Методические указания МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 5 декабря 2003 г.) (утратили силу)

1.3. Эпидемиология

Методические указания МУ 1.3.1794-03
"Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 5 декабря 2003 г.)

ГАРАНТ:

Настоящие методические указания признаны утратившими силу в связи с введением Методических указаний МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности", утвержденных Роспотребнадзором, Главным государственным санитарным врачом РФ 22 декабря 2009 г.

Дата введения:

с момента утверждения

Введены впервые

1. Область применения

1.1. Методические указания предназначены для органов и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы, а также могут быть использованы юридическими лицами, независимо от организационно-правовых форм и форм собственности и индивидуальными предпринимателями, выполняющими в установленном порядке работы с объектами и материалами, содержащими или подозрительными на содержание микроорганизмов I - II групп патогенности:

- диагностические (исследование объектов окружающей среды и клинического материала, в том числе от больных с подозрением на ТОРС);

- экспериментальные;

- производственные (работы по производству и контролю генодиагностических препаратов при условии соблюдения требований GMP).

1.2. Методические указания определяют принципы организации лабораторий и этапы выполнения ПЦР-анализа: взятие проб, первичная обработка, хранение, условия транспортирования, обеззараживание материала, выделение нуклеиновых кислот, проведение ПЦР (ОТ-ПЦР), учет и регистрация результатов при исследовании биологического материала, пищевых продуктов, материала из объектов окружающей среды.

1.3. Методические указания регламентируют выполнение исследований с использованием ПЦР-анализа, осуществляемого сертифицированными тест-системами и оборудованием и предусматривающего учет результатов методом электрофореза или гибридизационно-ферментного анализа (ГиФА).

2. Нормативные ссылки

2.1. Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)" СП 1.3.1285-03.

2.2. Санитарно-эпидемиологические правила "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I - IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами" СП 1.2.1318-03.

2.3. Санитарные правила и нормы "Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений" СанПиН 2.1.7.728-99.

2.4. Методические указания "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I - IV групп патогенности, при работе методом ПЦР" МУ 3.5.5.1034-01 - М., 2001.

2.5. "Методические указания по детекции патогенной микрофлоры в клиническом материале, пищевых продуктах, объектах внешней среды и генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции". Госкомсанэпиднадзор, от 18.10.96 N 01-19/123-17 .

2.6. Методические указания "Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды". МЗ СССР от 01.09.86 г. и Госагропром СССР от 01.09.86 г.

2.7. Методические указания "Лабораторная диагностика холеры" МУ 4.2.1097-02-М.-2002.

ГАРАНТ:

Взамен МУ 4.2.1097-02 с 1 августа 2007 г. введены Методические указания МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика холеры", утвержденные Главным государственным санитарным врачом РФ 31 мая 2007 г.

2.8. Методические указания "Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза у людей" МУ 3.1.7.1189-03 - М., 2003.

2.9. Методические указания "Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих - переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций" МУ 3.1.1027-01 - М., 2002.

2.10. "Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции" - М., 1995.

2.11. Временные методические рекомендации "Лабораторная диагностика "атипичной пневмонии" (SARS) методом ПЦР", утв. Минздравом России 03.05.2003 г.

2.12. Руководство по профилактике чумы. - Саратов: Изд-во Слово, 1992.

2.13. Руководство "Использование ультрафиолетового излучения для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях". Р 3.1.683-98, МЗ РФ.

ГАРАНТ:

Взамен вышеназванного Руководства действует Руководство Р 3.5.1904-04 "Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях", утвержденное Главным государственным санитарным врачом РФ 4 марта 2004 г.

2.14. Инструкция по проектированию санитарно-эпидемиологических станций СН 535-81. - М.: Стройиздат, - 1982.

3. Общие положения

3.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амплификации (многократном увеличении числа копий) фрагмента ДНК-мишени в условиях in vitro и позволяет обнаружить специфичный участок генома микроорганизма.

3.2. Аналитическая чувствительность тест-систем для выявления ДНК (РНК) микроорганизмов методом ПЦР составляет 1 x 10(2) - 1 х 10(4) м.к. (геномных эквивалентов)/мл, специфичность - 85-100%, возможно исследование любого биологического материала и объектов окружающей среды, время выполнения анализа 4-8 ч.

