Методические указания МУК 4.2.801-99 "Методы микробиологического контроля парфюмерно-косметической продукции" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 27 декабря 1999 г.)

Методические указания МУК 4.2.801-99
"Методы микробиологического контроля парфюмерно-косметической продукции"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 27 декабря 1999 г.)

Дата введения - с момента утверждения

Введены впервые

1. Общие положения

1.1. Настоящие методические указания предназначены для обеспечения контроля качества парфюмерно-косметических изделий по микробиологическим показателям, введенным СанПиН 1.2.631-97 "Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-косметической продукции", и устанавливают методы лабораторных испытаний качества парфюмерно-косметической продукции по микробиологическим показателям безопасности для здоровья человека, проводимых в порядке производственного контроля, государственного санитарно-эпидемиологического надзора и при испытании указанной продукции в целях сертификации соответствия.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца и далее по тексту допущена опечатка. Имеется в виду "СанПиН 1.2.681-97"

1.2. Методические указания предназначены для использования в аккредитованных бактериологических производственных, испытательных лабораториях и лабораториях организаций государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации и позволяют проводить контроль на соответствие СанПиН 1.2.631-97 "Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-косметической продукции".

1.3. Данный документ разработан в связи с необходимостью унификации и усовершенствования методов микробиологического анализа парфюмерно-косметической продукции.

Методы адаптированы к условиям работы лабораторий, осуществляющих контроль качества и безопасности парфюмерно-косметической продукции.

1.4. Настоящие методические указания должны учитываться при пересмотре действующей и разработке вновь создаваемой нормативной документации на парфюмерно-косметическую продукцию.

2. Нормативные ссылки

2.1. Закон Российской Федерации "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30.03.99 N 52-ФЗ.

2.2. Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 15.06.94 N 625.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Дату названного постановления следует читать как "5.06.94"

2.3. Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе РФ, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 30.06.98 N 680.

3. Методы отбора и подготовки проб для микробиологического анализа

3.1. Отбор проб

3.1.1. При отборе проб следует руководствоваться требованиями ГОСТ 29188.0-91 "Парфюмерно-косметические изделия. Правила приемки, отбор проб, методы органолептических испытаний" и ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических анализов".

ГАРАНТ:

В соответствии с приказом Росстандарта от 30 ноября 2010 г. N 596-ст. ГОСТ 26668-85 не применяется на территории РФ с 1 января 2012 г. и введен в действие ГОСТ Р 54004-2010

3.1.2. Пробы парфюмерно-косметических изделий для микробиологического анализа отбирают до отбора проб для физико-химических, органолептических и других видов испытаний с соблюдением правил асептики, для того чтобы исключить вторичное микробное загрязнение продукта.

3.1.3. От каждой партии парфюмерно-косметических изделий, подлежащих контролю, следует брать не менее трех единиц изделий в потребительской таре (упаковке), которая не должна иметь следов повреждений.

3.1.4. При испытаниях на стерильность от каждой партии парфюмерно-косметических изделий, независимо от ее объема, отбирают 10 ампул или 10 других единиц упаковки.

3.1.5. Пробу, отобранную от отдельной единицы упаковки, называют разовой. Количество продукта в разовых пробах из каждой единичной упаковки должно быть одинаковым. Разовые пробы соединяют, перемешивают и составляют среднюю пробу.

3.2. Подготовка проб к анализу

3.2.1. Подготовка проб для определения микробиологической чистоты

3.2.1.1. Перед вскрытием упаковки место соединения крышки с тарой обрабатывают 70%-ным раствором этилового спирта. Первую порцию в количестве примерно 10% содержимого упаковки отбрасывают, затем отбирают пробы и переносят в стерильную колбу или флакон вместимостью 100-200 см3.

3.2.1.2. Для испытания готовят среднюю пробу не менее 15 г (см3) из упаковок, отобранных по п. 3.1.3, и состоящую из равных разовых проб. Такое же количество упаковок используют и для повторных испытаний. В случае, если масса (объем) парфюмерно-косметического средства в единичной упаковке менее 5 г (см3), содержимое исследуют полностью или используют большее количество упаковок.

3.2.1.3. (5,0+-0,1) г (см3) или (10,0+-0,1) г (см3) средней пробы отбирают стерильно и помещают в стеклянные колбы или флаконы, содержащие соответственно (45+-1) см3 или (90+-1)см3 1%-ного раствора твина-80 в физиологическом растворе (п. 6.4.2). Смесь тщательно перемешивают в течение 15-30 мин до полной гомогенизации (либо помещают на аппарат для встряхивания). При необходимости пробы прогревают на водяной бане или в термостате до 40-45°С, но не более 10 мин. Для гомогенизации продукции, плохо растворимой в воде, используют стеклянные бусы.

Эмульсии типа вода-масло подготавливают аналогичным способом, используя 4%-ный раствор твина-80 в физиологическом растворе (п. 6.4.2) и предварительно (до встряхивания) прогревая на водяной бане или в термостате до 40-45°С в течение 20 мин.

