Методические указания МУК 4.2.3143-13 "Определение антибиотической активности ферментных препаратов микробного (бактериального и грибного) происхождения, предназначенных для использования в пищевой промышленности" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 26 ноября 2013 г.)

Методические указания МУК 4.2.3143-13
"Определение антибиотической активности ферментных препаратов микробного (бактериального и грибного) происхождения, предназначенных для использования в пищевой промышленности"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 26 ноября 2013 г.)

Введены впервые

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода контроля антибиотической активности в ферментных препаратах микробного (бактериального и грибного) происхождения, предназначенных для использования в пищевой промышленности.

1.2. Методические указания предназначены для специалистов лабораторий Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также иных организаций и учреждений, занимающихся вопросами оценки качества и безопасности пищевых продуктов, аккредитованных (лицензированных) на проведение соответствующих исследований в установленном порядке.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Общие положения

Развитие генно-инженерных технологий и биотехнологии обусловило расширение спектра ферментных препаратов микробного происхождения, предназначенных для применения в пищевой промышленности. Определенная часть микробных продуцентов способна наряду с ферментами синтезировать метаболиты с антимикробным действием.

Наличие неидентифицированной остаточной ингибирующей активности в пищевых продуктах, произведенных с применением ферментов, полученных путем микробного синтеза, представляет опасность как непосредственно для микрофлоры кишечника человека, так и появлением в окружающей среде новых антибиотикорезистентных микроорганизмов.

В целях обеспечения безопасности конечных потребителей и гармонизации с аналогичными требованиями ФАО/ВОЗ в Российской Федерации и странах Таможенного союза введено требование - отсутствие "антибиотической активности", которое нуждается в обеспечении соответствующей методической базой, а также в гармонизации с методами, принятыми в международной практике.

В целях гармонизации методов при оценке безопасности ферментных препаратов разработаны настоящие методические указания.

3. Метод измерений

Методика основана на выявлении ингибиции роста штаммов тест-культур неспорообразующих и спорообразующих, грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов веществами антибиотического характера, присутствующими в ферментных препаратах, при культивировании на агаризованных питательных средах на чашках Петри. Метод является качественным.

4. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

4.1. Средства измерений

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений	ГОСТ 19881-74
Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру	ТУ 9452-010-00141798-02
Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 37°С с отклонением от заданной	ТУ 9452-002-00141798-97
Весы лабораторные общего назначения, 2-го и 4-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г	ГОСТ Р 53228-08
Стерилизаторы паровые медицинские	ГОСТ Р ЕН 13060-11; ГОСТ Р 51935-02
Дистиллятор	ТУ 4952-007-33142130-2000
Гомогенизатор типа "вортекс" Автоматический дозатор на 100 мкл Облучатель бактерицидный настенный Штангенциркуль или электронный штангенциркуль, или линейка измерительная, обеспечивающие точность измерения до 1 мм	ТУ 9444-015-03965956-08

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.2. Вспомогательные устройства и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная	ГОСТ 12026-76
Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости	ГОСТ 1770-74
Пипетки вместимостью 1	ГОСТ 29227-91
Пробирки типов П1, П2	ГОСТ 25336-82
Спиртовки лабораторные стеклянные	ГОСТ 23932-90
Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100°С (цена деления шкалы 1°С)	ГОСТ 13646-68
Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов Петля бактериологическая Наконечники одноразовые для дозаторов пипеточных объемом 100 мкл	ГОСТ 23932-90

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.3. Реактивы и питательные среды

Агар микробиологический	ГОСТ 17206-96
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-90
Вода для лабораторного анализа (деионизованная, бидистиллированная)	ГОСТ Р 52501-05
Спирт этиловый технический	ГОСТ 17299-78
Спирт этиловый ректификованный	ГОСТ Р 51652-2000 или ГОСТ 18300-87
Калия гидроокись (гидроксид калия), хч	ГОСТ 24363-80
Натрия гидроокись (гидроксид натрия), хч	ГОСТ 4328-77
Кислота серная, хч	ГОСТ 4204-77
Калий фосфорно-кислый однозамещенный, ч	ГОСТ 4198-75
Кислота соляная, хч	ГОСТ 3118-77
натрий хлористый, хч	ГОСТ 4233-77
Пептон соевый сухой Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (ТСАДЭ) Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (ТСБДЭ)	ГОСТ 13805-76
Ферментативный гидролизат казеина	ТУ 9385-002-00479327-94
Экстракт дрожжевой сухой	ТУ 9385-007-39484474-03

