Методические рекомендации МР 3.1.0335-23 "Методы диагностики Helicobacter pylori инфекции" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 6 декабря 2023 г.)

Методические рекомендации МР 3.1.0335-23
"Методы диагностики Helicobacter pylori инфекции"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 6 декабря 2023 г.)

ББК 52.649.2в64

М41

ISBN 978-5-7508-2087-0

Введены впервые

I. Область применения

1.1. Настоящие методические рекомендации (далее - МР) описывают методические основы и алгоритмы лабораторной диагностики Helicobacter pylori инфекции.

II. Общие положения

Классификация и дифференциальные свойства бактерий рода Helicobacter

2.1. Хеликобактериоз - инфекционная болезнь, вызываемая бактериями рода Helicobacter, характеризующаяся преимущественным поражением слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки.

Род Helicobacter насчитывает 46 видов. В зависимости от занимаемой экологической ниши все хеликобактерии условно разделяют на "желудочные" и "внежелудочные". Дифференциальные признаки представлены в приложении 1 к настоящим МР.

2.2. "Желудочные" хеликобактерии колонизируют желудок человека и животных, уреазоположительные. "Внежелудочные" или энтерогепатические хеликобактерии приобрели способность колонизировать слизистую оболочку кишечника, желчного пузыря, желчевыводящих путей, а также печень. Некоторые из энтерогепатических хеликобактерий уреазоотрицательны и толеранты к действию желчи, что отличает их от "желудочных" хеликобактерий. Все известные виды этих бактерий колонизируют организм животных, но некоторые из них обнаружены у человека, при этом роль в патологии человека окончательно не установлена.

2.3. В патологии человека наибольшее значение имеет Н. pylori. Микроорганизм отнесен к III группе патогенности и является этиологическим агентом в развитии острого и хронического гастрита, дуоденита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки ¹. Международное агентство по изучению рака (англ. International Agency for Research on Cancer, IARC) ² отнесло этот микроорганизм к канцерогенам I группы.

------------------------------

¹Прил 1 СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 N 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный N 67587); от 25.05.2022 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный N 68934) (далее - СанПиН 3.3686-21).

² Официальный сайт Международного агентства по изучению рака (англ. International Agency for Research on Cancer, IARC): www.iarc.fr (в свободном доступе).

------------------------------

Морфологические свойства

2.4. Н. pylori принадлежит к домену Bacteria, типу Campylobacterota, классу Campylobacteria, порядку Campylobacterales, семейству Helicobacteriaceae, роду Helicobacter.

Н. pylori - это грамотрицательные неспорообразующие спиралевидной формы бактерии длиной 2,2 - 5,0 мкм и диаметром 0,5 - 1 мкм с закругленными концами. Н. pylori обладает подвижностью за счет наличия на одном из полюсов от 2 до 6 жгутиков. Жгутики окружены мембраноподобным чехлом, защищающим их от деполяризации при низких значениях pH желудка. Однополярность жгутиков Н. pylori обеспечивает высокий крутящийся момент, необходимый для перемещения в вязкой среде желудка, и штопорообразную подвижность. Существуют три морфологические формы: S-образные, С и U образные, кокковидные формы. In vivo и при оптимальных условиях культивирования in vitro Н. pylori существует в виде S-образно изогнутой бактерии с 1 - 3 завитками и пучком из 5 - 7 жгутиков. Под влиянием неблагоприятных условий (температура, значение pH, недостаток питательных веществ, действие антибиотиков) неспорообразующие микроорганизмы могут трансформироваться в кокковидные и дормантные формы. Основная экологическая ниша Н. pylori - слизистая оболочка желудка.

Культуральные свойства

2.5. Н. pylori - бактерии микроаэрофилы (оптимальная концентрация О ₂ 3 - 15 %) и капнофилы (оптимальная концентрация СО ₂ 10 - 15 %). Н. pylori - прихотливый микроорганизм, требующий для роста дополнительных факторов (витаминов, микроэлементов). Обязательным компонентом является добавка 5 - 10 % дефибринированной крови или сыворотки животных (лошади, барана). Использование крови человека ограничено наличием у большинства взрослого населения защитных антител, способных ингибировать рост Н. pylori. При этом эритроциты могут быть лизированы, чтобы ростовые вещества использовались быстрее, что достигается при применении "шоколадного" агара. В качестве факторов роста и размножения Н. pylori нуждаются в ряде готовых аминокислот, которые используются не только для синтеза белков, но и как основной источник энергии. Культивирование Н. pylori осуществляется как на плотных, так и на жидких средах. Для выделения бактерий на практике используются плотные среды. Для культивирования Н. pylori применяются среды, которые условно можно разделить на селективные и неселективные. Для выделения H. pylori рекомендована комбинация неселективной и селективной сред или двух селективных. Обязательными компонентами сред являются базовый агар, ростовые добавки, а для селективных - ингибиторы роста сопутствующей микрофлоры (ванкомицин для ингибирования роста грамположительных кокков; полимиксин, налидиксовая кислота, колистин, триметоприм, цефсулодин для ингибирования грамотрицательных палочек; нистатин, амфотерицин В для торможения роста грибов). На кровяном агаре Н. pylori дают рост через 2 - 7 суток в виде мелких (диаметром 1 - 2 мм), влажных, прозрачных колоний. Некоторые штаммы проявляют гемолитическую активность (-гемолиз). Оптимальная температура роста плюс 37 °C. Оптимальное значение pH нейтральное, ближе к слабощелочному - 8,5.

Биохимические свойства

2.6. Н. pylori каталазо- и оксидазоположительные бактерии, в большом количестве выделяют уреазу, не разлагают углеводы. Тесты на образование H ₂S, восстановление нитратов в нитриты вариабельные. Выделяют щелочную фосфатазу, -глутамилтранспептидазу, лейцинаминопептидазу.

Факторы патогенности

2.7. Фактором патогенности Н. pylori является его способность колонизировать эпителий желудка и метапластически измененный эпителий двенадцатиперстной кишки. Спиралевидная форма и наличие на одном полюсе жгутиков позволяет микроорганизму быстро передвигаться в толще слизи и проникать через межклеточные контакты. Жгутики Н. pylori представлены комплексом белков - флагеллинами FlaA, FlaB, FlaD, Fig K. H. pylori производит различные типы движения: плавающие (в жидкой среде); скользящие (в полужидком агаре); ползающие (на плотной среде). "Плавающая" подвижность может быть измерена средней скоростью движения бактерии в фазово-контрастном микроскопе. "Скользящая" и "ползающая" подвижность определяется путем измерения диаметра кольца роста вокруг точки инокуляции.

2.8. Адгезия Н. pylori к эпителиальным клеткам желудка, облегчающая доступ бактерии к питательным веществам и доставку эффекторных молекул, является важнейшим фактором патогенности. Рецепторами для Н. pylori являются молекулярные структуры, входящие в состав слизи: остатки сиаловых кислот; сульфогруппы гликопротеинов, гликолипидов, фосфолипидов и остатки фукозольюисподобных антигенов, свойственных не только клеткам эпителия желудка, но и эритроцитам группы крови I (0 ). Микроорганизм обладает способностью связываться с белками соединительной ткани (например, коллагеном, ламинином, витронектином). Н. pylori обладает большим набором поверхностных мембранных белков (англ. outer membrane proteins, OMPs), играющих важную роль в адгезии и адаптации к макроорганизму. Наиболее известны адгезины: BabA (англ. Lewis blood group antigen-binding adhesion) и SabA (англ. sialic Lewis X antigen-binding adhesion).