3.3. Для выявления ДНК (РНК) микроорганизмов I-II групп патогенности анализ используют:

- в качестве экспрессного метода при исследовании материала от больного (подозрительного на заболевание) и индикации патогенных биологических агентов (ПБА) в объектах окружающей среды;

- как ускоренный предварительный тест при выполнении культурального и биологического методов исследования и для идентификации подозрительных культур;

- для определения эпидемиологической значимости изолятов на основании выявления генетических маркеров вирулентности, например, ctxA и tcpA генов у возбудителя холеры;

- эпидемиологического мониторинга;

- в научных целях для генотипирования штаммов или их ретроспективного анализа.

4. Требования к организации работ

4.1. Проведение исследований по выявлению ДНК (РНК) микроорганизмов I-II групп патогенности сопряжено с необходимостью одновременного обеспечения правил биологической безопасности работ и требований к организации и проведению ПЦР-анализа с целью предотвращения контаминации исследуемых проб нуклеиновыми кислотами (НК).

4.2. Противоэпидемический режим работы при ее организации и выполнении должен быть обеспечен в соответствии с СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)", регламентирующими работу с микроорганизмами I-II групп патогенности.

4.3. Все этапы исследования материала, зараженного или подозрительного на зараженность вирусами I группы, проводят в условиях максимально изолированных лабораторий с использованием изолирующих средств индивидуальной защиты или в боксах биологической безопасности III класса в защитном костюме IV типа, дополненном резиновыми перчатками.

4.4. Исследования материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности, методом ПЦР проводят в организациях, имеющих лицензию на деятельность, связанную с возбудителями инфекционных заболеваний человека, в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения соответствующих работ (с указанием конкретных видов микроорганизмов). В этой же лаборатории могут проводиться ПЦР-исследования с микроорганизмами III - IV групп патогенности.

ГАРАНТ:

См. также Методические указания МУ 1.3.1888-04 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III - IV групп патогенности", утвержденные Главным государственным санитарным врачом РФ 4 марта 2004 г.

4.5. Допускается проведение исследований крови методом ПЦР на бруцеллез, парентеральные вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекцию в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с возбудителями III группы патогенности, выданное в установленном порядке.

4.6. Передачу исследуемого материала в другие организации проводят в соответствии с п.п. 2.1.2 и 2.8.20 СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

4.7. Работу по ПЦР-диагностике организует специалист с высшим образованием, прошедший обучение на лицензированных курсах специализации (повышения квалификации) по работе с ПБА I-II групп патогенности и по ПЦР-диагностике.

5. Требования к помещению и оборудованию ПЦР-лабораторий

5.1. Помещения, в которых проводят исследования на наличие НК микроорганизмов I-II групп патогенности, размещают в "заразной" зоне лаборатории, проводящей диагностические и другие исследования с указанными микроорганизмами. При наличии возможности помещения располагают в виде отдельного блока. При строительстве новых или реконструкции имеющихся помещений лабораторию ПЦР размещают в отдельно стоящем здании (изолированной части здании) с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" и учетом особенностей устройства вентиляционной системы ПЦР-лаборатории, изложенных в п. 5.19 настоящих методических указаний.

5.2. Рабочая зона ПЦР-лаборатории в соответствии с этапами ПЦР-анализа должна включать следующий минимальный набор последовательно расположенных самостоятельных помещений (приложение 1) или отдельно выделенных рабочих зон (в составе других функциональных помещений):

- приема, разборки, первичной обработки материала;

- подготовки проб, выделения нуклеиновых кислот (НК);

-приготовления реакционных смесей, проведения ПЦР и обратной транскрипции (ОТ);

- учета результатов методом электрофореза или ГиФА.

5.3. Комнату выделения НК располагают вблизи от комнаты приема материала, а помещение для учета результатов - по возможности в отдалении от других перечисленных помещений для обеспечения условий, исключающих занос в них продуктов амплификации (ампликонов) с воздушным потоком.

5.4. Не допускается выполнение ПЦР-исследований в помещениях для проведения работ с использованием культуральных (накопление патогенных биологических агентов) и генно-инженерных методов, в том числе связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид.

5.5. Зону приема, регистрации, сортировки, первичной обработки материала (объединение или разделение проб, центрифугирование, инактивацию и т.д.) располагают в комнате приема материала блока для работы с инфицированными животными или в отдельной боксированной комнате. В этих же помещениях может проводиться обработка проб к другим видам исследований (бактериологическое, вирусологическое, серологическое и т.д.). При наличии возможности в помещении устанавливают бокс биологической безопасности III класса защиты (допускается также использование бокса 2ШНЖ, например, фирмы "Изотоп" и др.) или бокс безопасности II класса защиты.