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

4.4. Тест-штаммы микроорганизмов

Тест-штамм	Рекомендуемый депозитарий
Escherichia coli ATCC 11229	ВКПМ ФГУП "ГосНИИгенетика"
Bacillus circulans ATCC 4516	ВКПМ ФГУП "ГосНИИгенетика"
Serratia marcescens ATCC 14041	ВКПМ ФГУП "ГосНИИгенетика"
Bacillus cereus ATCC 2*	АТСС, США (http://www.lgcstandards-atcc.org)
Staphylococcus aureus ATCC 6538	ФГБУ "НЦ ЭСМП" Минздрава России
Streptococcus pyogenes ATCC 12344	ФГБУ "НЦ ЭСМП" Минздрава России
* Взамен указанной культуры может быть использована тест-культура Bacillus cereus ATCC 11778, депонированная в ФГБУ "НЦ ЭСМП" Минздрава России

Тест-штаммы необходимо сохранять в лиофилизированном виде в невскрытых ампулах при температуре 10°С, не выше. При регулярном использовании после вскрытия ампул и активизации культуры тест-штаммы допускается сохранять на агаризованной среде ТСАДЭ в пробирках с плотно притертыми пробками при температуре 2-8°С с периодическим пересевом на ту же среду не реже 1 раза в 14 дней.

5. Подготовка к проведению испытаний

5.1. Приготовление питательных сред

5.1.1. Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (ТСБДЭ).

Для приготовления используют сухую готовую среду ТСБДЭ следующего состава (г/л): ферментативный гидролизат казеина - 17,0; пептон соевый - 3,0; натрий хлористый - 5,0; фосфат калия однозамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 6,0. Допускается приготовление из компонентов.

Сухие компоненты растворяют в 1 000  дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают .

Приготовленную среду разливают в стерильные пробирки по 5-10  и автоклавируют при 121°С в течение 15 мин.

5.1.2. Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (ТСАДЭ).

Для приготовления используют сухую готовую среду ТСАДЭ или готовят из среды по п. 5.1.1, добавляя перед стерилизацией агар микробиологический из расчета 15 .

Среду готовят в колбах вместимостью 100-250 , разливая по 25-50  среды, из расчета одна колба на одну тест-культуру, автоклавируют при 121°С в течение 15 мин.

Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8°С в течение 14 дней, не более.

5.2. Подготовка бумажных дисков

Готовят диски из фильтровальной бумаги диаметром 12,5-13,0 мм, помещают их в стеклянные чашки Петри и стерилизуют в сушильном стерилизационном шкафу с выдержкой при температуре 160°С не менее 1 ч.

5.3. Подготовка тест-культур

Шесть пробирок со стерильной средой ТСБДЭ по п. 5.1.1 засевают шестью штаммами тест-культур, для этого каждую культуру со скошенного агара полной петлей переносят в соответствующую промаркированную пробирку с бульоном ТСБДЭ, далее все шесть пробирок помещают в термостат на и выдерживают в течение . Для посева используют культуры, выращенные предварительно на скошенном агаре ТСАДЭ по. п. 5.1.2 и хранившиеся при температуре не более 14 дней.

5.4. Подготовка 1 н растворов кислоты и щелочи

Из концентрированной соляной кислоты готовят 1 н раствор кислоты, разбавляя 8,5 мл концентрированной соляной кислоты дистиллированной водой до конечного объема 100 мл.

Из сухой гидроокиси натрия (или калия) готовят 1 н раствор щелочи, растворяя 4 г сухой гидроокиси натрия (5,6 г гидроокиси калия) в дистиллированной воде до конечного объема 100 .