Получают смесь, в 10 г (см3) которой содержится 1 г (см3) парфюмерно-косметического средства - первое разведение 1:10 (10(-1)). При необходимости делают последующие десятикратные 1:100 (10(-2)) и 1:1000 (10(-3)) разведения.

3.2.1.4. Полученные разведения используют для посевов. Время с момента окончания подготовки пробы до начала высева не должно превышать 30 мин.

3.2.1.5. Определение собственной антимикробной активности парфюмерно-косметической продукции.

Метод основан на подавлении роста тест-штаммов микроорганизмов под действием испытуемого парфюмерно-косметического средства. В качестве тест-штаммов используют Bacillus subtilis АТСС 6633 (или Bacillus cereus ATCC 10702), Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (или Pseudomonas aeruginosa ГИСК 453), Staphylococcus aureus ATCC 6538-P и культуру Candida albicans ATCC 885-653.

Определение собственной антимикробной активности проводится для парфюмерно-косметических средств, в состав которых входят консерванты и другие вещества, обладающие антимикробным действием.

Собственная антимикробная активность определяется однократно для каждой конкретной рецептуры парфюмерно-косметического средства.

Культуры Bacillus subtilis (Bacillus cereus), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus выращивают на одной из жидких сред по п. 6.4.11.1 или п. 6.4.11.2 при температуре (37+-1)°С в течение (19+-1) ч. Культуру Candida albicans выращивают на жидкой среде Сабуро по п. 6.4.8.1 при температуре (30+-1)°С в течение (48+-3) ч.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо "п. 6.4.8.1" имеется в виду

"п. 6.4.8"

Из каждой выросшей культуры готовят взвесь микроорганизмов, добавляя физиологический раствор по п. 6.4.1 в соотношении 1:1000.

В пробирки вносят по 1 см3 первого разведения испытуемой пробы парфюмерно-косметического средства по п. 3.2.1.3 и добавляют:

- в пробирку N 1 - 10 см3 буферного раствора по п. 6.4.16 и 1 см3 взвеси Bacillus subtilis (Bacillus cereus);

- в пробирку N 2 - 10 см3 буферного раствора по п. 6.4.16 и 1 см3 взвеси Candida albicans;

- в пробирку N 3 - 10 см3 одной из питательных сред по п. 6.4.9 и 1 см3 взвеси Escherichia coli;

- в пробирку N 4 - 10 см3 одной из питательных сред по п. 6.4.11 и 1 см3 взвеси Pseudomonas aeruginosa;

- в пробирку N 5 - 10 см3 одной из питательных сред по п. 6.4.13 и 1 см3 взвеси Staphylococcus aureus.

Контролем служат пробирки с питательными средами и соответствующими тест-штаммами, в которые вместо испытуемого парфюмерно-косметического средства вносят то же количество стерильной дистиллированной воды.

Посевы инкубируют при (30+-1)°С в течение (48+-3) ч.

В случае отсутствия роста тест-штаммов микроорганизмов на соответствующих питательных средах отмечают антимикробное действие испытуемого средства.

Для устранения антимикробного действия входящих в состав парфюмерно-косметических средств консервантов или веществ, обладающих антимикробным действием, среднюю пробу в количестве (5,0+-0,1) г (см3) или (10,0+-0,1) г (см3) отбирают стерильно и помещают в стеклянные колбы или флаконы, содержащие соответственно (45+-1) см3 или (90+-1) см3 4%-ного раствора твина-80 в физиологическом растворе, или увеличивают разведение испытуемой пробы.

Дальнейшие испытания проводят в соответствии с п. 4.

3.2.2. Подготовка проб к анализу на стерильность

Испытание парфюмерно-косметических средств на стерильность проводят методом прямого посева или методом мембранных фильтров.

Метод мембранных фильтров не применим для суспензий или гомогенатов парфюмерно-косметических средств, загрязняющих при фильтрации поры фильтров.

3.2.2.1. Перед вскрытием ампулы с парфюмерно-косметической продукцией обрабатываются этиловым спиртом. Шейка ампулы осторожно прогревается в пламени горелки. На хорошо прогретую шейку ампулы капают 1 каплю стерильного физиологического раствора (п. 6.4.1). Ампулы осторожно вскрывают по месту образовавшейся в стекле трещины.

3.2.2.2. Содержимое 10 ампул или 10 других упаковок объединяют в единую пробу. Из объединенной пробы отбирают стерильно (5,0+-0,1) г (см3) или (10,0+-0,1) г (см3) парфюмерно-косметического средства.

При испытаниях методом прямого посева отобранные пробы непосредственно засевают в соответствующие питательные среды.

При испытаниях методом мембранных фильтров отобранные пробы помещают в стеклянные колбы или флаконы, содержащие соответственно (45+-1) см3 или (90+- 1) см3 стерильного 1%-ного раствора твина-80 в физиологическом растворе, предварительно пропущенного через мембранный фильтр с размером пор (0,45 +-0,02) мкм. Пробы тщательно перемешивают в течение 15-20 мин до полной гомогенизации.