5.6. Зону по подготовке проб и выделению нуклеиновых кислот размещают в боксированием помещении (микробиологический бокс с пред-боксом) или в комнате заражения и вскрытия животных. Работу проводят в боксе биологической безопасности II или III класса. В рабочей зоне располагают оборудование и предметы, необходимые только для предварительной обработки, выделения НК (примерный перечень представлен в приложении 2).

5.7. Зону приготовления реакционных смесей и проведения ОТ и ПЦР-амплификации располагают в боксированием помещении или боксе биологической безопасности II класса (или ПЦР-бокса) - для подготовки реакционных смесей для ОТ и ПЦР.

5.8. Работу по подготовке реакционных смесей для ПЦР и ОТ - ПЦР проводят до доставки в бокс проб, поступающих из зоны выделения НК. Смесь может быть приготовлена также за пределами помещений лаборатории, предназначенных для работы с заразным материалом, например, в комнате (боксе) для розлива питательных сред.

5.9. При необходимости этап подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот может выполняться в одной комнате с этапом ПЦР при наличии в ней бокса биологической безопасности II или III класса защиты для выделения НК и бокса биологической безопасности II класса (или ПЦР-бокса) - для подготовки реакционных смесей для ОТ и ПЦР. Каждый бокс рассматривается как соответствующая рабочая зона.

5.10. Зону детекции результатов располагают в боксированием помещении. При отсутствии боксированного помещения работу проводят в отдельной комнате, при возможности в ПЦР-боксе.

5.11. При одновременном использовании двух методов детекции продуктов амплификации - электрофоретического и ГиФА - следует выделить отдельные помещения или две рабочие зоны. Оборудование и принадлежности для каждого вида анализа маркируют применительно к каждой зоне. Обмен посудой и пипетками между зонами не допускается.

5.12. Помещения ПЦР-лаборатории покрывают кафелем (пол, стены) или масляной краской (стены, потолок), устойчивой к действию моющих и дезинфицирующих средств.

5.13. Во всех помещениях устанавливают бактерицидные лампы. Рекомендуется дополнительная установка переносного ультрафиолетового бактерицидного облучателя-рециркулятора.

5.14. Окна должны быть плотно закрыты. Для защиты рабочих столов от попадания прямого солнечного света используют светозащитные пленки из материала, устойчивого к дезинфицирующим средствам. Использование жалюзи не рекомендуется из-за адсорбции пыли.

5.15. Каждая рабочая зона должна иметь свой набор мебели, лабораторного оборудования, реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, защитной одежды, обуви, резиновых перчаток, уборочного инвентаря и пр., используемых только в данной комнате (рабочей зоне).

5.16. Имущество каждой рабочей зоны должно иметь маркировку указанной зоны. Применение его в других помещениях или для других видов исследований не допускается.

5.17. В рабочих зонах должен быть свой набор холодильников (приложение 2):

- в комнате приема материала от 4 до 8°С, минус 20°С и минус 70°С (при необходимости длительного хранения материала);

- в комнате выделения нуклеиновых кислот от 4 до 8°С и минус 20°С для хранения набора выделения НК; от 4 до 8°С - для хранения препаратов НК; не допускается хранение проб материала или препаратов НК в одном холодильнике с компонентами набора для выделения НК;

- в комнате ПЦР-амплификации от 4 до 8°С и минус 20°С - для хранения наборов обратной транскрипции и амплификации НК;

- в комнате детекции продуктов амплификации от 4 до 8°С - для хранения наборов электрофоретической детекции и ГиФА.