2.9. Уреаза, состоящая из субъединиц UreA, UreB, UreC, UreI, является собственно маркером инфекции Н. pylori и фактором защиты микроорганизма от действия соляной кислоты, обеспечивает длительное персистирование H. pylori в желудке человека, усиливает воспалительные реакции посредством активации моноцитов, нейтрофилов, секреции цитокинов, образования свободных радикалов и окиси азота. Большая субъединица уреазы UreB действует как аттрактант для лейкоцитов. Н. pylori производит огромное количество этого фермента, позволяющего нейтрализовать кислую среду и создать вокруг бактерии микроокружение - "облако" из аммиака. Объем ее образования достигает 10 - 15 % общего белка, синтезируемого Н. pylori, она имеет наивысшую активность среди бактериальных уреаз. От других уреазоположительных бактерий Н. pylori отличается образованием внеклеточной уреазы за счет аутолиза части клеток и адсорбции фермента на поверхности выживших бактерий. Будучи сильным антигеном уреаза связывает антитела, комплекс антиген - антитело удаляется с поверхности бактериальной клетки, тем самым защищая Н. pylori от лизиса.

2.10. "Остров патогенности" (англ. cytotoxin-associated gene Pathogenicity Island, cagPAI) у H. pylori - это регион хромосомальной ДНК, содержащий приблизительно 31 ген, кодирующих белки IV секреторной системы Н. pylori и разделенных на два региона: cagl и cagll. Цитотоксин CagA, маркер "острова патогенности" Н. pylori, участвует в язвообразовании, развитии атрофии, в процессе деградации и разрушения межклеточного матрикса и базальной мембраны, опухолевой инвазии и метастазировании.

2.11. VacA - вакуолизирующий токсин (англ. vacuolating-associatted cytotoxin) кодируется геном vacA, существующим у всех штаммов Н. pylori и отображает аллельное разнообразие в трех основных регионах:

- s - сигнальный (англ. signal);

- i - промежуточный (англ. intermediate);

- m - средний (англ. middle).

Регионы vacA существуют в двух аллельных типах: (s1 и s2, i1 и i2, m1 и m2), что обуславливает штаммовые различия в цитотоксической активности. VacA изменяет работу протонных насосов и влияет на поток ионов, вызывая при этом накопление вакуолей в клетках, что приводит к атрофии слизистой желудка. VacA нарушает транспорт белков, увеличивает проницаемость мембран, повреждает цитоскелет, а также ингибирует опсонизацию бактерий, нарушая нормальное функционирование защитных механизмов на слизистой оболочке желудка. VacA стимулирует диффузию уреазы через эпителий, делая подслизистый слой доступным для действия фермента.

2.12. IceA - белок, индуцируемый при контакте с эпителием (англ. Induced by contact with epithelium), кодируется геном iceA и существует в двух аллельных вариантах: iceA1 и iceA2, связан с усилением инфильтрации собственной пластинки слизистой оболочки желудка полиморфно-ядерными нейтрофилами, экспрессией интерлейкина-8 и острым воспалением.

2.13. dupA - ген, способствующий развитию язвы двенадцатиперстной кишки (англ. duodenal ulcer promoting gene), является маркером развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, но также может быть связан с развитием желудочной карциномы.

2.14. HtrA - протеаза, обеспечивающая устойчивость к высокой температуре (англ. protease high temperature requirement А), выделяется в межклеточное пространство Н. pylori в процессе инфекции, расщепляет клеточный адгезивный белок путем протеолиза. Доказано влияние HtrA на Е-кадгерин, обнаружение опухолевого супрессора Е-кадгерина в качестве HtrA субстрата указывает на роль HtrA в Н. pylori-индуцированном канцерогенезе, нарушениях адгезивных соединений, что способствует проникновению микроорганизма через эпителий.

Механизмы резистентности Н. pylori к антимикробным препаратам

2.15. Н. pylori обладает природной резистентностью к нескольким антибактериальным препаратам: триметоприму, ванкомицину, полимиксину В, налидиксовой кислоте и сульфаниламидам. Препараты могут использоваться при создании сред для транспортировки и культивирования Н. pylori. В настоящее время описана резистентность Н. pylori ко всем группам антибиотиков, применяемым в схемах противохеликобактерной терапии: производным нитроимидазола, макролидам, лактамам, тетрациклинам и нитрофуранам. В общемировой популяции показатели распространенности первичной резистентности бактерий к антибиотикам, которые входят в схемы эрадикации, варьируют в различных географических зонах в широких пределах, коррелируя с общей частотой применения этих антимикробных препаратов (далее - АМП) в популяции в основном при инфекционных и респираторных заболеваниях. Вторичная (приобретенная) резистентность Н. pylori к применяемым антибиотикам, как правило, обусловлена неадекватным лечением: заниженными дозами препаратов; применением неполных схем лечения; несоблюдением сроков лечения и кратности приема. Существует понятие генетической (выявленной с помощью молекулярных методов) и фенотипической (выявленной с помощью культуральных методов) антибиотикорезистентности Н. pylori. Сопоставление их результатов показало высокую степень совпадения (более 70 %) при более высокой чувствительности молекулярно-генетического метода.

2.16. Одним из механизмов, снижающих чувствительность Н. pylori к ряду антибиотиков (например, тетрациклину, метронидазолу), является механизм эффлюкса, который обеспечивает выведение токсических веществ (в т.ч. и антибиотиков) из микробной клетки с помощью специальных эффлюкс-помп (белки-транспортеры в цитоплазматической мембране). Гены, кодирующие эффлюкс-системы, располагаются не только в хромосомах, но и в плазмидах (транспозонах), что обеспечивает легкость их передачи. Экспрессия этих генов происходит под действием антибиотиков, что приводит к отбору штаммов, обладающих эффлюкс-механизмами.

Резистентность Н. pylori к кларитромицину. Существует несколько механизмов формирования приобретенной резистентности к кларитромицину: модификация мишени (метилирование рибосом, мутации в рРНК, мутации в рибосомальных белках L4, L16, L22), активное выведение антибиотика из бактерии, ферментативная инактивация. Механизм формирования резистентности Н. pylori к кларитромицину заключается в точечных хромосомных мутациях в регионе, кодирующем пептидилтрансферазу (основную мишень макролидов) в V домене 23S рибосомальной РНК, что приводит к нарушению связывания антибиотика с мишенью действия. В настоящее время описано более 20 мутаций, определяющих резистентность Н. pylori к кларитромицину. Замена нуклеотидных последовательностей в позициях 2142 (A2142G и А2142С), 2143 (A2143G) являются наиболее часто встречающимися вариациями таких мутаций.

Распространенным и практически важным механизмом устойчивости Н. pylori к макролидам является модификация мишени действия. Модификация является результатом метилирования 23S рибосомальной РНК (присоединение СН3-руппы) и последующего конформационного изменения рибосомы, что приводит к снижению афинности к кларитромицину. Реакция опосредуется ферментами метилтрансферазами, соответствующие гены которых получили название - метилирующих рибосомы эритромицином (англ. erythromycin ribosome methylation, erm), локализующиеся, как правило, на плазмидах.

Резистентность к нитроимидазолам. Мишенью для их действия является структура ДНК возбудителя. Метронидазол проникает внутрь клетки, где NO ₂ группа восстанавливается в форму гидроксиламинового производного. Восстановленная форма вызывает повреждение ДНК и гибель бактерии. В основе генетических механизмов резистентности лежит мутация гена rdxA, кодирующего синтез кислород-нечувствительной нитроредуктазы, влияющей на превращение препарата в активную форму. Другие белки, такие как флавиноксиредуктазы, кодируемые геном frxA, могут быть также вовлечены в процесс восстановления. Эффлюкс-помпа TolC может играть роль в резистентности к этой группе препаратов. Резистентность к нитроимидазолам не является необратимой. Ряд работ свидетельствуют о том, что анаэробные условия восстанавливают чувствительность к метронидазолу у прежде резистентного штамма Н. pylori.