При испытании масляных растворов пробы подготавливают аналогичным способом, используя 4%-ный раствор твина-80 в физиологическом растворе и предварительно (до встряхивания) прогревая на водяной бане или в термостате до 40-45°С в течение 20 мин.

4. Методы анализа

При микробиологическом контроле парфюмерно-косметической продукции используют стандартизованные методы микробиологического посева. Определяют следующие группы микроорганизмов: мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы; дрожжи, дрожжеподобные и плесневые грибы; бактерии семейства Enterobacteriaceae; бактерии вида Staphylococcus aureus; бактерии вида Pseudomonas aeruginosa.

В микробиологических лабораториях, осуществляющих контроль качества и безопасности парфюмерно-косметической продукции, допускается применение импедансного метода в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.590-96 "Бактериологические исследования с использованием экспресс-анализатора "Бак Трак 4100", утвержденными 18.11.96. Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора. Использование прибора "Бак Трак 4100" позволяет сократить время испытаний и получить результат через 6-8 ч после начала исследований. Прибор аттестован и внесен в Государственный реестр (N 14313-94).

4.1. Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий

4.1.1. Сущность метода

Метод основан на выявлении и количественном подсчете всех выросших колоний микроорганизмов при культивировании посевов в аэробных условиях при температуре (30+-1)°С в течение (72+-3) ч и пересчете их количества на 1 г (см3) исследуемого продукта.

4.1.2. Проведение анализа

Для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий выбирают те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 15 и не более 300 колоний.

Посев осуществляют глубинным или двухслойным агаровым методами.

4.1.2.1. Метод глубинного посева

По 1 см3 исследуемого материала из разведений, приготовленных по п. 3.2.1.3, высевают параллельно в две чашки Петри для каждого разведения. При посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывают и посевной материал вносят на дно чашки. Не позже чем через 15 мин после внесения материала, его заливают 15-20 см3 одной из сред по п. 6.4.7, предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45+-1)°С. Чашки с посевами, залитыми питательной средой, осторожно вращают, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей питательной среде. Затем чашки с посевами оставляют на горизонтальной поверхности до полного застывания питательной среды.

После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и термостатируют при температуре (30+- 1)°С в течение (72+-3) ч.

4.1.2.2. Двухслойный агаровый метод

По 1 см3 исследуемого материала из разведений, приготовленных по п. 3.2.1.3, вносят в каждую из двух пробирок с 4 см3 одной из сред по п. 6.4.7, предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45+-1)°С. Быстро перемешивают содержимое пробирок и переносят в чашки Петри с застывшей средой, распределяя его равномерно по поверхности среды.

После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и термостатируют при температуре (30+-1)°С в течение (72+-3) ч.

4.1.2.3. Обработка результатов

Просмотр посевов осуществляется каждый день.

Результаты оцениваются по каждой пробе отдельно.

Подсчитывают количество колоний на тех чашках, где их выросло от 15 до 300, суммируют и находят среднее арифметическое из них.

Допускается учитывать колонии с помощью лупы с 5(х) увеличением.

Полученное среднее арифметическое число колоний округляют следующим образом:

- если число меньше 100 - его округляют до ближайшего числа, кратного 5;

- если число больше 100 и его последняя цифра 5 - его округляют до ближайшего числа, кратного 20;

- если число больше 100 и его последняя цифра не 5 - его округляют до ближайшего числа, кратного 10.

Количество микроорганизмов в 1 г продукта (X) вычисляют по формуле:

                    N

          Х = a х 10 /q, где

     а - округленное среднее арифметическое число колоний;

     q - объем посевного материала, внесенного в чашку, см3;

     N - степень десятикратного разведения продукта.

Результаты анализа выражаются числом от 1,0 до 9,9, умноженным на 10(N), где N - соответствующая степень десятикратного разведения продукта.

Если на чашках с разведением 1:10 не обнаружено роста бактерий, то результат записывают так: менее 1,0 х 10(1) клеток на 1 г (см3).

Если на чашках выросло более 300 колоний, то посевы повторяют, используя более высокие разведения продукта.

4.2. Определение количества дрожжей, дрожжеподобных и плесневых грибов

4.2.1. Сущность метода

Метод основан на выявлении и количественном подсчете всех выросших колоний микроорганизмов, типичных по макро- и (или) микроскопической морфологии, на селективной агаризованной питательной среде Сабуро, при культивировании посевов при температуре (30+-1)°С в течение (120+-3) ч.

4.2.2. Проведение анализа

Для определения количества дрожжей и плесневых грибов выбирают те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 15 и не более 150 колоний для дрожжей и не менее 5 и не более 50 - для плесеней.

Посев осуществляют глубинным или двухслойным агаровым методами.