5.18. Помещения ПЦР-лаборатории оборудуют приточно-вытяжной или вытяжной вентиляцией, соответствующей требованиям п.п. 2.3.16. и 2.4.3. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

5.19. При выполнении ПЦР воздухообмен внутри и между помещениями может повышать опасность контаминации проб из-за вероятности проникновение молекул НК и продуктов амплификации через фильтры. Снижение этой опасности достигается указанной ниже системой вентиляции лаборатории:

- следует полностью исключить воздухообмен между помещением для детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) и остальными комнатами ПЦР-лаборатории, а также другими помещениями организации (давление воздуха в пост-ПЦР-помещении должно быть ниже, чем в указанных помещениях);

- при смежном расположении комнаты приема материала и комнаты выделения нуклеиновых кислот давление в последней должно быть не ниже, чем в комнате приема материала;

- если обе названные комнаты, входящие в пре-ПЦР-помещение, имеют смежное расположение с помещением для проведения ПЦР, давление воздуха в них должно быть ниже, чем в ПЦР-помещении; при отдаленном размещении ПЦР-помещения давление воздуха в нем должно быть не ниже, чем в пре-ПЦР-помещении.

5.20. Разница в давлении воздуха в помещениях ПЦР-лаборатории создается за счет различий в кратности воздухообмена в них. Расчеты кратности воздухообмена с учетом требований проведения ПЦР-анализа и требований "Инструкции по проектированию санитарно-эпидемиологических станций" СП 535-81. - М.: Стройиздат, - 1982, приведены в таблице:

Наименование помещения	Кратность воздухообмена (куб. м/час)
	приток	вытяжка
Зона приема и первичной обработки материала	5	6
Зона подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот	5	6
Зона приготовления реакционных смесей, проведения ПЦР и ОТ-ПЦР	5	5
Зона учета результатов методом электрофореза или ГиФА	5	7

5.21. При отсутствии системы вентиляции, указанной в пп. 5.18 - 5.19, уменьшение вероятности контаминации проб достигается мерами по ограничению воздухообмена между помещениями ПЦР-лаборатории.

5.22. При необходимости в ПЦР-лаборатории могут быть установлены кондиционеры в соответствии с п. 2.4.5. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

6. Требования к проведению работ

6.1. Взятие материала производят согласно инструктивно-методическим документам, регламентирующим выполнение исследований для каждого вида возбудителя инфекций (приложение 3), инструкциям к тест-системам и в соответствии с СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

6.2. Транспортирование исследуемого материала и промежуточных продуктов ПЦР-анализа из одного помещения в другое при невозможности передачи их в смежные комнаты через шлюзовые передаточные окна, осуществляют в плотно закрывающихся контейнерах, обрабатываемых дезинфицирующими средствами после каждого переноса проб.

6.3. Доставку проб для исследования, а также их хранение осуществляют в закрывающихся металлических или пластмассовых контейнерах, на дне которых размещают адсорбирующий материал (марлевая салфетка, ткань, вата и пр.), смоченный раствором дезинфицирующего средства. Контейнер помещают в сумку-холодильник или в контейнер с хладагентами.

6.4. Манипуляции, сопровождающиеся риском образования аэрозоля (встряхивание, центрифугирование и т.д.), при обработке материала и выделении нуклеиновых кислот выполняют в боксах биологической безопасности II или III класса.

6.5. Приборы, оборудование и средства измерения, должны быть аттестованы (поверены), технически исправны, иметь технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации.

6.6. Наконечники должны строго соответствовать автоматическим пипеткам, пробирки для амплификации - термоциклерам (в соответствии с инструкцией фирмы-производителя прибора). Обязательной является смена наконечников для автоматических пипеток после завершения каждой манипуляции.

7. Требования к защитной одежде

7.1. Выбор типа защитного костюма проводится в строгом соответствии с СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" и определяется видом возбудителя, рабочей зоной ПЦР, оснащением ее боксами биологической безопасности (приложение 3).

7.2. Прием и первичную обработку материала, доставленного на исследование (объединение или разделение проб, центрифугирование, инактивацию и т.д.), выполняют в защитном костюме I-II или IV типа, дополненном перчатками и, при необходимости, респиратором.

7.3. В помещении подготовки проб и выделения НК, при исследовании материала, инфицированного бактериями I-II групп, подвергнутыми инактивации на этапе подготовки проб, работу проводят в боксе биологической безопасности II класса в костюме IV типа, дополненном резиновыми перчатками.

7.4. В связи с отсутствием регламентированных методов инактивации вирусов II группы работу с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями КГЛ, ТОРС, ГЛПС, ОГЛ, проводят в боксе биологической безопасности III класса защиты в костюме IV типа в резиновых перчатках или в боксе биологической безопасности II класса в костюме I типа. Работу с другими вирусами II группы проводят в боксе биологической безопасности II класса в защитном костюме IV типа, дополненном резиновыми перчатками и респиратором.