Резистентность к амоксициллину встречается крайне редко (менее 1 %). У небольшого количества штаммов обнаружена мутация в гене pbplA (англ. penicillin binding protein), определяющего способность Н. pylori связывать пенициллины. Случаев развития резистентности к амоксициллину при его клиническом применении не отмечено, но имеются сообщения о возрастании минимальной подавляющей концентрации (далее - МПК) амоксициллина с 0,03 мг/л до 0,25 - 0,5 мг/л. Плазмидная передача устойчивости к амоксициллину не свойственна Н. pylori.

Резистентность к тетрациклинам. Тетрациклины являются бактериостатическими препаратами широкого спектра и действуют путем подавления синтеза белка в результате блокирования связывания аминоацил-транспортной РНК с комплексом информационная РНК-рибосома. Обратимое связывание тетрациклина происходит с рибосомальной субъединицей 30S чувствительных микроорганизмов. Резистентность Н. pylori к тетрациклинам может быть обусловлена точечной мутацией в позиции 26695 в 16S рибосомальной РНК. Обнаружены единичные штаммы, устойчивые к этому препарату, в Российской Федерации таких штаммов до настоящего времени выделено не было.

Резистентность к фторхинолонам. Мишенью действия фторхинолонов является фермент ДНК-гираза, ответственная за суперспирализацию ДНК, а именно субъединица А ДНК-гиразы, кодируемая геном gyrA. Резистентность к фторхинолонам Н. pylori связана с изменениями нуклеотидных последовательностей в гене gyrA в позиции 87 или 91.

Резистентность к нитрофуранам. Нитрофураны, являясь акцепторами кислорода, нарушают клеточное дыхание бактерий и ингибируют биосинтез нуклеиновых кислот. У фуразолидонорезистентных изолятов выявлены мутации в генах, кодирующих синтез пируватоксидоредуктазы (англ. pyruvate oxidoreductase, porD) и оксоглутаратоксидоредуктазы (англ. oxoglutarate oxidoreductase, oorD).

2.17. Основные методы исследования антибиотикорезистентности Н. pylori - бактериологические (метод серийных разведений, Е-тесты) и молекулярно-биологические (полимеразная цепная реакция (далее - ПЦР)). Разработаны методы ПЦР с учетом результатов в реальном времени для определения мутаций резистентности к кларитромицину, фторхинолонам, тетрациклинам. Материалом для исследования служат изоляты ДНК Н. pylori, полученные из биоптата слизистой оболочки желудка, желудочного сока, фекалий.

III. Лабораторная диагностика Н. pylori инфекции

Организационно-методическая работа

3.1. Для диагностики хеликобактериоза используются: неинвазивные методы, не требующие эндоскопического исследования и инвазивные, при проведении которых используется биоматериал, отобранный при эзофагогастродуоденоскопии (далее - ЭГДС) (табл. 1).

Таблица 1

Методы диагностики Н. pylori инфекции

Методы диагностики, требующие эндоскопического исследования	Быстрый уреазный тест (далее - БУТ) Гистологический метод Цитологический метод Бактериологический метод Молекулярно-биологические методы определения ДНК Н. pylori в биоптате, желудочном соке
Методы диагностики, не требующие эндоскопического исследования	Иммунохроматографический тест определения антигена Н. pylori в фекалиях (ИХА) 13С Уреазный дыхательный тест (далее - УДТ) Молекулярно-биологические методы определения ДНК Н. pylori в фекалиях Иммунологический метод (ИФА)

Работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности), а также с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными Н. pylori, осуществляются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ³, а также методическими документами ⁴.

------------------------------

³П. 3 гл. I, гл. IV СанПиН 3.3686-21.

⁴МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009.

------------------------------

3.2. Гистологические и иммуногистохимические исследования проводятся врачами-патологоанатомами гистологических и иммуногистохимических лабораторий патологоанатомических отделений медицинских организаций (далее - МО), соответствующих квалификационным требованиям специальности "Патологическая анатомия" ⁵.

------------------------------

⁵Приказ Минздрава России от 02.05.2023 N 206н "Об утверждении квалификационных требований к медицинским и фармацевтическим работникам с высшим образованием" (зарегистрирован Минюстом России 01.06.2023. регистрационный N 73677) (далее - Приказ Минздрава России от 02.05.2023 N 206н).

------------------------------

Цитологические, молекулярно-биологические, иммунологические, иммунохроматографические, биохимические исследования проводятся врачами клинической лабораторной диагностики клинико-диагностических лабораторий, соответствующих квалификационным требованиям специальности "Клиническая лабораторная диагностика" ⁶ и профессиональному стандарту "Специалист в области клинической лабораторной диагностики", биологами, имеющих документ о дополнительном профессиональном образовании по заявленной деятельности в сфере выполнения клинико-диагностических исследований в соответствии с законодательством Российской Федерации ⁷.

------------------------------

⁶Приказ Минтруда России от 14.03.2018 N 145н "Об утверждении профессионального стандарта "Специалист в области клинической лабораторной диагностики" (зарегистрирован Минюстом России 03.04.2018, регистрационный N 50603); Приказ Минздрава России от 02.05.2023 N 206н.

⁷Прил. 2 приказа Минздрава России от 18.05.2021 N 464н "Об утверждении Правил проведения лабораторных исследований" (зарегистрирован Минюстом России 01.06.2021, регистрационный N 63737) (далее - приказ Минздрава России от 18.05.2021 N 464н).

------------------------------

Бактериологические, масс-спектрометрические, молекулярно-биологические, биохимические, иммунологические, иммунохроматографические исследования проводятся врачами микробиологических лабораторий (врач-бактериолог, врач-вирусолог, врач-медицинский микробиолог), соответствующих квалификационным требованиям специальностей "Бактериология", "Вирусология", "Медицинская микробиология" ⁸ и профессиональным стандартам "Специалист в области медико-профилактического дела" ⁹, "Специалист в области медицинской микробиологии" ¹⁰, биологами, имеющими документ о дополнительном профессиональном образовании по заявленной деятельности в сфере выполнения микробиологических исследований в соответствии с законодательством Российской Федерации ¹¹.

------------------------------

⁸Приказ Минздрава России от 02.05.2023 N 206н.

⁹Приказ Минтруда России от 25.06.2015 N 399н "Об утверждении профессионального стандарта "Специалист в области медико-профилактического дела" (зарегистрирован Минюстом России 09.07.2015, регистрационный N 37941).

¹⁰Приказ Минтруда России от 08.06.2021 N 384н "Об утверждении профессионального стандарта "Специалист в области медицинской микробиологии" (зарегистрирован Минюстом России 09.07.2021, регистрационный N 64205).

¹¹Прил. 6 приказа Минздрава России от 18.05.2021 N 464н.

------------------------------

3.3. Показания к проведению диагностики хеликобактериоза:

- диспепсия;

- хронический гастрит;

- язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки;

- гастропатия, индуцированная длительным приемом нестероидных противовоспалительных препаратов;

- необходимость длительного приема нестероидных противовоспалительных препаратов и ингибиторов протонной помпы;

- идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура;

- идиопатическая железодефицитная анемия;

- идиопатическая В ₁₂ - дефицитная анемия;

- состояние после резекции желудка при новообразованиях;

- MALT-лимфома желудка (англ. mucosa-associated lymphoid tissue);

- по желанию пациентов, имеющих в анамнезе близких родственников, страдающих раком желудка.