4.2.2.1. Метод глубинного посева

По 1 см3 исследуемого материала из разведений, приготовленных по п. 3.2.1.3, высевают параллельно в две чашки Петри для каждого разведения. При посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывают и посевной материал вносят на дно чашки. Не позже чем через 15 мин после внесения материала его заливают 15-20 см3 предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45+-1)°С агаризованной среды Сабуро по п. 6.4.8. Чашки с посевами, залитыми питательной средой, осторожно вращают, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей питательной среде. Затем чашки с посевами оставляют на горизонтальной поверхности до полного застывания питательной среды.

После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (30+-1)°С в течение (120+-3) ч.

4.2.2.2. Двухслойный агаровый метод

По 1 см3 исследуемого материала из разведений, приготовленных по п. 3.2.1.3, вносят в каждую из двух пробирок с 4 см3 предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45+-1)°С агаризованной среды Сабуро. Быстро перемешивают содержимое пробирок и переносят в чашки Петри с застывшей агаризованной средой Сабуро, распределяя его равномерно по поверхности среды.

После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (30+-1)°С в течение (120+-3) ч.

4.2.2.3. Обработка результатов

Результаты оцениваются по каждой пробе отдельно.

Просмотр посевов осуществляется каждый день, предварительный учет типичных колоний проводят через (72+-3) ч термостатирования посевов, а окончательный - через (120+-3) ч.

На поверхности плотной среды рост и развитие дрожжей и дрожжеподобных грибов характеризуется появлением плоских или выпуклых колоний белого или кремового, иногда серо-белого цвета. В глубине агара дрожжи образуют чечевицеобразные колонии.

Развитие плесневых грибов характеризуется появлением сметанообразных, слизистых колоний различной окраски с последующим опушением.

Подсчитывают все выросшие колонии, суммируют и находят среднее арифметическое из них.

Допускается учитывать колонии с помощью лупы с 5(х) увеличением.

Полученное среднее арифметическое число колоний, если необходимо, округляют как описано в п. 4.1.2.3.

Количество дрожжей и плесневых грибов в 1 г (см3) продукта (X) вычисляют по формуле:

                     N

           Х = а х 10 /q, где

     а - округленное среднее арифметическое число колоний;

     q - объем посевного материала, внесенного в чашку, см3;

     N - степень десятикратного разведения продукта.

Результаты анализа выражаются числом от 1,0 до 9,9, умноженным на 10(N), где N - соответствующая степень десятикратного разведения продукта.

Если на чашках с разведением 1:10 не обнаружено роста дрожжей и плесневых грибов, то результат записывают так: "не обнаружены".

Если на чашках выросло более 150 колоний, то посевы повторяют, используя более высокие разведения продукта.

4.3. Выявление и идентификация бактерий сем. Enterobacteriaceae

К семейству Enterobacteriaceae относятся грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и восстанавливают нитраты в нитриты.

4.3.1. Сущность метода

Метод основан на выявлении бактерий семейства Enterobacteriaceae с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим биохимическим тестам.

4.3.2. Проведение испытания

10 см3 исследуемого материала из разведения 10(-1), приготовленного по п. 3.2.1.3, вносят в стеклянный флакон вместимостью 200 см3, содержащий 100 см3 одной из питательных сред по п. 6.4.9. Смесь перемешивают и инкубируют при температуре (37+-1)°С в течение (24-48 +-3) ч.

При наличии признаков роста на средах накопления (помутнение среды, изменение ее цвета) делают пересев петлей на чашки Петри со средой Эндо (п. 6.4.10.1). Посевы инкубируют при температуре (37+-1)°С в течение (24-48 +-3) ч.

На среде Эндо бактерии семейства Enterobacteriaceae образуют колонии круглые, малиновые с металлическим блеском или без него, розовые, бесцветные, блестящие, выпуклые, диаметром 1-4 мм.

При окраске по Граму наблюдаются грамотрицательные неспорообразующие палочки.

При отсутствии роста на среде Эндо типичных для семейства Enterobacteriaceae колоний считают, что в образце нет представителей данного семейства.

Колонии, подозрительные по морфологии (каждую отдельно), пересевают петлей на одну из скошенных сред по п. 6.4.7. Посевы инкубируют при (37+-1)°С в течение (24+-3) ч. Культуры проверяют на чистоту.

Чистые культуры исследуют на наличие фермента цитохромоксидазы, для чего полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом на обнаружение цитохромоксидазы (п. 6.4.6) и наносят бактериологической петлей или стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуемых бактерий. Синее окрашивание, появляющееся через 2-5 мин, свидетельствует о положительной оксидазной реакции.

При отрицательной оксидазной реакции культуры пересевают петлей на среду для определения ферментации глюкозы по п. 6.4.10.2 (допускается использование O/F-теста) и в среду для определения способности восстанавливать нитраты в нитриты по п. 6.4.10.3.

В половину пробирок со средой для определения ферментации глюкозы вносят по 0,5 см3 стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37+-1)°С в течение (24+-3) ч. При наличии роста ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета среды из красного в желтый в пробирках с маслом и без него.

