Методические указания МУ 1.2.2965-11 "Порядок медико-биологической оценки действия наноматериалов на лабораторных животных по морфологическим признакам и метаболическим параметрам" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 17 октября 2011 г.)

Методические указания МУ 1.2.2965-11
"Порядок медико-биологической оценки действия наноматериалов на лабораторных животных по морфологическим признакам и метаболическим параметрам"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 17 октября 2011 г.)

Дата введения: 17 октября 2011 г.

Введены впервые

I. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок медико-биологической оценки действия наноматериалов на лабораторных животных по морфологическим признакам и метаболическим параметрам в ходе тестирования безопасности новых видов наноматериалов и нанотехнологий.

1.2. Требования, изложенные в настоящих методических указаниях, применяются в ходе проведения исследований безопасности наноматериалов и нанотехнологий в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с воздействием наночастиц и наноматериалов на организм человека.

1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единства измерений и адаптации имеющихся методов и средств измерений в ходе оценки безопасности наноматериалов и нанотехнологий для состояния здоровья человека, сельскохозяйственных и домашних животных, компонентов естественных биоценозов.

1.4. Методические указания предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями и иными организациями и учреждениями, проводящими исследования по оценке безопасности наноматериалов.

II. Нормативные ссылки

1. Федеральный закон от 30 марта 1999 года N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Федеральный закон от 27 декабря 2002 года N 184-ФЗ "О техническом регулировании".

3. Федеральный закон от 10 января 2002 года N 7-ФЗ "Об охране окружающей среды".

4. Приказ Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 года N 755 "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных".

5. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года N 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики".

6. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 23 июля 2007 года N 54 "О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащих наноматериалы".

7. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 года N 79 "Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов".

8. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 19 июля 2007 года N 224 "О санитарно-эпидемиологических экспертизах, обследованиях, исследованиях, испытаниях и токсикологических, гигиенических и иных видах оценок".

9. СанПиН 2.1.7.1322-03 "Гигиенические требования к размещению и обезвреживанию отходов производства и потребления".

10. СанПиН 2.1.4.1074-01 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества".

11. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных инфекций".

12. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

13. СП 1045-73 "Санитарные правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)".

14. МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

15. МУ 1.2.2634-10 "Микробиологическая и молекулярно генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза".

16. МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов".

17. МУ 1.2.2745-10 "Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных".

18. "Временные рекомендации (Правила) по охране труда при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений Минздрава России" (утверждены заместителем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации 11 апреля 2002 года).

19. МР 1.2.2566-09 "Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo".

20. МР 1.2.2641-10 "Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах".

21. МР 1.2.2522-09 "Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека".

22. ГОСТ 7.32-2001 "Отчёт о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления".

23. ГОСТ 30333-2007 "Паспорт безопасности химической продукции. Общие требования".

24. ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 "Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий".

25. ГОСТ 8.207-76 "Государственная система обеспечения единства измерений. Прямые измерения с многократными наблюдениями. Методы обработки результатов наблюдений. Основные положения".

26. ГОСТ 12.1.007-76 "Вредные вещества Классификация и общие требования безопасности".

27. ГОСТ 12.0.003-74 "Опасные и вредные производственные факторы. Классификация".

28. ГОСТ Р ИСО 10993.1-2009 "Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования".

ГАРАНТ:

Приказом Росстандарта от 13 декабря 2011 г. N 1315-ст ГОСТ Р ИСО 10993-1-2009 отменен с 1 января 2013 г. в связи с введением в действие ГОСТ ISO 10993-1-2011 "Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования"

III. Общие положения

3.1. Целью проведения исследований действия наноматериалов на лабораторных животных по морфологическим признакам и метаболическим параметрам является установление зависимостей доза-эффект и определение безопасных доз наноматериалов, необходимых для устанавления гигиенических нормативов (референтных безопасных уровней) содержания наноматериалов в объектах окружающей среды и потребительской продукции (пищевые продукты, парфюмерно-косметическая продукция и другое).

3.2. Исследования по подострым и хроническим воздействиям наноматериалов проводятся с учётом предварительных результатов изучения воздействий наноматериалов в остром опыте (острая токсичность), имеющихся данных о способности наноматериала вызывать кумулятивный эффект, а также максимальных суточных доз, в которых наноматериал может поступать в организм в процессах его производства, использования или утилизации.

3.3. Введение наноматериалов животным в ходе проведения долгосрочных экспериментов проводят в трёх дозах:

- высшая доза, предполагающая наличие токсических эффектов определённых в остром, подостром опыте и на основании данных литературы о веществах, сходных с исследуемым для данного вида лабораторных животных, а также возможного кумулятивного действия;

- минимальная доза, близкая к величине расчётного поступления наноматериала в организм, оценённой для конкретных условий его производства, использования или утилизации;

- промежуточная между минимальной и максимальной доза.

3.4. При постановке экспериментов обязательно наличие контрольных групп животных, содержащихся в таких же условиях, как и подопытные: контрольная группа животных, которая находится только на полусинтетическом корме; контрольные группы, получающие вспомогательные ингредиенты (дисперсионная среда, стабилизатор), входящие в состав исследуемого наноматериала и вводимые тем же путём, что и тестируемые наноматериалы.

3.5. При наличии у вещества, входящего в состав наноматериала, собственных токсических свойств в макродисперсной ("традиционной") форме (как, например, у наночастиц, содержащих мышьяк, свинец, кадмий, теллур, селен и другие токсичные элементы) необходимо наличие дополнительной контрольной группы животных. получающей в эквивалентных дозах химический аналог наноматериала "традиционной" степени дисперсности (то есть в форме макроскопической дисперсии или молекулярного (ионного) раствора).

3.6. Путь (способ) введения наноматериала животным определяется его природой и областью его применения (использования). Пероральное и ингаляционное введение наноматериалов животным осуществляют в соответствии с МУ 1.2.2520-09 (п. 6.4.7.). Для наноматериалов, действующих преимущественно через кожу (например, входящих в состав косметической продукции, текстильных изделии и так далее) применяют эпикутаный способ нанесения наноматериала в виде аппликаций его дисперсии в подходящем носителе на выбритый участок кожи спины животного ежедневно на протяжении всего периода эксперимента.

3.7. В ходе подострого и хронического эксперимента животных подвергают пероральному или эпикутанному воздействию наноматериалов 7 дней в неделю. При использовании ингаляционного пути введения допускается экспонирование животных на протяжении 5-дневных периодов с 2-дневными перерывами.

3.8. Определение критических органов - мишеней воздействия наноматериалов проводится путем изучения накопления наночастиц в различных органах методами в соответствии с МУ 1.2.2520-09 и МР 1.2.2641-10.

3.9. При выборе тестируемых органов исходят из физико-химических свойств наноматериалов, известных данных литературы о токсичности, опасности, характере биологического действия наноматериала, наличии структур и органов мишеней для данных соединений в форме традиционной дисперсности.

3.10. При выборе тестируемых органов можно ориентироваться также на следующий перечень критических органов: легкие, сердце, желудок, тонкая и толстая кишка, печень, поджелудочная железа, почки, семенники, простата, селезенка, лимфатические узлы, тимус, щитовидная железа, надпочечники, головной мозг.