3.4. Для первичной диагностики Н. pylori инфекции рекомендовано проведение УДТ либо определение антигена Н. pylori в фекалиях, а также определение антител с помощью иммуноферментного анализа (далее - ИФА), а при проведении ЭГДС - БУТ, молекулярно-биологический метод для определения ДНК Н. pylori в биоптате. Всем пациентам, у которых впервые проводится диагностическая ЭГДС, для адекватного стадирования предраковых состояний слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки, у пациентов с подозрением на наличие морфологических изменений (атрофия, метаплазия, дисплазия, неоплазия), у пациентов с диспепсией старше 50 лет, рекомендуется отбор биопсийного материала с последующим патолого-анатомическим исследованием, в том числе с применением гистохимических и иммуногистохимических методов, как для диагностики Н. pylori инфекции, так и для идентификации морфологических изменений слизистых оболочек гастродуоденальной зоны. До назначения антимикробной терапии рекомендуется проводить тестирование на чувствительность к кларитромицину бактериологическим или молекулярно-биологическим методом.

При проведении контроля эрадикационной терапии рекомендуется проведение УДТ либо определение антигена Н. pylori в фекалиях, при проведении ЭГДС - БУТ и определение ДНК Н. pylori в биоптате. В случаях неэффективности лечения рекомендуется применение бактериологического метода для определения чувствительности выделенной культуры к АМП. Отрицательный результат исследования на выявление Н. pylori подтверждается другим методом диагностики.

Преаналитический этап

3.5. Отбор материала для лабораторного исследования от больного проводят специалисты МО, ответственные за отбор, хранение и транспортировку образцов для исследования, владеющие навыками безопасной работы с биологическим материалом. Биологический материал, поступающий в лабораторию МО для проведения лабораторного исследования рассматривается как потенциально инфицированный. Работы с биоматериалом в лаборатории должны проводиться с обеспечением биологической безопасности в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ¹². Для выполнения исследований используется стандартное оборудование, диагностические наборы реагентов и расходные материалы, имеющие соответствующие сертификаты качества и действующий срок годности, разрешенные к применению на территории Российской Федерации ¹³. Перечень оборудования, реагентов, расходных материалов, необходимых для исследований приведен в приложении 2 к настоящим МР.

------------------------------

¹²Гл. III, IV СанПиН 3.3686-21.

¹³Ч. 4 ст. 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации" (далее - Федеральный закон от 21.11.2011 N 323-ФЗ); постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий" (далее - постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416).

------------------------------

Биологический материал для исследования

3.6. При подозрении на Н. pylori инфекцию исследуют биоптат слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки, кровь, фекалии, выдыхаемый воздух, а также можно использовать желудочный сок.

В зависимости от метода лабораторной диагностики используется различный биологический материал (табл. 2).

Таблица 2

Биологический материал для диагностики Н. pylori инфекции

Метод диагностики	Материал для исследования
БУТ	Биоптат слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки
УДТ	Выдыхаемый воздух
ИХА	Фекалии
ИФА	Кровь
ПЦР	Биоптат слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, фекалии, желудочный сок
Гистологический метод	Биоптат слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки
Цитологический метод	Биоптат слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки
Бактериологический метод	Биоптат слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, желудочный сок

Маркировка материала

3.7. Упаковку, маркировку образцов и оформление документации для транспортировки производят в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ¹⁴. Емкости с образцами биологического материала этикетируют. На этикетке пробирок, контейнеров с материалом указывается: порядковый номер образца, соответствующий номеру в сопроводительном документе.

------------------------------

¹⁴П. 513 гл. IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

В сопроводительном документе (направлении) к материалу, собранному для исследования в лаборатории, указывается следующая информация:

- наименование учреждения, которое направляет материал на исследования;

- фамилия и имя обследуемого больного (если этого не требует положение о конфиденциальности);

- возраст;

- дата и время взятия материала для лабораторного исследования;

- тип материала;

- предполагаемый диагноз.

Отбор биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки

3.8. Биоптаты отбираются до начала терапии антибиотиками и антисекреторными препаратами. Ингибиторы протонной помпы, не имея прямого антимикробного эффекта, опосредованно вмешиваются в распространение Н. pylori в желудке, изменяя значение pH его экологической ниши, что приводит к исчезновению бактерии в антруме и ее появлению в теле желудка. Рекомендуется не применять антисекреторные препараты (ингибиторы протонной помпы) за две недели, а антибиотики и препараты висмута за 4 недели до начала исследования.

Биоптаты слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки (объемом от 1 до 5 мм ³ каждый) отбирают во время проведения ЭГДС стерильными разовыми биопсийными щипцами из наиболее визуально измененных участков слизистой антрального отдела и тела желудка, помещают отдельно в одноразовые стерильные пробирки по типу "Эппендорф", содержащие не менее 0,1 мл транспортной среды.

Количество биоптатов имеет большое значение для выделения Н. pylori. Одиночный биоптат, взятый из антрума, недостаточен для окончательной постановки диагноза. У взрослых рекомендуется отбирать по два биоптата из тела желудка и из антрального отдела.

Транспортировка биоптатов

3.9. Н. pylori - микроорганизм, чувствительный к высушиванию, высоким температурам, воздействию кислорода. После отбора биоптат необходимо сразу же поместить в транспортную среду и хранить до транспортировки при температуре плюс 4 °C. Важно, чтобы биоптат был полностью погружен в среду, так как прилипание его к стенке пробирки или высыхание может привести к потере жизнеспособности микроба. Для кратковременной транспортировки можно использовать физиологический раствор, тиогликолевую среду, разлитые в стерильные плотно закрывающиеся пробирки. Время от взятия материала до доставки в микробиологическую лабораторию не должно превышать 6 ч. Для транспортировки могут быть использованы коммерческие среды, при этом условия хранения и сроки доставки определяются инструкцией производителя.

При транспортировании проб внутри одного здания, пробирки/контейнеры с биологическим материалом помещают в штативы и специальные герметичные контейнеры-переноски. При необходимости транспортирования биологического материала в другие организации, образцы от каждого пациента помещают в индивидуальный герметичный пакет с адсорбирующим материалом и помещают в термоконтейнер. Сопроводительные документы помещают в индивидуальную упаковку отдельно от биологического материала и прочно прикрепляют снаружи контейнера. В сроки хранения биологического материала включены сроки транспортировки с обязательным учетом температурного режима.

Для исследования биоптатов молекулярно-биологическим методом допускается хранение и транспортировка биоптатов при комнатной температуре в течение 6 ч, при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C в течение 3 суток, при температуре минус 20 °C в течение 1 недели. В особых случаях возможно замораживание биоптатов до температуры минус 70 °C и отправка в лабораторию в сухих пробирках. Транспортировка и хранение биоматериалов осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ¹⁵.

------------------------------

¹⁵П.п. 493, 513 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Сбор и хранение образцов желудочного сока для исследования методом ПЦР

3.10. В случаях очагового обсеменения слизистой оболочки, наличия атрофии в антральном отделе и при распространении инфекции на фундальный отдел желудка исследование желудочного сока, как интегративного материала, повышает вероятность обнаружения ДНК возбудителя в сравнении с исследованием биоптата. Работа с желудочным соком не требует гомогенизации на этапе пробоподготовки.

Образец желудочного сока получают при проведении эндоскопии через биопсийный канал в одноразовый стерильный контейнер с помощью электроотсоса. Затем 0,3 - 0,5 мл желудочного сока переносят шприцем в стерильную пробирку по типу "Эппендорф".