При проведении O/F-теста посев производят уколом в два столбика со средой Хью-Лейфсена по п. 6.4.10.4, один из которых заливают 1 см3 стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37+-1)°С в течение (24+-3) ч. При положительной реакции происходит изменение цвета среды при культивировании как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

О наличии нитритов в среде судят по появлению красного окрашивания при внесении в среду реактива Грисса (п. 6.4.5). Для чего к суточной исследуемой культуре на среде для определения наличия нитритов приливают 0,2-0,3 см3 реактива Грисса, погружая пипетку до дна пробирки. Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов.

4.3.3. Обработка результатов

Если в исследуемом образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и восстанавливают нитраты в нитриты, это значит, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано бактериями сем. Enterobacteriaceae.

4.4. Выявление и идентификация Pseudomonas aeruginosa

Микроорганизмы вида Pseudomonas aeruginosa представляют собой грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают положительную оксидазную реакцию, образуют проникающий в субстрат пигмент феназинового ряда, имеющий буроватый оттенок с вариантами от сине-зеленого (пиоцианин) до коричнево-красного, и способны к росту при температуре (42+-1)°С.

4.4.1. Сущность метода

Метод основан на выявлении бактерий вида Pseudomonas aeruginosa с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим биохимическим тестам.

4.4.2. Проведение испытаний

10 см3 исследуемого материала из разведения 10(-1), приготовленного по п. 3.2.1.3, вносят в стеклянный флакон вместимостью 200 см3, содержащий 100 см3 одной из питательных сред по п. 6.4.11. Смесь перемешивают и инкубируют при температуре (37+-1)°С в течение (24-48 +-3) ч.

При наличии признаков роста в среде накопления делают пересев петлей на чашки с одной из питательных сред по п. 6.4.7. Посевы инкубируют при температуре (37+-1)°С в течение (24-48+-3) ч.

При наличии роста зеленоватых, флюоресцирующих колоний, обладающих характерным запахом и окрашивающих среду, из них делают мазки и окрашивают по Граму.

Колонии, подозрительные по морфологии (каждую отдельно), пересевают петлей на одну из скошенных сред по п. 6.4.7. Посевы инкубируют при (37+-1)°С в течение (24+-3) ч. Культуры проверяют на чистоту.

Чистые культуры колоний исследуют на наличие цитохромоксидазы. Для чего полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом на обнаружение цитохромоксидазы (п. 6.4.6) и наносят бактериологической петлей или стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуемых бактерий. Синее окрашивание, появляющееся через 2-5 мин, свидетельствует о положительной оксидазной реакции.

Оксидазоположительные колонии пересевают петлей на среду Кинг-А (п. 6.4.12) и инкубируют при температуре (37+-1)°С в течение (24-48 +-3) ч.

На среде Кинг-А культура Pseudomonas aeruginosa образует пигмент феназинового ряда, имеющий буроватый оттенок с вариантами от сине-зеленого (пиоцианин) до коричнево-красного и проникающий в субстрат.

Для дополнительного подтверждения принадлежности в виду Pseudomonas aeruginosa чашки со средой Кинг-А инкубируют при температуре (42+-1)°С в течение (24+-3) ч.

Культура Pseudomonas aeruginosa растет в вышеуказанных условиях с образованием сине-зеленого пигмента.

4.4.3. Обработка результатов

Если в результате исследований обнаружены колонии грамотрицательных неспорообразующих палочек, дающих положительную оксидазную реакцию, образующие пигмент или без него и дающие рост при 42°С, считают, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано Pseudomonas aeruginosa.

4.5. Выявление и идентификация Staphylococcus aureus

Микроорганизмы вида Staphylococcus aureus представляют собой грамположительные кокки, обладающие лецитиназной активностью, сбраживающие маннит в аэробных и анаэробных условиях или мальтозу в анаэробных условиях и дающие положительную реакцию плазм окоагуляции.

4.5.1. Сущность метода

Метод основан на выявлении бактерий веда Staphylococcus aureus с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим биохимическим тестам.

4.5.2. Проведение испытаний

10 см3 исследуемого материала из разведения 10(-1), приготовленного по п. 3.2.1.3, вносят в стеклянный флакон вместимостью 200 см3, содержащий 100 см3 одной из сред, приготовленных по п. 6.4.13. Смесь перемешивают и инкубируют при температуре (37+-1)°С в течение (24+-3) ч.

При наличии признаков роста делают пересев петлей на чашки с одной из сред: п. 6.4.14.1 - желточно-солевой агар или п. 6.4.14.2 - Байрд-Паркер агар или п. 6.4.14.3 - маннитно-солевой агар. Посевы на желточно-солевой и Байрд-Паркер агар инкубируют при температуре (37+-1)°С в течение (48 +-3) ч, а посевы на маннитно-солевой агар - в течение (24-48 +-3) ч.

