноразовые стерильные шприцы и иглы.
2. Центрифуга.
3. Стерильный культуральный бокс или настольный ламинарный бокс.
4. Термостат.
5. Холодильник.
6. Малое лабораторное оборудование (водоструйный насос, вортекс, вариационные пипетки, пинцеты, контейнеры для окрашивания препаратов, стерилизаторы, медицинские шприцы типа "Рекорд" на 20-10-5 мл, инъекционные и специальные медицинские иглы, одноразовые шприцы и иглы, маркеры для химической посуды, парафильм).
7. Лабораторные аналитические весы.
8. Лабораторный аналитический микроскоп.
9. Дистиллятор.
10. Лабораторная посуда (колбы вместимостью 100-500 мл, химические стаканы 50-800 мл, мерные цилиндры 10-100 мл, пробирки, чашки Петри).
11. Предметные стекла.
12. Покровные стекла.
13. Фотооборудование (фотоувеличитель, красный фонарь, бачки для проявления фотопленки, кюветы для печатания фотоснимков, аппарат для сушки фотоснимков).
5.6. Нормы и стоимость цитогенетического анализа
Нормы (в расчете на 1 чел.-день, головы)
5.7. Выходные документы
1. Протокол цитогенетического исследования.
2. Генетический паспорт.
Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Правила генетической экспертизы племенного материала крупного рогатого скота
Текст правил приводится по изданию Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (Москва, 2003 г.)
Правила разработали:
член-корр. РАСХН, д-р с.-х. наук И.М. Дунин,
д-р биол. наук А.А. Новиков, канд. вет. наук Н.И. Романенко,
канд. биол. наук Е.Д. Амбросьева, д-р биол. наук Э.К. Бороздин,
д-р биол. наук Л.А. Калашникова, канд. биол. наук А.Н. Завада
(ВНИИплем), канд. с.-х. наук С.А. Данкверт, В.В. Шапочкин,
д-р с.-х. наук X.А. Амерханов (Минсельхоз России) с использованием материалов, представленных ВНИИплем, ВИЖ, ВНИИРГЖ, СибНИПТИЖ, лабораториями иммуногенетики ГУПКК "Крайплемсервис", ФГУП "Московское" и ФГУП "Марийское" по племенной работе.
Рассмотрены и одобрены на Научно-техническом совете Министерства сельского хозяйства РФ (протокол N 27 от 29 октября 2002 г.)