3.11. Исследования органов проводят при забое животных по окончании эксперимента, а также у всех животных, погибших на протяжении эксперимента, в целях установления причины смерти.

3.12. В зависимости от локализации патологического процесса интоксикация животного наноматериалом может быть местной и общей.

3.13. Если какой-либо орган или система имеют низкий порог чувствительности к наноматериалу, в сравнении с другими органами, то при определенных дозовых воздействиях возможно избирательное поражение этого органа или системы. Наноматериалы, к которым порог чувствительности того или иного органа или системы значительно ниже, чем других органов, обозначают как избирательно действующие (оказывающие нейротоксическое, нефротоксическое, гепатотоксическое, кардиотоксическое, гемотоксическое или другое действие).

3.14. В зависимости от интенсивности воздействия интоксикация животного наноматериалом может быть охарактеризована как тяжелая, средней степени тяжести, и легкая.

3.15. Лаборатория, проводящая исследование, должна быть аккредитована в установленном порядке на соответствие ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006.

3.16. Проведение исследований по изучению токсического действия наноматериалов определяются правилами надлежащей лабораторной практики в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23 августа 2010 года N 708н.

3.17. В организации, проводящей исследования по токсическому действию наноматериалов на лабораторных животных, должна осуществляться программа по обеспечению качества проводимых исследований. Для этого все производственные операции проводятся в соответствии со стандартными операционными процедурами (далее - СОП). Соблюдение СОП осуществляется в целях обеспечения качества, достоверности и воспроизводимости результатов исследования.

3.18. Медико-биологическая оценка действия наноматериалов на лабораторных животных по морфологическим и метаболическим параметрам осуществляется с использованием средств измерений, прошедших метрологический контроль в установленном порядке, и имеющем соответственный сертификат. Эксплуатация средств измерений и вспомогательного оборудования проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения поверки средств измерений, профилактических осмотров и текущего ремонта фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим средства измерений и оборудование или обеспечивающим их обслуживание.

3.19. Лаборатория (организация), проводящая исследование токсического действия наноматериалов на лабораторных животных, должны иметь виварий (клинику лабораторных животных). Условия содержания и использования лабораторных животных должны соответствовать требованиям СП 1045-73, СП 1.3.2322-08, СП 1.3.1285-03.

3.20. Для обеспечения индивидуального наблюдения в процессе выполнения исследования животные должны быть идентифицированы. Способ идентификации животного документируется. Все клетки, вольеры, контейнеры, предназначенные для содержания животных, также подлежат маркировке. Животные, предназначенные для исследования различных наноматериалов, пространственно изолируются друг от друга.

3.21. Корма и вода для животных должны обеспечивать пищевые потребности в соответствии с протоколом исследования, быть свободными от патогенных микроорганизмов и вредных примесей и не должны влиять на результаты исследования.

3.22. Снабжение лабораторных животных питьевой водой производится из водопровода, если иное не предусмотрено требованиями СОП. Качество воды должно соответствовать требованиям СанПиН 2.1.4.1074-01.

3.23. Все действия, которые могу причинить лабораторным животным боль (операции, тотальное обескровливание и так далее, а также вынужденный убой животных) должны производиться проводятся с использованием наркотизирующих средств. Если по условиям эксперимента противопоказано применение анестезии, то все вышеуказанные действия необходимо проводить проводятся в максимально короткий срок, руководствуясь правилами гуманного обращения с лабораторными животными.

3.24. В организации, проводящей работы по изучению токсичности наноматериалов, создаётся комиссия по Биоэтике, которая определяет политику организации в области использования животных в экспериментах и осуществляет контроль за соблюдением принципов гуманного обращения с лабораторными животными. Комиссия, в состав которой входят председатель, ветеринарный врач, опытный исследователь и представитель от коллектива организации, проводит экспертизу протоколов предстоящих экспериментов in vivo и даёт (или не даёт) разрешение на проведение исследований.

3.25. Основным документом, подтверждающим результаты проведённых исследований наноматериалов является отчёт о проведённом исследовании.

Отчет должен в обязательном порядке содержать следующие сведения: название исследования; адрес организации; даты начала и завершения исследований; цель и задачи исследования; характеристика тестируемого наноматериала; перечень исследованных образцов и применяемых стандартов; вид, линию, пол и возраст используемых лабораторных животных; состав применяемых кормов; условия содержания животных; метод введения наноматериала; применяемые дозы; длительность и кратность введения; сведения о контрольной группе (группах) животных; схема проведения исследования; перечень использованных средств измерений и вспомогательного оборудования и режимы их работы; методы статистической обработки результатов; результаты исследования, представленные в виде обобщающих таблиц, рисунков с соответствующей статистической обработкой и комментариев к ним; заключение; выводы; список использованных источников.

Оформление отчёта о результатах исследования должно соответствовать требованиям ГОСТ 7.32-2001.

3.26. Отчет о результатах проведенного исследования составляется ответственным исполнителем, утверждается руководителем организации и скрепляется печатью организации.

3.27. Организация, проводящая исследования по оценке действия наноматериалов на животных по морфологическим и метаболическим параметрам должна обеспечить конфиденциальность результатов исследований в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации.

3.28. Сотрудники, принимающие участие в проведении исследований по изучению токсического действия наноматериалов, обязаны соблюдать конфиденциальность в отношении любых данных, полученных в ходе исследования, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

IV. Планирование эксперимента по оценке действия наноматериалов на лабораторных животных

4.1. Определение вида (линии) животных, пригодных для проведения исследований.

Действие наноматериалов оценивают в научном эксперименте на здоровых половозрелых животных, прошедших карантин в течение в течение 10-14 дней. Допускается проведение исследований как на линейных, так и на нелинейных животных. В случае использования линейных животных необходимо указать линию животных. Необходимо также указать питомник, из которого получены животные. Не рекомендуется пользоваться неконтролируемыми питомниками. Исследование проводят на животных категории SPF, в целях минимизации негативного влияния патогенной микрофлоры, а также паразитарных инвазий.

Ввиду возможных значительных видовых отличий реакций животных на исследуемый наноматериал, рекомендуется проводить оценку его действия на нескольких (как минимум двух) видах животных, причем наряду с грызунами желательно включать в эксперимент не грызунов. С учетом требования достаточной численности животных в экспериментальных группах, для проведения первичной медико-биологической оценки действия наноматериалов целесообразно использовать мелких лабораторных грызунов, например, крыс (линии Wistar, Sprage-Dawley), мышей (линии Balb, СD1, CBA, с57black), кроликов, морских свинок. По мере расширения задач исследования, в опыт могут быть включены более крупные животные - собаки, малые свиньи, кошки, обезьяны.

При выборе вида экспериментальных животных желательно учитывать возможность экстраполяции полученных результатов на человека. Один из подходов основан на выборе животных, течение метаболических процессов у которых наиболее близко к человеку. В случае проведения исследований, направленных на оценку действия наноматериалов по морфологическим параметрам, следует руководствоваться принципом структурного и функционального сходства внутренних органов между лабораторным животным и человеком.

При наличии предварительных сведений об особенностях воздействия исследуемого наноматериала, выбор животных может осуществляться с учетом данных, представленных в таблице 1.