При росте на желточно-солевом агаре Staphylococcus aureus образует круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара колонии с ровными краями диаметром 2-2,5 мм, окрашенные в желтый, золотистый, кремовый, палевый или белый цвет, окруженные зоной лецитиназной активности.

На среде Байрд-Паркер Staphylococcus aureus растет в виде черных блестящих колоний диаметром 1-1,5 мм, окруженных зоной лецитиназной активности.

Наличие на маннитно-солевом агаре колоний, окруженных желтыми зонами, свидетельствует о способности этих микроорганизмов ферментировать маннит.

Из подозрительных по морфологии колоний делают мазки и окрашивают по Граму. Стафилококки по Граму окрашиваются положительно, имеют шарообразную или близкую к ней форму с диаметром 0,6-1,0 мкм и располагаются обычно в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда.

При обнаружении грамположительных кокков делают пересев на одну из скошенных сред, приготовленных по п. 6.4.7. Посевы инкубируют при (37+-1)°С в течение (24+-3) ч.

Выделенную чистую культуру пересевают в среду Гисса с маннитом или мальтозой по п. 6.4.14.4, разлитую высоким столбиком (посев производят уколом). Инкубируют при (37+-1)°С в течение (24+-3) ч.

В случае роста стафилококков на среде Гисса с маннитом или мальтозой наблюдается ферментация или окисление углевода, сопровождающиеся изменением цвета среды.

Выделенную чистую культуру исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы.

Для проведения реакции в стерильную пробирку с 0,5-1,0 см3 плазмы крови кролика, разведенной в 3-4 раза или приготовленной из сухого препарата промышленного производства, вносят одну петлю суточной агаровой культуры. Одну пробирку с плазмой крови оставляют незасеянной для контроля. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при (37+-1)°С в течение (24+-3) ч. Результат учитывают через 2, 4, 6 и 24 ч.

При отсутствии свертывания плазмы через 24 ч исследуемую культуру относят к коагулазоотрицательной.

Реакцию считают положительной при образовании даже небольшого сгустка.

4.5.3. Обработка результатов

Если в результате исследований обнаружены колонии грамположительных кокков, ферментирующие маннит в аэробных и анаэробных условиях или мальтозу в анаэробных условиях, обладающие лецитиназной активностью и дающие положительную реакцию плазмокоагуляции, считают, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано Staphylococcus aureus.

4.6. Испытание на стерильность

4.6.1. Метод прямого посева

4.6.1.1. Сущность метода

Метод основан на способности основного большинства как аэробных, так и анаэробных бактерий давать видимый рост на тиогликолевой среде, а дрожжей, дрожжеподобных и плесневых грибов на среде Сабуро.

4.6.1.2. Проведение испытания

Из объединенной пробы, приготовленной по п. 3.2.2.2, отбирают стерильно по (5,0+-0,1) г (см3) или (10,0+-0,1) г (см3) испытуемого средства и высевают в два стеклянных флакона (параллельные определения) вместимостью 100 или 200 см3, содержащие 50 или 100 см3 жидкой среды Сабуро по п. 6.4.8.1 и 50 или 100 см3 тиогликолевой среды по п. 6.4.15 соответственно.

Посевы в среде Сабуро инкубируют при температуре (30+-1)°С, а посевы в тиогликолевой среде при температуре (30-35)°С в течение 14 сут. Посевы просматривают ежедневно.

ГАРАНТ:

Нумерация подразделов приводится в соответствии с источником

4.6.3. Метод мембранных фильтров

4.6.3.1. Сущность метода

Метод мембранных фильтров основан на фильтрации растворов через мембранные фильтры с размером пор не более (0,45+-0,02) мкм, на которых улавливается основное количество микроорганизмов, с последующим культивированием их в тиогликолевой среде и в жидкой среде Сабуро.

4.6.3.2. Проведение испытания

Фильтрование проводят в стерильных условиях с использованием фильтрационной установки, включающей фильтродержатель, соединенный с колбой приемником. Фильтродержатель состоит из воронки с крышкой и основания из пористой пластины, на которую помещается мембранный фильтр.

Фильтрационную установку стерилизуют любым способом, обеспечивающим сохранность рабочих характеристик мембран, а также стерильность мембран и всей установки.

Для фильтрации используют нитратцеллюлозные мембранные фильтры с размером пор (0,45+-0,02) мкм, диаметром около 47 мм (мембрана "Владипор" типа МФАС-Б5 или МФА-МА-N5 или другие, удовлетворяющие требованиям).

Фильтрование проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 мм рт. ст.).

Для фильтрования продуктов, содержащих небольшое количество взвешенных частиц, используют предварительную фильтрацию через префильтр. В качестве префильтров можно использовать фильтры типа АР 15 (Millipore), картон для предварительной фильтрации марки КФБЖ, картон для предварительной фильтрации марки КФМП и другие материалы, способные эффективно задерживать твердые частицы.