Приготовленные растворы стерилизуют при 0,5 ати (112°С) 15 мин.

6. Отбор и подготовка проб ферментных препаратов

6.1. Отбор и подготовку проб ферментных препаратов производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов", ГОСТ Р 54004-10 "Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний", ГОСТ ISO 7218-11 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям".

Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования и минимально вдвое превышать аналитический образец.

6.2. От продукции в потребительской таре пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары, с тем, чтобы количество было достаточным для проведения анализа. От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров или неупакованной пробы отбирают из разных мест с различной глубины, включая поверхность.

6.3. Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб на физико-химические и органолептические анализы стерильным инструментом в стерильную посуду.

6.4. Из отобранной пробы ферментного препарата готовят 10%-ю суспензию путем добавления навески 1 г к 9  стерилизованной дистиллированной воды, тщательно перемешивают на Вортексе для получения однородной суспензии.

В суспензии измеряют рН и в зависимости от полученного значения доводят значение рН до уровня стерильным 1 н раствором кислоты или щелочи (п. 5.4).

7. Проведение анализа

7.1. Колбы - 6 штук с агаризованной средой (ТСАДЭ) по п. 5.1.2, маркируют в соответствии с используемыми тест-культурами, среду расплавляют и охлаждают до температуры 38-40°С. Далее в каждую колбу вносят соответствующую суспензию суточной тест-культуры, приготовленную по п. 5.3, в количестве 10% от объема среды для всех тест-культур (кроме Streptococcus pyogenes), аккуратно перемешивают, не допуская образования пены.

Суточную суспензию тест-культуры Streptococcus pyogenes вносят в колбу с подготовленной средой в количестве 5% от объема среды и также аккуратно перемешивают, не допуская образования пены.

7.2. В промаркированные стерильные чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности, вносят инокулированный агар, приготовленный по п. 5.1 в количестве:

- 25 (г) среды в чашки Петри диаметром 90 мм;

- 38 (г) среды в чашки Петри диаметром 11 мм.

Оставляют для застывания на 30 минут, не менее.

7.3. Подготовленную суспензию фермента перемешивают на Вортексе. Далее для каждого фермента (при тестировании нескольких образцов) подготавливают шесть бумажных дисков (по одному для каждой из шести культур). Для этого берут стерильные бумажные диски диаметром 12 мм и насыщают их раствором фермента путем добавления 100 мкл (примерно 3 капли) 10%-го раствора фермента по п. 6.4.

Подготовленные диски раскладывают по одному на поверхность агара в каждую из шести инокулированных чашек Петри.

7.4. Чашки Петри помещают на ночь в холодильник для диффузии активных компонентов тестируемых ферментных препаратов в агаризованную среду.

Затем чашки Петри переносят в термостат и инкубируют при 37°С в течение . После чего проверяют наличие всех зон ингибирования, которые могут быть вызваны ферментным препаратом.

8. Учет результатов

Результаты оценивают для каждой пробы ферментного препарата в комплексе по всем шести тест-культурам.

Определение величины зоны ингибирования вокруг дисков проводят с помощью измерительных инструментов (штангенциркуль, линейка) с точностью до 1 мм.

Наличие прозрачной зоны вокруг диска диаметром не менее 16 мм, определяемой визуально, указывает на наличие антибактериальных компонентов.

Результат расценивают как положительный - наличие антибиотической (антибактериальной) активности у ферментного препарата в случае, если таковая обнаружена в отношении трех (или более) тест-культур.

9. Требования безопасности

Исследования пищевых продуктов на наличие антибиотической (антибактериальной) активности с использованием тест-культур проводят в соответствии с СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

10. Нормативные ссылки

10.1. ГОСТ Р 54004-10 "Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний".

10.2. ГОСТ ISO 7218-11 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям".

10.3. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических исследований".

10.4. ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов".

10.5. ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов".

10.6. Технический регламент Таможенного союза 029/2012 "Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств".

10.7. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

Врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации

А.Ю. Попова