Таблица 1

Органы или системы органов - мишени воздействия	Часто используемые виды лабораторных животных
Аллергические реакции (кожа, слизистая оболочка глаза)	морские свинки, кролики
Органы пищеварительной системы (ЖКТ, печень, поджелудочная железа)	мыши, крысы, собаки
ЦНС (головной и спинной мозг)	собаки, кролики, крысы
Почки, надпочечники	крысы, мыши
Сердце, кровеносные сосуды	крысы, мыши
Легкие	крысы, мыши
Репродуктивные органы (семенники, яичники)	крысы, мыши, кролики

4.2. Условия содержания животного во время проведения эксперимента регламентируются Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных. Животное должно быть обеспечено водой для питья и нормальным питанием. В целях унификации условий исследований животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион, составленный согласно МУ 1.2.2520-09.

4.3. Определение способа (метода) введения наноматериалов

Способ введения наноматериала определяется целями исследования, а также его планируемой продолжительностью. Данный параметр эксперимента определяет перечень органов, подлежащих обязательному исследованию. При выборе пути введения следует также учитывать, что количество вводимых растворов, которое определяет предельно допустимую нагрузку, ограничивается рамками физиологических возможностей, массой и возрастом животных (таблица 2).

Таблица 2

Максимально допустимые объемы растворов (в мл) для некоторых видов лабораторных животных в зависимости от пути введения

Способ введения	Вид животных
	крыса	мышь	кролик	морская свинка	собака
интраназально	0,4				4,0
ректально	1,0
внутрикожно	0,04
подкожно	5-10	1,0	30	15	20
внутримышечно	5,0	0,5	15	5,0	12
внутрибрюшинно	5,0	1,0	20-30	5,0	20
внутривенно	2,0	0,2-0,5	20	5,0-8,0
внутрисердечно	1,0
субокципитально	0,15
интрагастрально (в зависимости от массы тела животного)	3-8*(1)	0,5-1,0*(2)	100-200*(3)	4,0-5,0*(4)

______________________________

*(1) при массе 100-190 г - 3 мл, 200-290 г - 4-5 мл, 250-300 г - 6 мл, свыше 300 г - 8 мл;

*(2) при массе 20-30 г - 0,5 мл, 25-30 г - 0,8 мл, свыше 30 г - 1,0 мл;

*(3) при массе 2000-2400 г - 100 мл, 2500-3000 г - 150 мл, свыше 3000 г - 200 мл;

*(4) при массе тела животного 250-300 г.

4.3.1. Парентеральное (внутривенное и внутрибрюшинное) введение применяют для краткосрочных экспериментов, изучающих непосредственное воздействие наночастиц на ткани организма. При внутривенном введении наночастицы поступают непосредственно в кровь и накапливаются преимущественно в органах, обеспечивающих фильтрацию и детоксикацию крови (почки, печень), а также иммунную защиту. При внутрибрюшинном (интраперитонеальном) введении, помимо воздействия, оценивается также способность частиц проникать в кровяное русло с лимфой. Соответственно, при проведении экспериментов этого типа в обязательном порядке инспектируют состояние перитонеальных лимфатических узлов.

Парентеральное введение наночастиц осуществляют в виде их дисперсии в физиологическом растворе. Для получения дисперсий следует использовать физические методы (встряхивание, перемешивание, обработка ультразвуком, гомогенизация путём продавливания через иглы малого диаметра). Использование в качестве носителей наночастиц органических растворителей и поверхностно активных веществ не допускается. Введение наночастиц может осуществляться как однократно, так и многократно, с не менее чем суточными интервалами, в зависимости от задач тестирования.

Для прогнозирования вероятности и последствий проникновения наночастиц в организм в естественных условиях (например, при промышленном загрязнении объектов окружающей среды), а также для установления зависимости степени патологического воздействия частиц от способа введения парентеральные способы введения наночастиц не применяются.

4.3.2. Пероральное и внутрижелудочное введение наночастиц позволяет изучить как проницаемость стенки пищеварительного тракта для конкретного типа наночастиц, так и их возможное патологическое воздействие на ткани организма. Оценка специфических изменений обязательно включает анализ состояния тканей тонкого кишечника и перитонеальных лимфатических узлов. Выбирая между добровольным и принудительным введением, важно учитывать, что при свободном поступлении наночастиц с пищей или питьевой водой не удается осуществлять контроль дозировки и единовременное введение больших количеств вещества. Более эффективной является модель принудительного введения через желудочный зонд, внутрижелудочный или внутрикишечный катетер или фистулу (при наличии соответственным образом подготовленных животных). Наноматериалы в виде раствора, взвеси, эмульсии в нетоксичном растворителе вводится в желудок животных через специальный зонд при помощи шприца. Вводимый объем не должен превышать предельно допустимый для животных данного вида в зависимости от массы тела. Перед процедурой введения и после нее животные не должны получать пищу в течение 2-3 часов. Дозу полученных животными наночастиц выражают через массу препарата в пересчете на единицу массы тела животного (мг/кг массы тела).

При получении дисперсий наночастиц следует использовать физические методы диспергирования. В качестве носителя для наночастиц используется дистиллированная вода, физиологический раствор или фосфатно-солевой буфер. Использование дисперсий наночастиц в органических растворителях и растворах ПАВ не допускается. В порядке исключения допускается применение носителей наночастиц, обладающих собственной токсикологической характеристикой, которая должна быть охарактеризована в дополнительных группах животных, получающих эти носители в количествах, эквивалентных видимым животным опытных групп.

Пероральное и внутрижелудочное введение наночастиц может осуществляться в остром опыте (однократно), как, например, при тестировании острой токсичности согласно МР 1.2.252-09, в подостром опыте (ежедневно на протяжении 30-90 дней) и хронически (на протяжении всей жизни животного, что составляет для мышей и крыс 2- 2,5 года).

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо "МР 1.2.252-09" имеется в виду "МР 1.2.2522-09"

4.3.3. Эпикутанное нанесение наночастиц позволяет оценить проницаемость покровов тела для наночастиц, их способность кумулироваться в организме и вызывать специфические патологические изменения при трансдермальном поступлении. Данный тип введения применим в остром, подостром и хроническом эксперименте. Область аппликации препарата наночастиц должна быть стандартной и составлять 5-8% поверхности тела животного. У мышей выстригается поверхность тела площадью от 3 до 5 , у крыс - от 15 до 24 , у морских свинок - от 25 до 42 , у кроликов - от 56 до 88 . Дозу полученного животным препарата наночастиц оценивают в пересчете на единицу площади тела животного (). При выявлении специфических эффектов воздействия наночастиц в обязательном порядке проводят исследование фрагмента кожи в области аппликации препарата наночастиц, а также прилежащих лимфатических узлов. При использовании дисперсий наночастиц в носителе, обладающем собственной эпикутанной токсичностью (растворы ПАВ, органические растворители), животных контрольной группы подвергают обработке носителем в эквивалентной дозе.