Пробу, подготовленную по п. 3.2.2.2, немедленно фильтруют. Фильтрацию заканчивают в момент исчезновения влаги на поверхности фильтра. После окончания фильтрации мембрану отмывают 3-5 порциями по 100 см3 стерильного физиологического раствора для полного удаления с поверхности фильтра веществ, препятствующих росту микроорганизмов.

После отмывания мембрану немедленно извлекают из фильтродержателя, разрезают стерильными ножницами пополам и одну половину помещают в стеклянный флакон вместимостью 100 или 200 см3, содержащий 50 или 100 см3 жидкой среды Сабуро по п. 6.1.9.1, а вторую половину - в стеклянный флакон, содержащий 50 или 100 см3 тиогликолевой среды по п. 6.1.16 соответственно.

Посевы в среде Сабуро инкубируют при температуре (30+-1)°С, а посевы в тиогликолевой среде - при температуре 30-35°С в течение 7 сут. Посевы просматривают ежедневно.

4.6.4. Обработка результатов

Посевы просматривают в рассеянном свете ежедневно и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов в питательных средах оценивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка и других макроскопических изменений. Выявленный рост микроорганизмов подтверждают микроскопированием.

Испытуемая продукция считается стерильной при отсутствии роста микроорганизмов.

При обнаружении роста хотя бы в одном флаконе его подтверждают микроскопированием и повторяют испытание на таком же количестве образцов, как и в первый раз. В случае роста при повторном испытании микроорганизмов, морфологически сходных с микроорганизмами, выявленными при первичном посеве, испытуемую продукцию считают нестерильной. Если при повторном посеве наблюдается рост микроорганизмов, отличающихся по морфологии от первоначально выделенных, испытание проводят в третий раз на удвоенном количестве образцов. При наличии роста хотя бы в одном флаконе при третьем испытании косметическую продукцию считают нестерильной.

5. Микробиологические нормативы для парфюмерно-косметической продукции

Микробиологическому контролю подлежат средства для ухода за кожей лица и тела (косметические кремы, кремообразные маски, косметическое молочко, косметические эмульсии, шампуни, жидкие мыла, гели для душа и ванн, пены для ванн, бальзамы, дезодоранты, депилятории, средства для и после бритья, лосьоны-тоники, лосьоны, тоники), средства декоративной косметики (в т.ч. средства для глаз: жидкая тушь, средства для подведения линии глаз, компактные сухие и жидкие тени для век, губная помада, пудра, румяна компактные и кремообразные), детская косметика и парфюмерия, средства для ухода за волосами (шампуни, ополаскиватели, бальзамы, маски, средства для укладки волос и др.), средства интимной гигиены, специальная косметическая продукция (средства для загара, фотозащитные средства и др.), косметические средства разового использования (в ампулах, капсулах и др.), душистые воды.

Обязательному микробиологическому контролю также подлежит сырье природного и синтетического происхождения и другие компоненты, входящие в состав косметических средств (биологически активные вещества - действующее начало, ингредиенты основы - структурообразующие эмульгаторы, поверхностно-активные компоненты, солюбилизаторы, консерванты и др.).

Не подлежат обязательному микробиологическому контролю готовые средства, содержащие более 25% этилового спирта, окислительные краски для волос и ногтей.

Микробиологические показатели безопасности парфюмерно-косметической продукции в соответствии с требованиями СанПиН 1.2.631-97 "Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-косметической продукции" (прилож. 2), приведены в табл. 1.

Таблица 1

Группы	Вид косметической продукции	Общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий МАФАнМ	Дрожжи, дрожжеподобные и плесневые грибы	Бактерии семейства Enterobacteriaceae	Staphylococcus aureus	Pseudomonas aeruginosa
		КОЕ в 1 г (см3) продукции
I группа	Ампульная косметика, используемая для введения методом электрофореза	Стерильная продукция
II группа	Детская косметика. Косметика для глаз	Не более 1х10(2)	Отсутствие	Отсутствие	Отсутствие	Отсутствие
III группа	Остальная косметика	Не более 1х10(3)	Не более 1х10(2)	Отсутствие	Отсутствие	Отсутствие

6. Аппаратура, растворы реактивов, питательные среды

6.1. Аппаратура

Весы лабораторные квадрантные 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г		ГОСТ 24104-88Е
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г рН-метр любой марки с набором электродов с погрешностью измерений +-0,1 рН		ГОСТ 24104-88Е
Термометр 0-100°С, цена деления 1°С		ГОСТ 28498-90
Автоклав (паровой стерилизатор)		ГОСТ 19569-89Е
Аппарат для встряхивания
Баня водяная с терморегулятором, позволяющая поддерживать температуру 40-45°С
Дистиллятор электрический ДЭ-4
Лупа с пятикратным увеличением		ГОСТ 25706-83
Прибор для счета колоний бактерий
Прибор вакуумного фильтрования ПВФ-47
Спиртовка		ГОСТ 25336-82Е
Термостаты электрические суховоздушные с автоматическим терморегулятором до 50°С, позволяющие поддерживать заданную температуру с погрешностью +-1°С