В случаях, когда эндоскопическое исследование пациенту не проводится, желудочный сок берут через одноразовый зонд непосредственно в пробирку по типу "Эппендорф" или отсасывая с помощью шприца. Образец желудочного сока от каждого пациента помещают в индивидуальный пластиковый пакет и сопровождают направлением.

Хранение образцов в стерильной емкости: при комнатной температуре плюс 20 - 25 °C - до 6 ч; при температуре холодильной камеры плюс 2 - 8 °С - до 24 ч; при температуре морозильной камеры минус 16 - 20 °C - до 1 мес.

Транспортировка и хранение образцов желудочного сока аналогична требованиям к транспортировке биоптатов при соблюдении требований биобезопасности ¹⁶.

------------------------------

¹⁶П.п. 493, 513 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Гомогенизация биоптатов для бактериологического и молекулярно-биологического методов исследований

3.11. В связи с неравномерностью распределения бактерий в биоптате и необходимостью отделения бактериальных клеток от слизистой оболочки желудка проводят гомогенизацию. Гомогенизацию биоптата можно проводить несколькими способами:

- при помощи стерильной микробиологической петли биоптат помещается в пробирку по типу "Эппендорф" с 0,2 - 0,5 мл стерильного физиологического раствора и гомогенизируется петлей в течение 1 мин;

- при помощи стерильной микробиологической петли биоптат помещают в стерильную ступку, добавляют 0,5 - 1 мл стерильного физиологического раствора и тщательно гомогенизируют пестиком, совершая круговые движения в течение 1 мин;

- электрическим гомогенизатором при 10 тыс. об/мин в течение 10 - 20 сек.

Предварительная обработка микробиоптатов для молекулярно-биологических исследований не требуется.

Предобработка макробиоптатов для молекулярно-биологических исследований проводится несколькими способами.

Первый способ: кусочки тканей весом 100 мг помещают в фарфоровую ступку и добавляют физиологический раствор объемом 0,5 - 1 мл. Измельчают стерильными ножницами и растирают пестиком. Через ватный тампон отбирают надосадочную жидкость 0,1 - 0,2 мл стерильным наконечником в стерильные микропробирки.

Второй способ: биоптат помещают в жидкий азот, затем растирают пестиком в фарфоровой ступке, предварительно охлажденной жидким азотом, затем к полученному порошку добавляют равный объем стерильного физиологического раствора (0,1 мл), перемешивают и отбирают необходимый для выделения ДНК объем материала.

Отбор, хранение, транспортировка образцов фекалий

3.12. Образцы фекалий должны быть собраны в чистый контейнер, не содержащий консерванты. Используют пробы фекалий массой 1 - 3 г (объемом 1 - 3 мл). Образцы кала можно хранить при температуре плюс 2 - 4 °C не более двух суток, при необходимости более длительного хранения (до 1 года) - при температуре минус 20 °C и ниже. Перед анализом образцы фекалий должны быть полностью разморожены и доведены до комнатной температуры. Повторное замораживание и оттаивание образца недопустимо.

Отбор венозной крови для иммунологического исследования

3.13. Взятие крови (для ИФА обязательно натощак) проводят из вены в объеме 3 - 4 мл или из подушечки третьей фаланги среднего пальца в объеме 0,5 - 1,0 мл (у детей младшего возраста) в одноразовую пластиковую пробирку без антикоагулянта. Взятие крови из локтевой вены для получения сыворотки производят одноразовой иглой (диаметр 0,8 - 1,1 мм) в пробирку типа вакуэт без антикоагулянта или одноразовый шприц объемом 5 мл. При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую пробирку. Пробы крови, взятые без антикоагулянта, отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин или помещают в термостат при температуре плюс 37 °C на 15 мин. Затем проводится центрифугирование в течение 10 мин при 3000 об/мин. По окончании центрифугирования сыворотка переносится в стерильные пробирки с использованием для каждого образца отдельного наконечника с аэрозольным барьером.

Доставка и хранение крови, сыворотки

3.14. Срок хранения крови - не более 6 ч. Сыворотка крови хранится при комнатной температуре в течение 6 ч, при температуре плюс 4 - 8 °C - в течение 5 суток, более длительно - при температуре не выше минус 16 °C. Повторное замораживание (размораживание) сыворотки крови не рекомендуется.

Пакеты с материалом для ПЦР и иммунологического исследования могут транспортироваться в одном термоизолирующем контейнере.

Аналитический этап

3.15. Аналитический этап включает гистологический, цитологический, бактериологический, молекулярно-биологический, иммунохроматографический, иммунологический, биохимический методы исследования.

Гистологический метод выявления Н. pylori

3.16. Исследования проводятся в гистологических лабораториях патологоанатомических отделений МО.

Исследование биоптатов проводится с использованием различных окрасок (акридиновым оранжевым, по Романовскому-Гимзе, по Вартину-Старри). С помощью данной методики можно не только с высокой степенью надежности выявить наличие Н. pylori, но и количественно определить степень обсеменения и морфологические изменения слизистой оболочки желудка, связанные с инвазией микроба (признаки воспаления, атрофия, метаплазия, дисплазия, неоплазия).

Специфичность гистологического метода составляет 90 %, а чувствительность - 80 %.

Степень обсемененности слизистой оболочки желудка Н. pylori оценивается методом световой микроскопии по критериям, согласно которым выделяют три степени обсемененности слизистой оболочки:

- слабая (+) - до 20 микробных тел в поле зрения;

- средняя (++) - 20 - 50 микробных тел в поле зрения;

- высокая (+++) - более 50 микробных тел в поле зрения.

В случаях хронического активного гастрита, при котором гистологически Н. pylori не выявляется, в качестве вспомогательного метода может быть использован иммуногистохимический метод. Биопсийный материал, фиксированный в формалине и залитый в парафин, обрабатывается моноклональными антителами против Н. pylori. Готовые к применению коммерческие наборы с моноклональными антителами избирательно окрашивают только Н. pylori.

Иммуногистохимическое исследование позволяет сократить время для поиска бактерий, особенно в случае низкой обсемененности или наличия кокковых форм Н. pylori. В случае нормальной гистологической картины иммуногистохимическое исследование не проводится.

Специфичность иммуногистохимического метода составляет 90 - 100 %, чувствительность - 97 - 98 %.

Цитологический метод

3.17. В связи с неравномерным распределением Н. pylori в разных отделах желудка для более точной диагностики рекомендуется проводить множественную биопсию (не менее 3 биоптатов: по одному из области угла желудка, большой кривизны тела желудка и большой кривизны антрального отдела). Исследование дополнительных биоптатов, полученных из тела и антрального отдела желудка, повышает выявляемость инфекции Н. pylori примерно на 10 %.

Для микроскопического исследования допускается использовать мазки, приготовленные из биоптата либо из гомогената. На середину предметного стекла пипеткой (стерильным наконечником дозатора) наносят 1 каплю взвеси биоптата. Для приготовления мазка отбирают биоптат из транспортной среды бактериологической петлей и равномерно распределяют клеточный материал по предметному стеклу, предварительно обезжиренному в 96 % этиловом спирте и натертому досуха. Материал по поверхности стекла распределяют так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал 2 - 2,5 см. Стекло оставляют в горизонтальном положении и высушивают. Фиксацию препарата проводят над пламенем горелки или спиртовки.

Окраска мазка проводится ручным или автоматизированным методом. В качестве красителя используется водный раствор фуксина, катионового синего, окраску по Романовскому-Гимзе.

На готовые мазки наносится капля иммерсионного масла и просматривается под иммерсионным микроскопом под увеличением 90. Бактерии Н. pylori обнаруживают по типичной морфологии С- или S-образно изогнутые палочки спиралевидной формы (рис. 1 - 3).