4.3.4. Ингаляционный способ введения применяется как в острых, так и в хронических экспериментах по изучению воздействия наночастиц на организм. При ингаляционном введении лабораторных животных помещают в затравочные камеры, снабженные специальными затравочными устройствами, либо применяют эндотрахеальное, внутриглоточное или внутригортанное ингаляционное введение с использованием специальных зондов. В таких исследованиях обязательно анализируют состояние ткани легких, уделяя повышенное внимание оценке состояния их респираторного отдела. Ингаляционное воздействие может проводиться в условиях острого (однократно, на протяжении суток), подострого и хронического воздействия. Экспозицию вводимых наночастиц при ингаляционной затравке характеризуют их концентрацией (выраженной через массу наноматериала, площадь поверхности или число частиц в единице объёма вдыхаемого воздуха), помноженной на время ингаляции (в часах или сутках). При эндотрахеальном, внутриглоточном или внутригортанном введении дозу наноматериала выражают так же, как и при пероральном и внутрижелудочном введении.

4.4. Определение численности и характеристик экспериментальных групп животных.

Количество животных в группе определяется целями исследования, но не должно быть менее 10 особей в группе. В исследование включают здоровых животных одного пола и возраста. Вариативность исходной массы тела животных в группе не должна превышать %.

В целях наиболее полной оценки действия наноматериалов на лабораторных животных следует изучить влияние таких факторов, как пол, возраст, беременность, лактация, для чего в опыт включают несколько экспериментальных групп. Каждая группа формируется из животных, строго соответствующих заданному физиологическому критерию.

4.5. Формирование контрольных групп животных.

Контрольные группы формируются с целью достоверной оценки значимости данных, полученных в ходе эксперимента на подопытных животных. Вид (порода), пол, возраст, средняя масса, численность и условия содержания животных контрольной группы должны совпадать с этими показателями в подопытной группе. Животным контрольной группы вводят только носитель вещества, который используется для введения наночастиц подопытным животным.

В экспериментах с использованием потенциально токсичного носителя рекомендуется также включать в исследование интактную контрольную группу животных. При проведении экспериментов с эпикутанным нанесением препарата наночастиц практикуют одновременную аппликацию носителя на участки кожи животного, которые расположены симметрично обработанным. Эти участки служат контролем, который позволяет оценить индивидуальный разброс реакций в подопытной группе, как на препарат, так и на носитель. В исследованиях, нацеленных на оценку изменения уровня воздействия наночастиц в зависимости от их размера и формы, формируется референтная контрольная группа животных, получающих традиционный аналога наноматериала (при его наличии).

4.6. Расчёт доз вводимых наноматериалов.

Дозы введения наноматериала при остром воздействии составляют от минимальной токсической дозы до 1 , при подостром воздействии - от минимальной токсической дозы до 1/5 , при хроническом воздействии от 1/3 до 1/10 части минимальной токсической дозы.

Экстраполяцию полученных патофизиологических данных на человека производят методом перерасчета доз на единицу массы тела, после чего вводится Х-кратный коэффициент запаса, учитывающий степень неопределённости в экстраполяции данных применяемой экспериментальной модели.

V. Критерии оценки действия наноматериалов на лабораторных животных по морфологическим признакам

5.1. Особенности исследований некоторых органов и систем

После планового завершения экспозиционной фазы эксперимента животных умерщвляют гуманным способом в соответствии с требованиями, изложенными в МУ 1.2.2520-09. Вскрытие проводят согласно правилам надлежащей лабораторной практики. В ходе аутопсического исследования последовательно визуально оценивают состояние легких, сердца, аорты, желудка, тонкого и толстого кишечника, печени, поджелудочной железы, почек, семенников и простаты или яичников, селезенки, лимфатических узлов, тимуса, щитовидной железы, надпочечников, гипофиза, головного мозга, кожи (перечень органов может быть сокращен или расширен в зависимости от задач эксперимента). Для выявления специфических патологических изменений, вызванных наночастицами, проводят морфометрический анализ и исследование органов на макроскопическом и микроскопическом уровнях в сравнении с нормой (контролем).

Гистоморфологическое исследование легких должно быть в обязательном порядке включено в эксперименты, в которых наночастицы вводятся животным ингаляционно либо интратрахеально. При ином пути введения также возможно накопление наночастиц в легочной ткани в результате проникновения с кровотоком. Кумуляция частиц происходит, преимущественно, в легочных макрофагах. В ходе макроскопического исследования легких необходимо обращать внимание на анатомические изменения органов, которые могут являться следствием развития специфических патологических процессов, в частности, бронхоэктазы, фиброзные или деструктивные изменения легочной ткани и т.п. При гистоморфологическом исследовании ткани легкого устанавливают состав клеточной популяции и наличие патологически измененных типов клеток. На субмикроскопическом уровне оценивают такие характеристики, как размер и форма клеточного ядра, гранулярность и вакуолизация цитоплазмы и т.п. Отмечают любые признаки, указывающие на структурно-функциональную дезорганизацию клеток. При развитии патологических процессов в ткани легких могут наблюдаться специфические многоядерные клетки воспаления, имеющие родственное с макрофагами моноцитарное происхождение - гигантские клетки инородных тел, а также клетки Пирогова-Лангерганса.

Детальное исследование тканей сердца проводят с целью определения влияния наночастиц на поперечно-полосатую мышечную ткань. Уровень кумуляции наночастиц в ткани сердца зависит от их размера. Крупные наночастицы (>30-50 нм) обладают ограниченной проникающей способностью и, как правило, накапливаются в сердце в небольшом количестве. При хронических воспалительных процессах в миокарде можно наблюдать так называемые клетки Анничкова с характерным расположением ядерного хроматина в виде зубчатой полоски, проявляющие фагоцитарную активность. Кровеносные капилляры являются наиболее подходящим объектом для исследования влияния наночастиц на кровеносную систему, так как непосредственно контактируют с циркулирующими наночастицами еще до проникновения их в фильтрующие системы органов. Особо изучают состояние аорты, как наиболее крупного артериального сосуда системы кровообращения. При аутопсии на макроскопическом уровне могут быть выявлены склеротические изменения стенок, кальциноз, очаги некроза и т.п. При гистоморфологическом исследовании кровеносных сосудов анализируют клеточный состав ткани, обращая внимание на инфильтрующие стенку сосуда элементы крови (лимфоциты, моноциты-макрофаги, тучные клетки). Стоит отметить, что несмотря на формальное структурное сходство, крупные сосуды млекопитающих разных видов имеют существенные гистологические отличия. Так, внутренняя оболочка артерий мышей представлена только эндотелием и подлежащей тонкой прослойкой соединительно-тканного матрикса, который практически не содержит клеточных элементов, свойственных многослойной интиме артерий человека.

При пероральном или внутрижелудочном введении полые органы пищеварительного тракта (желудок, кишечник) непосредственно контактируют с препаратом наночастиц, что диктует целесообразность их тщательного гистологического исследования. Печень является обязательным объектом исследования при проведении медико-биологической оценки действия наночастиц на организм лабораторных животных, что связано с детоксицирующей функцией этого органа. Помимо того, к настоящему времени накоплено большое количество данных о преимущественной кумуляции наночастиц некоторых типов в тканях печени. Поджелудочная железа не является мишенью наиболее вероятного накопления наночастиц, однако может интересовать исследователя с точки зрения специфических воздействий наноматериалов на различные ткани и органы лабораторных животных.