6.2. Питательные среды и реактивы

Агар микробиологический		ГОСТ 17206-96
Агар сухой питательный для культивирования микроорганизмов		ФС 42-188ВС-90
Агар Эндо		ФС 42-186ВС-88
Бромкрезоловый пурпурный (индикатор)		ГФ XI изд.
Вода дистиллированная		ГОСТ 6709-72
Вода мясная		ГОСТ 10444.1-84
Глюкоза		ГОСТ 6038-79
Гидролизат казеина панкреатический
Глицерин		ГОСТ 6824-96
Желчь сухая медицинская		ОСТ 49278-75
Калий азотнокислый		ГОСТ 4217-77
Калий сернокислый		ГОСТ 4145-74
Калий фосфорнокислый однозамещенный		ГОСТ 4198-75
Калий фосфорнокислый двузамещенный		ГОСТ 2493-75
Калия теллурит, раствор массовой концентрацией 2%
Кислота соляная, раствор массовой концентрацией (HCl) = 0,1 моль/дм3		ГОСТ 3118-77
Кислота сульфаниловая		ГОСТ 5821-78
Кислота тиогликолевая
Кислота уксусная ледяная		ГОСТ 61-75
Литий хлористый, 6-водный		ГОСТ 4328-77
Магний хлористый		ГОСТ 4209-77
Малахитовый зеленый, индикатор		ГФ XI изд.
Маннит		ГОСТ 8321-74
Мальтоза
Масло вазелиновое		ГОСТ 3164-78
Масло иммерсионное		ГОСТ 13739-78
Метиленовый синий
Натрия гидроокись, раствор массовой концентрацией (NaOH) = 0,1 моль/дм3		ГОСТ 4328-77
Натрия резазурин, раствор массовой концентрацией 1,0 г/дм3
Натрий сернистокислый, раствор массовой концентрацией (Na2SO3) = 0,1 г/дм3		ТУ 6-09-5313-86
Натрия тиогликолят
Натрий хлористый		ГОСТ 4233-77
Натрий фосфорнокислый однозамещенный		ГОСТ 245-76
Натрий фосфорнокислый двузамещенный N, N-диметил-п-фенилендиамин дигидрохлорид, раствор массовой концентрацией 1%		ГОСТ 4172-76
1-Нафтиламин		ГОСТ 8827-79
1-Нафтол, спиртовый раствор массовой концентрацией 1%		ГОСТ 5838-79
Основа бактериологических питательных сред сухая (Бактофок-МК)		ФС 42-3407-97
Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей		ГОСТ 13805-76
Питательная среда N 1 (для культивирования аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов), сухая		ВФС 42-1801-88
Питательная среда N 2 (для выращивания плесневых грибов), сухая		ВФС 42-1802-88
Питательная среда N 3 (обогащения для бактерий семейства Enterobacteriaceae), сухая		ВФС 42-1803-88
Питательная среда N 6 (для определения ферментации глюкозы)		ВФС 42-2038-91
Питательная среда N 7 (для определения реакции нитратов в нитриты), сухая		ВФС 42-2020-90
Питательная среда N 8 (для выращивания P. aeruginosa и S. aureus), сухая		ФС 42-3181-95
Питательная среда N 9 (для выявления пигмента пиоцианина P. aeruginosa), сухая		ВФС 42-1908-89
Питательная среда N 10 (для идентификации S. aureus), сухая		ВФС 42-1909-89
Питательная среда для контроля стерильности, сухая		ФС 42-3390-97
Плазма кролика, сухая, цитратная для реакции плазмокоагуляции
Цистин (цистеин)
Растворы и реактивы для окраски мазков по Граму		ГОСТ 10444.1-84
Спирт этиловый ректификованный		ГОСТ 5962-67
Спирт этиловый ректификованный технический		ГОСТ 18300-87
Феноловый красный, индикатор		ГФ XI изд.
Экстракт дрожжевой

6.3. Материалы

Бумага индикаторная универсальная
Вата медицинская гигроскопическая		ГОСТ 5556-81
Марля медицинская		ОСТ 9412-93
Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости		ОСТ 25336-82
Картон для предварительной фильтрации марки КФБЖ		ТУ 13-7308000-691-84
Картон для предварительной фильтрации марки КФМП		ТУ 13-7308001-673-84
Пипетки разной вместимости 2 класса точности		ГОСТ 20292-74
Пробирки типов П1 и П2		ГОСТ 25336-82
Штативы для пробирок
Шпатели
Чашки Петри диаметром 90-100 мм		ГОСТ 25336-82
Цилиндры на 100-250 см3		ГОСТ 1770-74
Флаконы стеклянные градуированные вместимостью 100, 200, 500 мл		ГОСТ 10782-85
Фильтры мембранные типа МФАС-Б5 или МФА-МА-N5 диаметр 47 мм, размер пор 0,45 мкм		ТУ 6-05-1903-81
Фильтры мембранные типа HAWG (Millipore)