Степень обсемененности определяют по следующим параметрам:

- слабая (+) - до 20 микробных тел в поле зрения;

- средняя (++) - до 50 микробных тел в поле зрения;

- высокая (+++) - более 50 микробных тел в поле зрения.

Рис. 1. H. pylori в слизистой оболочке желудка.

Примечание: окраска фуксином. Увеличение 90.

Рис. 2. Н. pylori в слизистой оболочке желудка (средняя степень обсемененности).

Примечание: окраска катионовым синим О. Увеличение 90.

Рис. 3. Н. pylori в слизистой оболочке желудка
(высокая степень обсемененности).

Примечание: окраска по Романовскому-Гимзе. Увеличение 90.

Бактериологический метод

3.18. Бактериологическое исследование представляет собой многоступенчатый процесс, включающий:

- забор проб клинического материала и транспортировку его в лабораторию;

- проведение первичного посева на питательные среды для выделения возбудителя и получения чистой культуры;

- дифференциацию и идентификацию выделенных культур;

- определение чувствительности культур к антибактериальным препаратам.

3.19. Для выделения Н. pylori рекомендуется использовать две среды: селективную и неселективную. В качестве основы можно использовать, например, колумбийский агар (англ. Columbia Agar Base), сердечно-мозговой агар (англ. Brain Heart Infusion Agar), агар Мюллера-Хинтона (англ. Muller-Hinton Agar), эритрит-агар, бруцелла-агар (питательная среда для выделения и культивирования бруцелл), кампилобак-агар (приложение 2 к настоящим МР).

Для ингибирования роста сопутствующей микрофлоры используются различные селективные добавки, содержащие антимикробные компоненты: ванкомицин для ингибирования роста грамположительных кокков; полимиксин, налидиксовая кислота, колистин, триметоприм, цефсулодин для ингибирования грамотрицательных палочек; амфотерицин В для торможения роста грибов (табл. 3). Для создания селективных условий для роста бактерий рода Helicobacter разработаны коммерческие специальные селективные питательные среды. Для приготовления селективной среды в лабораторных условиях рекомендуется использовать коммерческие селективные добавки для выделения Н. pylori, зарегистрированные на территории Российской Федерации в установленном порядке ¹⁷. Селективные добавки вносятся в основу питательной среды в соответствии с инструкцией производителя. Условия хранения и сроки годности селективных добавок устанавливаются производителем. Для проведения внутрилабораторного контроля качества селективной среды для выделения Н. pylori в качестве контрольных штаммов используют:

------------------------------

¹⁷Ч. 4 ст. 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416.

------------------------------

- положительный контроль - Н. pylori АТСС 43504 (NCTC11637) - рост колоний, характерный для данного вида;

- отрицательный контроль - Candida albicans ATCC 10231 - (ингибирование роста от частичного до полного), Staphylococcus aureus ATCC 29213 (полное ингибирование роста), Escherichia coli АТСС 25922 (ингибирование роста от частичного до полного), Proteus mirabilis ATCC 43071 (ингибирование роста от частичного до полного).

Таблица 3

Селективные добавки для выделения бактерий рода Helicobacter

Антибиотик	Микроорганизм
	H. pylori	H. felis	H. mustelae
Амфотерицин В	2,5 мг/мл	2,5 мг/мл	2,5 мг/мл
Ванкомицин	6 мг/мл	6 мг/мл	6 мг/мл
Полимиксин	-	0,125 мг/мл	-
Триметоприм	20 мг/мл	20 мг/мл	20 мг/мл
Цефсулодин	16 мг/мл	-	16 мг/мл

Приготовление плотных питательных сред для культивирования бактерий рода Helicobacter

3.20. Эффективность выделения бактерий рода Helicobacter зависит от множества факторов, одним из которых является использование свежеприготовленных питательных сред. Допускается хранение приготовленных сред в течение недели в закрытом виде при температуре плюс 4 °C с поддержанием влажности и без воздействия света.

При использовании готовых коммерческих питательных сред, разлитых в чашки Петри, рекомендуется обращать внимание на влажность поверхности среды (на пересушенных средах рост Н. pylori затруднен).

Приготовление сред необходимо осуществлять в соответствии с рекомендациями производителя. Этапы представлены в приложении 3 к настоящим МР.

Подготовка биоптата к посеву и посев

3.21. Подготовка биоптата к посеву указана в разделе "Гомогенизация биоптатов".

Пипеткой нанести 1 - 2 капли гомогената на поверхность плотной питательной среды, рассеять инокулят по поверхности агара бактериальной петлей или шпателем во взаимно перпендикулярных направлениях.

Инкубирование

3.22. Для создания микроаэрофильных условий используются анаэростаты и газогенерирующие пакеты согласно инструкции производителя. Использование активирующихся пакетов без добавления воды может снижать влажность в атмосфере культивирования. Для создания оптимальной влажности рекомендуется помещать внутрь анаэростата влажные бумажные полотенца.

Вместо анаэростатов можно использовать СО ₂-инкубаторы, где автоматически поддерживаются заданные параметры процентного содержания углекислого газа, влажности и температуры. Инкубатор может быть настроен на создание атмосферы, содержащей 5 - 10 % О ₂, 10 % СО ₂, а также иметь поднос с дистиллированной водой, расположенный в нижней части инкубатора для создания влажности.

После загрузки анаэростаты с посевами помещаются в термостат при температуре плюс 37 °C и инкубируются в течение 3 - 7 дней.

Идентификация выделенных культур

3.23. При создании оптимальных условий первый рост Н. pylori появляется через 3 дня, основной рост обнаруживается через 5 дней, но при отсутствии роста чашки продолжают инкубировать до 7 дней. Первый просмотр роста нужно производить на 3 день культивирования, при отсутствии роста продолжить культивирование чашек, создав заново микроаэрофильные условия, с повторным просмотром посевов на 5 и 7 день культивирования с выдачей окончательного результата. Для дифференцировки Н. pylori от энтерогепатических хеликобактеров нужно иметь в виду, что они отличаются от Н. pylori медленным ростом: первые колонии появляются на 7 день, а длительность культивирования составляет две недели.

На средах, содержащих кровь, Н. pylori и Н. mustelae растут в виде мелких, прозрачных, гладких, влажных колоний диаметром 1 мм. Из-за высокой подвижности H. felis образует колонии, склонные к слиянию и образованию газона, имеющие характерный блеск при рассмотрении под углом 45°.

Для получения чистой культуры характерные колонии пересевают на неселективную среду и инкубируют в течение 3 - 5 дней, т.к. при субкультивировании Н. pylori растут быстрее, чем при первичном посеве исследуемого материала.

Фенотипическая идентификация Н. pylori производится при изучении культуральных, морфологических и биохимических свойств. Из колоний готовят мазки, окрашивают по Граму, изучают подвижность и ставят тесты на оксидазу, каталазу и уреазу.

Морфологическая идентификация

3.24. Микроскопическое исследование препаратов, приготовленных из колоний и окрашенных по Граму, может показать различие между морфологией клеток: в мазках могут быть видны прямые или слегка изогнутые палочки, а также кокковидные формы. Инволюционные кокковидные формы могут появиться при старении культуры на 6 - 7 день культивирования либо после пассажей. Н. pylori имеет вид коротких спиралей в виде букв "С" или "S", часто образует пары в виде "крыльев чайки". Н. felis имеет более длинную спираль и обладает характерной морфологией в виде штопора с плотными спиралями.