В связи с экскреторной функцией почек, наличие патологических изменений в них оценивают вне зависимости от выбранного способа введения наночастиц. Накопление в почках в большей степени свойственно наночастицам малого размера. Чрезвычайно интенсивная почечная гемодинамика (например, у крыс - свыше 70 мл/мин на 100 г) создает предпосылки для накопления наночастиц в тканях почек, чем обусловлена высокая вероятность развития в них патологических процессов. Основной объем почечного кровотока приходится на корковое вещество, в связи с чем можно ожидать концентрирования наночастиц в корковых структурах. Принимая это во внимание при изучении эффектов прямого воздействия наночастиц, не следует, однако, исключать возможность сопутствующих специфических изменений и в тканях мозгового вещества.

Среди органов иммунной системы следует особо выделить тимус, селезенку и лимфатические узлы. Тимус (вилочковая железа) представляет собой лимфоидный орган, в котором происходит созревание, дифференцировка и иммунологическое "обучение" T-клеток иммунной системы. Размеры железы в постнатальном периоде возрастают и достигают максимума (у белых крыс - в возрасте трех месяцев), а затем снижаются вследствие возрастной инволюции и атрофии. Тимус отделен от кровеносного русла многослойным гемато-тиматическим барьером, относительно слабо проницаемым для наночастиц, циркулирующих в крови. Исходя из этого обстоятельства, изучение ткани тимуса следует планировать либо в рамках расширенного исследования, включающего анализ всех органов животного, либо в экспериментах, нацеленных на оценку уровня проницаемости естественных барьеров организма, в т.ч. гемато-энцефалического. В настоящее время накоплено большое количество данных о кумуляции наночастиц в тканях селезенки, ввиду чего представляется необходимым включить этот орган в стандартный план исследования воздействия наноматериалов на организм лабораторных животных. Селезенка является самым крупным органом периферической лимфоидной системы, который обеспечивает антиген-зависимую дифференцировку лимфоцитов. В селезенке происходят антиген-зависимая пролиферация и дифференцировка Т- и В-лимфоцитов и образование антител, а также выработка веществ, угнетающих эритропоэз в красном костном мозге. Исследование ткани лимфатических узлов рекомендуется проводить, в первую очередь, в экспериментах по изучению воздействия наночастиц при их интраперитонеальном и пероральном введении животным. Лимфатические узлы являются важными органами лимфоцитопоэза, иммунной защиты и депонирования циркулирующей лимфы. Функционально лимфатический узел является барьером на пути потенциальных патогенов из лимфатического русла в кровеносное.

5.2. Оценка действия наноматериалов по качественным показателям

5.2.1. Макроскопический уровень.

При исследовании органов на макроскопическом уровне проводится взвешивание органа и его внешний осмотр.

Ниже перечислены характерные признаки патологических изменений, которые могут быть вызваны воздействием наноматериалов.

а) существенное отклонение массы органа от физиологической нормы (физиологическая норма определятся на основании усредненных данных взвешивания органов животных контрольной группы, либо на основании данных литературы по данной линии животных, с учетом их пола и возраста);

б) изменение естественной окраски органа (например, в результате воспалительного процесса);

в) наличие некротических изменений в ткани органа или его соединительно-тканной капсулы;

г) наличие доброкачественных либо злокачественных опухолей различной локализации;

д) нарушение целостности оболочки органа либо сращение ее с оболочками других органов;

е) изменение консистенции органа, обусловленное изменениями в его внутренней структуре (воспалительные процессы, дистрофии и т.д.).

Все данные, полученные в ходе вскрытия и изучения органов на макроскопическом уровне, тщательно протоколируют.

5.2.2. Светооптический уровень.

Исследование методами световой микроскопии подразумевает определение наличия/отсутствия и, при обнаружении, оценку степени специфических гистопатологических изменений в органах и тканях. Известно, что многие наночастицы способны повреждать клетки организма, а также вызывать генерацию активных форм кислорода лейкоцитами различных типов, провоцируя развитие местных или системных воспалительных процессов. В свою очередь, развитие интенсивного воспалительного ответа также способно приводить к значительным повреждениям тканей в результате выделения ряда ферментов, клеточных факторов и генерации активных форм кислорода. В зависимости от тяжести воздействия возможен переход от острого воспалительного процесса к пролиферации и регенеративным изменениям в ткани, а в случае длительного воздействия - развитие хронического воспаления. Типичным исходом обширного воспалительного процесса являются фиброзные изменения соединительной ткани.

Ниже приведен примерный перечень критериев оценки прямого или опосредованного воздействия наноматериалов на ткани.

а) Нарушение целостности оболочки гемокапилляров - полное или частичное повреждение эндотелия и базальной мембраны.

Микропрепараты тканей исследуют на предмет наличия в них поврежденных сосудов микроциркуляторного русла. Поврежденным считается сосуд с явными нарушениями структуры эндотелия и целостности базальной мембраны (исключение - синусоидные капиляры). Критериями оценки являются степень повреждения сосуда и наличие инфильтрата в окружающей сосуд ткани.

б) Наличие нейтрофильной инфильтрации тканей и ее характеристика.

Выявляют присутствие в ткани инфильтрирующих ее нейтрофильных гранулоцитов. Визуально регистрируемое повышенное содержание гранулоцитов в ткани является одним из признаков проходящего в ткани острого или хронического воспалительного процесса. Определяют количество инфильтрирующих ткани клеток на единицу площади, в случае наличия очагов повышенной инфильтрации оценивают площадь очагов.

в) Инфильтрация тканей мононуклеарными фагоцитами и ее характеристика.

Определяют количество макрофагов, моноцитов и гигантских клеток инородных тел в области анализа. Наличие в ткани значительного числа моноцитарных клеток свидетельствует о протекании острой фазы воспалительного процесса. Зрелые макрофаги, как правило, указывают на развитие воспалительного процесса в сторону регенерации или хронического воспаления. Отдельно оценивают наличие ГКИТ и/или клеток Пирогова-Лангерганса, которое является признаком хронического воспалительного процесса средней или высокой интенсивности. В случае их обнаружения определяют количество патологических клеток на единицу площади.

г) Увеличение количества апоптирующих клеток ткани органа (апоптического индекса).

д) Увеличение количества некротических клеток.

е) Патологические изменения цитоархитектоники органов, фиброзы.

ж) Существенные изменения клеток органа - жировая дистрофия, гемосидероз и т.п.

На основании комплексного исследования оценивают тяжесть дистрофических изменений в ткани. Например, в жировой дистрофии ткани печени выделяются следующие стадии:

- простое ожирение, при котором не выражена деструкция гепатоцитов и отсутствует клеточная реакция;

- ожирение в сочетании с некрозом отдельных гепатоцитов и мезенхимально-клеточной реакцией;

- ожирение гепатоцитов, некроз отдельных гепатоцитов, клеточная реакция и разрастание соединительной ткани с начинающейся перестройкой дольковой структуры печени.

При исследовании препаратов на светооптическом уровне для повышения контрастности изображения и выявления специфических структур применяют гистохимическое окрашивание. К числу наиболее распространенных методов относятся окраска гематоксилином-эозином (дифференциальное контрастирование базофильных и эозинофильных структур), суданом III (обнаружение жировых капель). Для решения специальных задач конкретного эксперимента следует применять расширенный набор методик, принятых в лабораторной практике.