7.5. На этапах проведения ПЦР, учета результатов работу проводят в следующих видах защитной одежды:

- с обеззараженным материалом - в костюме IV типа, дополненном резиновыми перчатками;

- с пробами, инфицированными возбудителями КГЛ, ТОРС, ГЛПС, ОГЛ - в костюме I типа или в боксе биологической безопасности II класса в костюме IV типа, дополненного резиновыми перчатками и респиратором. Работу с другими вирусами II группы проводят в защитном костюме IV типа, дополненном респиратором и резиновыми перчатками.

7.6. В пост - ПЦР-помещении должны работать сотрудники, не занятые на этапах подготовки проб и постановки ПЦР, при входе в помещение надевают бахилы или сменную обувь.

7.7. Надевание и снятие защитной одежды производят в предбоксах. В каждом из них должен быть отдельный комплект защитной одежды и обуви.

7.8. Наиболее загрязненной продуктами амплификации считается защитная одежда зоны детекции и в первую очередь - резиновые перчатки. Перед снятием одежды необходимо заменить перчатки на чистые.

7.9. Обработку одежды из комнат подготовки проб, ПЦР-амплификации и учета результатов проводят раздельно.

8. Требования к обработке помещений и обеззараживанию материала

8.1. Обработку помещений проводят в соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)". В комнатах, в которых проводят работу с выделенными НК, рабочие поверхности, штативы, оборудование следует обеззараживать ежедневно ультрафиолетовым излучением в течение 1 часа до начала работы и после нее, полы подвергают ежедневной влажной уборке дезинфицирующими средствами, регламентированными указанными санитарными правилами или 0,2% раствором ДП-2Т, обладающим также способностью инактивировать ампликоны. Перед началом работы рабочую поверхность столов дополнительно обрабатывают 70% этиловым спиртом. Ежемесячно проводят профилактическую обработку рабочей поверхности столов, оборудования, штативов 0,2% раствором ДП-2Т.

8.2. Дважды в год (при необходимости чаще) осуществляют обработку автоматических дозаторов. Дозаторы разбирают, обрабатывают моющим раствором для удаления жирового загрязнения, после чего остатки моющего средства удаляются ветошью, смоченной водой. Затем проводят обработку 1 N соляной кислотой; время экспозиции - 1 час. Остатки раствора тщательно удаляют ветошью, смоченной водой, и проводят обеззараживание влажных поверхностей ультрафиолетовым излучением в течение 1 часа. По окончании обработки дозаторы собирают и проводят калибровку в соответствии с прилагаемой инструкцией по пользованию дозаторами. Автоклавируемые дозаторы обеззараживают паром под давлением 2,0 кГс/см2 (0,2 МПа) - при температуре 132+-2°С, в течение 60 минут.

8.3. Обеззараживание проб проводят в соответствии с МУ 3.5.5.1034-01 "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности, при работе методом ПЦР". Порядок обеззараживания проб и режимы дезактивации при постановке ПЦР представлены в приложениях 4 и 5.

8.4. При возникновении контаминации (получении повторных положительных результатов в отрицательных контролях, а также при тестировании контрольных смывов) в помещениях проводят мероприятия по ликвидации контаминации. Объем мероприятий зависит от масштаба контаминации, определяемого результатами исследования смывов (приложение 6). Проведение ПЦР-исследований до завершения деконтаминационных мероприятии не допускается.

9. Проведение внутрилабораторного контроля

9.1. Внутрилабораторный контроль проводят с периодичностью, зависящей от объема выполняемой работы и определяемой руководителем лаборатории.

9.2. Контроль осуществляют путем исследования шифрованных "положительных" и "отрицательных" проб. В качестве "положительных" могут использоваться образцы, искусственно контаминированные НК, или уже ранее исследованные пробы, хранившихся не более 1 недели при температуре минус 20°С. В этих пробах определяют НК тех же возбудителей, что и при первичном исследовании. В качестве "отрицательных" применяют образцы, не содержащие НК возбудителей инфекционных заболеваний, например, транспортная среда, ДНК-буфер.

9.3. Количество проб должно быть достаточным для оценки работы сотрудников и выявления контаминированных участков лаборатории.

9.4. Для выявления возможной контаминации лаборатории нуклеиновыми кислотами контроль проводят путем взятия смывов с поверхностей (приложение 6).