Подвижность определяют в препарате "раздавленная капля" при фазово-контрастной микроскопии. Для изучения подвижности также можно использовать окрашенный препарат "раздавленная капля". Для витальной окраски в каплю взвеси бактерий в физиологическом растворе вносят петлей раствор фуксина, накрывают покровным стеклом и сразу же микроскопируют под иммерсионным микроскопом. В молодых культурах Н. pylori проявляют "плавающую" подвижность, снижающуюся при старении культуры. Н. felis обладает высокой подвижностью и совершает стремительные штопорообразные движения.

Биохимическая идентификация

3.25. Биохимическая идентификация предполагает изучение наличия трех основных ферментов: цитохромоксидазы, каталазы и уреазы.

Цитохромоксидазу изучают стандартным методом. Для этого колонию петлей наносят на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом - 1 % раствором тетраметилпарафенилендиамина, через 5 - 10 сек оксидазоположительная культура приобретает пурпурную или черную окраску. Этот тест можно выполнить и непосредственно на поверхности агара в чашке Петри, нанеся на исследуемые колонии каплю реактива. Негативный контроль оксидазного теста - Е. coli АТСС 25922, позитивный контроль - P. aeruginosa АТСС 27853.

Для изучения каталазы в каплю 3 % перекиси водорода вносят петлей культуру бактерий и о наличии фермента судят по наличию пузырьков через 3 - 5 сек. При постановке теста с культурой, выросшей на кровяном агаре, для предотвращения ложноположительных результатов теста, следует избегать захвата среды. Позитивным контролем служит суточная агаровая культура Е. coli АТСС 25922, негативным - культура S. pyogenes АТСС 12344.

Наиважнейший фермент для идентификации - уреаза. Данный фермент определяют путем внесения культуры в несколько капель среды с мочевиной с индикатором, изменение цвета указывает на присутствие этого фермента. Для этого в пробирку вносят 2 % раствор мочевины по Кристенсену с индикатором феноловым красным, а затем добавляют исследуемую культуру. Результаты реакции наблюдают в первую секунду - раствор мочевины резко изменяет свою окраску с ярко-желтой на темно-малиновую. Негативный контроль - суточная культура Е. coli АТСС 25922, положительный контроль - 72-часовая культура Н. pylori АТСС 43504.

Для определения уреазной активности может быть использован бульон Стюарта с мочевиной, содержащей 0,1 г дрожжевого экстракта, 0,091 г KH ₂PO ₄, 0,095 г Na ₂HPO ₄, 20,0 г мочевины, 0,01 г фенолового красного, 1 л дистиллированной воды. Значение pH 6.9 доводят при добавлении по каплям соляной кислоты.

В качестве уреазного теста можно использовать среду с мочевиной, предложенную для идентификации энтеробактерий, содержащей 1 г пептона, 5 г NaCl, 1 г глюкозы, 2 г KH ₂PO ₄, 1 л дистиллированной воды, 4 мл 0,2 % водного раствора фенолового красного. Доводят значение pH 6.9 при добавлении по каплям соляной кислоты. Стерилизуют при 0,5 атмосфере, температуре плюс 111 °C 30 мин. Хранят основу в холодильнике при температуре плюс 4 °C. При необходимости использования в 100 мл основы добавляют над спиртовкой 4 мл 50 % раствора мочевины и разливают по пробиркам в количестве 0,3 - 0,5 мл. На этой среде реакция становится положительной через 6 - 24 ч, поэтому для ускорения предложен ряд модификаций, в частности увеличение содержания мочевины до 6 %, что сокращает время реакции до 20 мин.

Исследование по определению биохимической активности бактерий рода Helicobacter с использованием коммерческих тестов (наборов) реагентов осуществляется в соответствии с инструкцией производителя.

Генетическая идентификация

3.26. Идентификацию Н. pylori и дифференцировку от других видов бактерий рода Helicobacter можно производить молекулярно-биологическим методом с использованием коммерческих тест-систем для постановки ПЦР в соответствии с инструкцией производителя (см. п.п. 3.34 - 3.42).

Идентификация на основе метода матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с время пролетным разделением масс-спектрометрии

3.27. Для идентификации Н. pylori может быть использован метод времяпролетной масс-спектрометрии с матрично ассоциированной лазерной десорбцией/ионизацией (англ. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass-Spectrometry, MALDI-ToF масс-спектрометрия) в соответствии с инструкцией по пробоподготовке производителя оборудования. Н. pylori включен в базы данных масс-спектрометров с пометкой "организмы с низкой точностью идентификации", что требует подтверждения посредством альтернативного метода идентификации.

Длительное хранение культур Н. pylori

3.28. Заморозка чистых культур Н. pylori предполагает возможность длительного сохранения штамма в лабораторных условиях с целью дальнейшего изучения его свойств.

Используется два типа сред:

- среда N 1. 1/3 Фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко без ионов магния и хлора (англ. Dulbecco's phosphate-buffered saline solution, далее - DPBS), 1/3 Фетальная бычья сыворотка (англ. Fetal bovine serum, далее - FSC) и 1/3 глицерина;

- среда N 2. 1:10 Диметилсульфоксид (англ. Dimethyl sulfoxide, далее - DMSO) и FSC.

После приготовления сред для заморозки их фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл.

С чашек Петри с чистой культурой Н. pylori снимают стерильной микробиологической петлей колонии клеток и помещают их в пробирки с 0,5 мл стерильного DPBS. Для длительного хранения, количество собранных клеток должно составлять не менее 10 ⁸ КОЕ/мл. Данное содержание можно определить при помощи стандартов мутности или другим доступным методом. Приготовленный инокулюм разливают по 50 мкл в пробирки со средой для заморозки, тщательно перемешивают и замораживают при температуре минус 70 - 80 °C.

Длительное хранение и учет культур Н. pylori осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ¹⁸.

------------------------------

¹⁸П. 493-506 гл. IV, прил. 7 СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Выведение культур из заморозки

3.29. Пробирки с замороженной культурой размораживают в термостате при температуре плюс 37 °C 5 - 7 мин, после чего культуру тщательно перемешивают и осаждают центрифугированием 5 мин при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость (супернатант) снимают пипеткой и добавляют к осадку 50 мкл стерильного физраствора. Полученную суспензию тщательно перемешивают и засевают на питательную среду.

Определение чувствительности культур Н. pylori к антимикробным препаратам

3.30. Исследование чувствительности Н. pylori к АМП производится путем определения МПК либо градиентным методом в соответствии с методическими документами ¹⁹. Критерии интерпретации результатов для диско-диффузионного метода не установлены. Рекомендуется определять чувствительность Н. pylori к амоксициллину, левофлоксацину, кларитромицину, тетрациклину, метронидазолу и рифампицину. При тестировании используют двойные серийные разведения химически чистых субстанций АМП. Различают основные растворы АМП (пригодные для хранения) и рабочие растворы, используемые для приготовления питательных сред. Для приготовления основных растворов АМП предпочтительно использовать субстанции препаратов с известной активностью. Расчет навески АМП и растворителя для приготовления основного раствора проводят в соответствии с методическими документами ²⁰. Рабочие растворы АМП готовят на дистиллированной воде в концентрациях, необходимых для внесения в питательную среду.

------------------------------

¹⁹ Клинические рекомендации. "Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам".

²⁰П. 4.2 МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам", утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 04.03.2004.

------------------------------

Метод серийных разведений агаре

3.31. Исследование проводят с использованием катион-сбалансированного агара Мюллера-Хинтона с добавлением 5 % лизированной лошадиной крови. Контролем служит чашка Петри с питательной средой без АМП.