5.3. Оценка действия наноматериалов на организм животных с использованием методов морфометрии

5.3.1. Характеристика морфометрических методов.

Морфометрия включает совокупность приемов и методов определения геометрических характеристик исследуемых объектов. В качестве объектов анализа используют изображения гистологических препаратов (срезов, мазков, отпечатков). К списку параметров, подлежащих оценке, относятся размеры, размещения, количественные соотношения, очертания микроскопических морфоструктур. Численное представление результата в сочетании с применением методов статистической обработки позволяет проводить достоверное сравнение образцов по выделенному признаку.

Получение гистологических изображений осуществляют при помощи светового микроскопа, оборудованного цифровой фотокамерой. Для обеспечения достоверности данных при определении каждого параметра проводят серию дублирующих измерений. Анализу подвергают репрезентативные микрофотографии, полученные при увеличении или . Выборка должна включать не менее 50 микрофотографий.

Измерение числа структур, их площадей, диаметров, периметров и других количественных показателей производят с помощью специализированного программного обеспечения. Выполняя статистическую обработку результатов, вычисляют выборочное среднее и стандартное отклонение.

При исследовании ткани на предмет воспалительных изменений анализу подлежит, в первую очередь, количество инфильтрирующих ткани лейкоцитов и клеток соединительной ткани на единицу площади (), сгруппированных по следующим типам:

а) нейтрофильные гранулоциты (характерны для ранних стадий острого воспалительного процесса);

б) моноциты;

в) макрофаги;

г) ГКИТ и клетки Пирогова-Лангерганса (клетки, указывающие на наличие хронических воспалительных процессов в ткани);

д) лимфоциты.

В случае, если в области инфильтрации обнаруживаются явные визуальные отклонения от нормы в популяциях клеток иных типов, они также должны быть включены в морфометрический анализ. При обнаружении существенных различий в уровне инфильтрации гистологически обособленных зон одного органа (к примеру, корковое и мозговое вещество почек) данные по этим зонам оценивают независимо.

При выявлении выраженных очагов повышенной инфильтрации лейкоцитами оценивают отношение площади очагов к общей площади ткани органа, в которой они встречаются. Частоту повреждения эндотелия капилляров определяют как отношение числа капилляров с целыми стенками к общему числу капилляров в исследуемой ткани.

Гистопатологические изменения в тканях могут проявляться в виде нарушения механизмов клеточной гибели. Морфометрически такие изменения выявляются при оценке следующих показателей:

а) доля некротически поврежденных клеток среди клеток данного типа;

б) доля апоптических клеток среди клеток данного типа;

в) доля клеток с патологическими изменениями ядер (пикноз, кариорексис, микроядра) среди клеток данного типа;

г) митотический индекс для конкретного типа клеток (опционально).

В ходе морфометрического исследования дистрофических и других патологических изменений тканей оценивают степень их выраженности. Например, при изучении ткани печени определяют следующие показатели уровня дистрофических и/или поствоспалительных изменений:

а) отношение площади жировых включений в цитоплазме гепатоцитов к общей площади гепатоцитов;

б) отношение площади фиброзных поражений ткани к общей площади анализируемой ткани.

5.3.2. Требования к применяемому программному обеспечению.

Выбор программного обеспечения определяется возможностью его эффективного использования для анализа микрофотографий, документирующих результаты исследования, с применением морфометрических методов. В частности, может быть рекомендована платформа ImageJ (Национальный институт здравоохранения США), которая обладает достаточно мощными полуавтоматическими инструментами для оценки необходимых показателей сравнения. Кроме этого, эта программа является общедоступной. При разработке в ее основу был положен принцип открытой архитектуры, благодаря чему возможности программы постоянно расширяются за счет свободно распространяемых плагинов.

5.3.3. Статистическая обработка результатов измерений.

Статистический анализ данных проводят с помощью программного пакета Statistica 6.0 или аналогичного. Предварительную оценку характера распределения данных осуществляют с помощью теста Shapiro-Wilk. В соответствии с полученным результатом, при дальнейшей обработке применяют непараметрические критерии или критерии для нормально распределенных данных. Достоверность различий средних значений нескольких групп данных оценивают по критерию Friedman. При проведении обобщенной оценки достоверность различия средних значений для нескольких групп данных определяют по критерию Kruskal-Wallis, а для 2-х групп данных - по критерию Mann-Whitney. Для анализа различий между двумя группами связанных данных применяют парный t-критерий Student или непараметрический критерий Wilcoxon. Корреляционный анализ проводят с использованием статистики Spearman. Выводы считают достоверными при допустимой вероятности ошибки менее 0,05. Данные представляют в виде среднего арифметического стандартное отклонение (SD).

5.4. Структура отчёта об оценке действия наноматериалов на организм животных по морфологическим признакам

а) название эксперимента;

б) поставленная задача эксперимента и его схема;

в) характеристика лабораторных животных (вид, линия, пол, возраст, количество);

г) протокол введения частиц и "плацебо";

д) протокол вскрытия животного и забора органов, включающий данные по массе всех органов, а также полную информацию по макроскопически регистрируемым патологическим изменениям в ткани органов;

е) протокол исследования тканей внутренних органов на светооптическом уровне с подробным описанием состояния ткани согласно п. 5.2.2;

е) результаты морфометрического исследования тканей животных;

ж) результаты статистической обработки количественных данных;

д) заключение.

VI. Критерии оценки действия наноматериалов на лабораторных животных по метаболическим параметрам

6.1. При оценке действия наноматериалов на лабораторных животных по метаболическим параметрам в пробах биологического материала, полученного от лабораторных животных, подвергнутых воздействию наноматериалов, осуществляют анализ показателей, характеризующих состояние:

- белкового обмена;

- углеводного обмена;

- липидного обмена;

- водно-солевого обмена;

- минерального обмена;

- обмена витаминов;

- системы антиоксидантной защиты;

- системы детоксикации ксенобиотиков.

6.2. При составлении плана (дизайна) эксперимента по оценке действия наночастиц и наноматериалов на показатели метаболизма, необходимо обращать внимание на следующие факторы.

а) Методы, применяемые при забое животных (включая тип используемой анестезии), отборе и хранении до анализа биологических образцов не должны приводить к неконтролируемым изменениям биохимических показателей.

б) Количества отбираемых биологических образцов должны быть достаточными для проведения всех необходимых анализов с учётом необходимого числа повторностей анализируемых пробы (обычно, не менее двух). Ввиду этого, в зависимости от числа анализов, массы тела и возраста животных численность экспериментальных групп животных может быть изменена в сторону увеличения.

6.3. Отбор проб биологического материала от лабораторных животных должен осуществляться в соответствии со стандартными методиками, утверждёнными в установленном порядке (МУ 1.2.2745-10).

6.4. Составление плана эксперимента по оценке действия наночастиц и наноматериалов на показатели метаболизма производится с учётом имеющихся данных литературы об органах и системах, являющихся мишенями воздействия наноматериалов. При этом необходимо руководствоваться требованиями, изложенными в МУ 1.1.2520-09 (разделы 5, 6).

6.5. Оценка действия наноматериалов на показатели белкового обмена осуществляется путем анализа в биологических образцах, полученных от животных, следующих показателей:

Показатель	Исследуемый биосубстрат	Метод	Литературный источник*
Общий белок	Сыворотка крови	унифицированный метод по биуретовой реакции	1, 25
	моча	биуретовый метод	1, 25
Альбумин	Сыворотка крови	унифицированный метод по реакции с бромкрезоловым зеленым	1, 25
Белковые фракции	Сыворотка крови	унифицированный метод электофоретического разделения	1, 25
Креатинин	Моча, сыворотка крови (после депротеинизации)	унифицированный метод по цветной реакции Яффе с пикриновой кислотой	1, 2, 25
Мочевина	Сыворотка крови	унифицированный метод по цветной реакции с диацетилмонооксимом	1, 2, 25
Мочевая кислота	Сыворотка крови	спектрофотометрический	1, 2, 25
Активность ферментов:
Аланинаминотрансфераза	Сыворотка крови	спектрофотометрические	1, 2
Аспартатамино-трансфераза	Сыворотка крови	спектрофотометрические	1, 2
Щелочная фосфатаза	Сыворотка крови	спектрофотометрические	1, 2

______________________________

* См. приложение 1

6.6. Оценка действия наноматериалов на показатели углеводного обмена осуществляется путем анализа в биологических образцах, полученных от животных, следующих показателей:

Показатель	Исследуемый биосубстрат	Метод	Литературный источник
Глюкоза	Сыворотка крови	глюкозооксидазный метод	1
Глюкоза	Моча	унифицированные методы обнаружения глюкозы в моче	1
Пировиноградная кислота	Кровь	спектрофотометрический	25
Молочная кислота	Кровь	спектрофотометрический	25

6.7. Оценка действия наноматериалов на показатели липидного обмена осуществляется путем анализа в биологических образцах, полученных от животных, следующих показателей:

Показатель	Исследуемый биосубстрат	Метод	Литературный источник
Общие липиды	Плазма крови	турбидиметрический	2, 25
Холестерин	Плазма крови	спектрофотометрический	1, 2, 25
Холестерин ЛПВП	Плазма крови	спектрофотометрический	24, 25
Холестерин ЛПНП	Плазма крови	расчётным методом по разности содержания холестерина общего и ЛПВП	-
Триглицериды	Плазма крови	спектрофотометрический	1, 2
Жирнокислотный состав сыворотки крови и мембран эритроцитов	Сыворотка крови, мембраны эритроцитов	газохроматографический	26, 27

6.8. Оценка действия наноматериалов на показатели минерального обмена осуществляется путем анализа в биологических образцах, полученных от животных, следующих показателей:

Показатель	Исследуемый биосубстрат	Метод	Литературный источник
Содержание макроэлементов в биосубстратах (натрий, калий, кальций, магний и др.)	Сыворотка крови	Атомно-абсорбционная спектрофотометрия	3
Показатели, характеризующие состояние обмена железа
Содержание гемоглобина	Цельная кровь	Гемоглобинцианидный метод	2
Содержание железа	Сыворотка крови	Спектрофотометрический метод	2
Ненасыщенная железо-связывающая активность	Сыворотка крови	Спектрофотометрический метод	2
Общая железо-связывающая активность	Сыворотка крови	Расчётный метод	2
Степень насыщения трансферрина	Сыворотка крови	Расчётный метод	2
Концентрация трансферрина	Сыворотка крови	Иммуноферментный анализ	Инструкция к набору
Концентрация ферритина	Сыворотка крови	Иммуноферментный анализ	Инструкция к набору
Показатели, характеризующие обмен цинка
Содержание цинка	Сыворотка крови, бедренная кость	Атомно-абсорбционная спектрофотометрия	3
Активность щелочной фосфатазы	Сыворотка крови	Спектрофотометрический	1, 2
Показатели, характеризующие обмен селена
Содержание селена	Сыворотка крови Печень Эритроциты	Спектрофлуориметричес-кий	МУК 4.1.033-95
Активность глутатионпероксидазы	Плазма крови	Спектрофотометрический	4-9

6.9. Оценка действия наноматериалов на показатели обмена витаминов осуществляется путем анализа в биологических образцах, полученных от животных, следующих показателей:

Показатель	Исследуемый биосубстрат	Метод	Литера-турный источник
Витамин А	Сыворотка крови Печень	Спектрофотометрический, ВЭЖХ	28
Витамин Е	Сыворотка крови Эритроциты	Спектрофлуориметрический, ВЭЖХ	28
Витамин С	Плазма крови Моча	Титрометрический	28
Витамин (тиамин)	Моча	Спектрофлуориметрический	28
Транскетолаза эритроцитов и ТДФ-эффект	Эритроциты	Спектрофотометрический	28
Витамин	Моча	Спектрофлуориметрический	28
Глутатионредуктаза эритроцитов и ФАД-эффект	Эритроциты	Спектрофотометрический	28
4-пиридоксиновая кислота	Моча	Спектрофлуориметрический	28
Аспартатамино-трансфераза эритроцитов и ПАЛФ-эффект	Эритроциты	Спектрофотометрический	28
-метилникотинамид	Моча	Спектрофлуориметрический	28
Никотинамидные коферменты (НАД и НАДФ)	Кровь	Спектрофлуориметрический	28

Внимание! Крысы относятся к витамин С синтезирующим животным!

6.10. Оценка действия наноматериалов на параметры системы антиоксидантной защиты осуществляется путем анализа в биологических образцах, полученных от животных, следующих показателей:

Показатель	Исследуемый биосубстрат	Метод	Литературный источник
Активность глутатионредуктазы глутатионпероксидазы супероксиддисмутазы каталазы	Плазма крови	спектрофотометрические	4-9
Продукты ПОЛ (малоновый диальдегид, диеновые коньюгаты)	Плазма крови	спектрофотометрические	10-14
Небелковые тиолы ( в пересчёте на восстановленный глутатион)	Печень	спектрофотометрический по цветной реакции с 5,5'-дитиобиснитробензойной кислотой (реактив Эллмана)	15

6.11. Оценка действия наноматериалов на ферментную систему метаболизма ксенобиотиков осуществляется путем анализа следующих показателей:

Показатель	Орган	Метод	Литературный источник
Содержание цитохромов Р-450 и b5	Печень	Спектрофотометрический	16
Активность этоксирезоруфиндеалкилазы	Печень	Спектрофлуориметрический	17
Активность метоксирезоруфиндеалкилазы	Печень	Спектрофлуориметрический	18
Активность пентоксирезоруфиндеалкилазы	Печень	Спектрофлуориметрический	18
Активность глутатионтрансферазы	Печень	Спектрофотометрический	20
Активность УДФ-глюкуронозилтрансферазы	Печень	Спектрофотометрический	21
Активность хинонредуктазы	Печень	Спектрофотометрический	22

6.12. Оценка действия наноматериалов на стабильность биологических мембран осуществляется путем анализа следующих показателей:

Фермент	Орган	Метод	Литературный источник
Общая активность: - Арилсульфатазы А и В - -Галактозидаза - -Глюкуронидаза	Печень	Спектрофотометрический	23
Неседиментируемая активность: - Арилсульфатазы А и В - -Галактозидаза - -Глюкуронидаза	Печень	Дифференциальное центрифугирование, спектрофотометри-ческий	23

6.13. Статистическая обработка результатов биохимических определений производится по единому плану, включающему следующие стадии.

1) Описательная статистика с определением числа значимых значений (N), выборочного среднего (M), стандартного отклонения (SD), стандартной ошибки среднего (m), медианы ().

2) Тест на однородность распределения исследуемого показателя в исследуемых группах с помощью теста на остаточную дисперсию (ANOVA).

3) Определение достоверности различия средних значений между группами с использованием двустороннего t-теста Стьюдента для несвязанных показателей. При расчёте величины t-критерия вносят поправку на различие величины дисперсий сравниваемых групп, оценённую в тесте F на остаточную дисперсию.

4) Тест на однородность распределения исследуемого показателя в группах 1-7 с помощью непараметрического рангового критерия Краскалла-Уоллеса.

5) Определение достоверности различия распределения в сравниваемых группах с помощью непараметрического рангового критерия Мана-Уитни.

6) Факторный анализ. Проверка однородности распределения тестируемого показателя в изучаемых группах по факторам а) наличия носителя наночастиц, б) наличия наночастиц (группы 1,4-7 против групп 2, 3), в) химического состава вводимых препаратов с помощью теста на остаточную дисперсию (ANOVA).

При проведении анализа по п.п.3 и 5 сравнивают попарно а) группу интактных животных контроль со всеми опытными группами; б) группы, получающие наночастицы, с группами, получающими носитель в эквивалентных дозах; в) группы, получавшие препараты наночастиц с группами, получавшими традиционный химический аналог наноматериала.

Различия принимают за достоверные при вероятности принятия нуль-гипотезы (уровне значимости) P<0,05.

Статистическую обработку проводят с использованием лицензионного профессионального программного обеспечения (Statistica, версия 6; SPSS версия 17 и другие).

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

6.10. В качестве критериев наличия воздействия наноматериалов на метаболические параметры организма животного используют:

- достоверные различия в уровнях определяемых метаболических параметрах между группами животных, получавших наноматериалы и контрольными группами, получавшими в эквивалентных количествах носитель, применяемый при введении наноматериала.

- наличие монотонной зависимости "доза-эффект" между количеством вводимого наноматериала и величиной ответа метаболического параметра.

6.11. В качестве критериев специфичности воздействия наноматериалов на метаболические параметры организма животного используют достоверные различия между группами животных, получавших наноматериалы и контрольными группами, получавшими в эквивалентных количествах традиционный аналог наноматериала, вводимый на том же самом носителе.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

VII. Приложения

Приложение 1
к МУ 1.2.2965-11

Список
рекомендуемой литературы по методам оценки метаболических параметров организма лабораторных животных

1. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В. В. Меньшикова.-М.: Медицина, 1987.-368 с.

2. Биохимические методы исследования в клинике. / Под редакцией Покровского А. А.-М.: Медицина, 1969.- 652 с.

3. ГОСТ 30178-96 "Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов".

4. Тиц Н. Энциклопедия клинических лабораторных тестов.- М.: Лабинформ, 1997 - 960 с.

5. Мальцев Г. Ю., Орлова Л. А. //Вопросы мед. химии, 1994. - N 2. -С. 59-61.

6. Mills G.C.// J. Biol.Chem., 1959.-V. 234.-N 3. - P. 502-506.

7. Oshino N., Chance В., Sies H., Bucher T.//Arch. Biochem. Biophys., 1973.-V. 154.-Р. 117-131.

8. Мальцев Г. Ю. Васильев А. В.// Вопросы мед. химии, 1994.- N . 2.-С. 56-58.

9. Niashikimi M., Rao N.A., Jagi К. //Biochem. Biophys. Res. Commun., 1972.-V. 46.-P. 849-854.

10. Иргашев Ш. Б., Юлдашев Н. М., Гурнев С. Б., Хадиметова Ш. А., Эльмуратова М. Т. Процессы гидроксилирования и интенсивность ПОЛ в микросомах печени при экспериментальном инфаркте миокарда//. Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 1993.-N 3.-С. 19-20.

11. Ernster L., Nordenbrandt K.// Meth. Enzymology, 1967.- V.10 .-P.575.

12. Гаврилов В. Б., Мишкорудная М. И.// Лаб. дело, 1983.-V. 3-Р. 33-35.

13. Placer Z. //Nahrung, 1968.-V. 12.-Р. 679.

14. Tilbotsen J. A., Sauberlich H. S.// J.Nutr., 1971.-V. 101. - P. 1459.

15. Пестова М.И., Гмошинский И.В., Мазо В.К. Влияние потребления молока на активность системы детоксикации формальдегида при сенсибилизации этим соединением // Вопросы питания.- 1992.- N 5-6.- С.41-44.

16. Omura Т., Sato R. // Biol. Chem, 1964.-N 239.-P. 2370-2378.

17. Nakajima M., Nakamura S., Tokudome S. et al. // Drag Metabolism and Disposition. - 1999.-Vol. 27. - P. 1381-1391.

18. Burke M.D., Mayer R.T. // Chem.-Biol. Interact. - 1983. - Vol. 45. - P. 243-258.

19. Umegaki K., Saito K., Kubota Y. et al. // Jpn. J. Pharmacol. - 2002. - V. 90, N 4. - Р. 345-351.

20. Habig W.H., Pabst W.J., Jacoby W.B. // J. Biol.Chem. - 1974. - Vol. 294. - P. 7130-7139.

21. Burchell B., Weatherill P. // Methods Enzimol. - 1981. -Vol. 77. - P. 169-177.

22. Benson A.M., Hunkeler M.J., Talalay P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1980. - Vol. 77, N 9. - P. 5216-5220.

23. Дингл Д. Лизосомы. Методы исследования. - М.,1980. - 344 с.

24. Assman G.,Schreiwer H., Schmitz G., et al// Clin.Chem.-1983.-Vol.29.-P.2026-2030.

25. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. - Минск.: "Беларусь", 2009 (т.1 - 495 с; т.2 - 463 с).

26. Preparation of fatty acid methyl esters / IUPAC 2.301 Standard methods for the analysis of oils, fats and derivates, Pergamon Press, 1979.

27. Gas-liquid chromatography of fatty acid methyl esters / IUPAC 2.302 Standard methods for the analysis of oils, fats and derivates, Pergamon Press, 1979.

28. Теоретические и клинические аспекты науки о питании. Т. VIII. Методы оценки обеспеченности населения витаминами. / Под редакцией Волгарева М.Н. - Москва, 1987. - 217 с.

Приложение 2
к МУ 1.2.2965-11

Обозначения и сокращения

СОП	-	Стандартные операционные процедуры
МУ/МУК	-	Методические указания
МР	-	Методические рекомендации
СП	-	Санитарные правила
ЖКТ	-	Желудочно-кишечный тракт
ЦНС	-	Центральная нервная система
ПАВ	-	Поверхностно-активные вещества
ГКИТ	-	Гигантские клетки инородных тел