В качестве инокулюма используют 72-часовую культуру Н. pylori, разведенную в 3 - 5 мл стерильного физиологического раствора до достижения плотности, эквивалентной стандарту мутности 2 по МакФарланду с непосредственной последующей инокуляцией. Инкубацию производят при температуре плюс 35 - 37 °C в микроаэрофильной атмосфере культивирования в течение 72 ч до появления видимого роста. При тестировании на чувствительность к метронидазолу первые 24 ч инкубации в анаэробных условиях, затем 48 ч - в микроаэрофильных условиях. За значение МПК принимается наименьшая концентрация АМП, при которой подавляется видимый рост микроорганизма.

Метод микроразведений в бульоне

3.32. Исследование проводят с использованием катион-сбалансированного бульона Мюллера-Хинтона с добавлением 5 % лизированной лошадиной крови. Контролем служит лунка с питательной средой без АМП.

В качестве инокулюма используют 72-часовую чистую культуру Н. pylori, разведенную в 3 - 5 мл стерильном физиологическом растворе до достижения плотности, эквивалентной стандарту мутности 2 по МакФарланду. Инкубацию производят при температуре плюс 35 - 37 °C в микроаэрофильной атмосфере культивирования в течение 72 ч. За значение МПК принимается наименьшая концентрация АМП, при которой наблюдается значимое снижение мутности.

Е-тест (градиентный метод)

3.33. Определение чувствительности штаммов Н. pylori к АМП градиентным методом с использованием коммерческих тест систем (Е-тестов) производится в соответствии с рекомендациями производителей. Посев культуры Н. pylori проводят на чашки с катион-сбалансированным агаром Мюллера-Хинтона с добавлением 5 % дефибринированной лошадиной крови. В качестве инокулюма используют 72-часовую чистую культуру Н. pylori, разведенную в 3 - 5 мл стерильного физиологического раствора до достижения плотности, эквивалентной стандарту мутности 2 по МакФарланду. Инкубацию производят при температуре плюс 35 - 37 °C в микроаэрофильной атмосфере культивирования в течение 72 ч. При определении значения МПК необходимо производить просмотр чашек под углом и использовать увеличительное стекло. При учете результатов для бактерицидных препаратов (амоксициллин, левофлоксацин, метронидазол, рифампицин) значение МПК соответствует полному отсутствию роста микроорганизма, включая микроколонии, "пылевидный рост" и отдельные колонии. Для бактериостатических препаратов (кларитромицин, тетрациклин) при "размытой" зоне подавления роста учитывают 80 % от края зоны ингибирования роста.

Критерии оценки чувствительности Н. pylori к основным АМП приведены в табл. 4.

Таблица 4

Критерии оценки чувствительности Н. pylori к АМП

АМП	Пограничные значения МПК, мг/л		Референсные значения МПК для контрольного штамма H. pylori АТСС 43504 (NCTC 11637)
	Чувствительный (S), (Ч),	Резистентный (R), (Р), >
Амоксициллин	0,125	0,125	0,015 - 0,125
Левофлоксацин	1,0	1,0	отсутствуют
Кларитромицин	0,25	0,5	0,015 - 0,125
Тетрациклин	1,0	1,0	0,125 - 1
Метронидазол	8,0	8,0	64 - 256
Рифампицин	1,0	1,0	отсутствуют

Интерпретация результатов проводится с учетом данных, приведенных в табл. 4 с соотнесением штаммов к "чувствительным" (чувствительный при стандартном режиме дозирования - S (Ч)), "устойчивым" (резистентный - R (Р)), "промежуточным" (чувствительный при увеличенной экспозиции АМП - I (У)).

Молекулярно-биологический метод

3.34. В основе метода лежит выявление специфического фрагмента ДНК микроорганизма путем накопления (амплификации) копий данного фрагмента (ДНК-мишени) в процессе синтеза новых цепей ДНК. ПЦР представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок - праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК-мишени. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при температуре плюс 94 °C происходит разделение цепей ДНК, затем при температуре плюс 57 - 62 °C - присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре плюс 72 °C протекает синтез новых цепей ДНК путем удлинения праймера в направлении 5' - 3'. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 35 - 40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для его детекции.

3.35. Молекулярно-биологические исследования рекомендуется применять:

- для первичной диагностики инфекции Н. pylori;

- для контроля эффективности антибактериального лечения через 4 - 6 недель после его окончания;

- для выявления мутаций в геноме Н. pylori, обусловливающих устойчивость микроорганизма к антибиотикам (используется в научных исследованиях при наличии соответствующих тест-систем).

Метод ПЦР является экспресс-методом диагностики, поэтому его можно использовать как ускоренный предварительный тест при выполнении культурального исследования.

В лаборатории в соответствии с этапами проведения анализа выделяют:

- рабочую зону 1 (приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала);

- рабочую зону 2 (для выделения нуклеиновых кислот);

- рабочую зону 3 (для проведения реакции амплификации и учета результатов при использовании гибридизационно-флуоресцентного метода).

Рекомендуется разделить рабочую зону 3 на две подзоны (3а и 3б) и разместить их в отдельных помещениях. В подзоне 3а осуществляют приготовление реакционных смесей, в подзоне 3б проводят амплификацию нуклеиновых кислот и учет результатов при использовании гибридизационно-флуоресцентного метода детекции.

3.36. Материалом для исследования служат биоптаты слизистой оболочки желудка. Для коммерческих тест-систем материалом для исследования могут быть как биоптаты слизистой оболочки желудка, так и желудочный сок, фекалии, в соответствии с инструкцией производителя. Подготовка клинических образцов производится в соответствии с инструкцией производителя ПЦР тест-систем. Отрицательный результат исследования методом ПЦР, полученный на таких типах клинического материала, как слюна, соскобы зубного налета, фекалии валидного значения не имеет.

3.37. Предварительная обработка биоптатов описана в п. 3.8. Предварительной обработки желудочного сока не требуется.

Предварительная обработка фекалий проводится путем приготовления фекальной суспензии. Для этого в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл вносят 0,8 мл физиологического раствора и 0,1 г (0,1 мл) фекалий и тщательно ресуспендируют на вортексе до гомогенной суспензии. Затем пробирки центрифугируют при 7000 - 12000 g в течение 5 мин. Отдельным наконечником с фильтром отбирают бактериальную фракцию в объеме 0,05 мл (верхняя бело-желтая часть образовавшегося осадка) и переносят в новую пробирку на 1,5 мл, содержащую 0,8 мл физиологического раствора, тщательно ресуспендируют осадок и центрифугируют при 7000 - 12000 g в течение 15 мин. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,3 мл физиологического раствора. При отсутствии бело-желтого пограничного осадка отбирают 0,1 мл со дна пробирки или 0,1 мл с границы осадка или супернатанта. Объем ресуспендированного осадка для выделения ДНК Н. pylori берется согласно инструкции производителя тест-систем, обычно 100 мкл.

3.38. Проведение ПЦР-анализа включает 3 основных лабораторных этапа:

- выделение ДНК из клинических проб;

- амплификация специфического ДНК-фрагмента;

- детекция специфического ДНК-продукта амплификации.

Необходимое оборудование, реактивы, расходные материалы для каждого этапа приведены в приложении 2 к настоящим МР.

3.39. Для экстракции и очистки ДНК из клинического материала используют сертифицированные наборы для выделения ДНК согласно прилагаемой к тест-системе инструкции. При выделении используется ВКО (внутренний контрольный образец), который позволяет контролировать процедуру исследования для каждого образца. Принцип выделения состоит в температурной обработке пробы многокомпонентным лизирующим раствором, разрушающим комплекс нуклеиновых кислот с белками с последующей сорбцией нуклеиновых кислот на твердой фазе или осаждением спиртом, спиртовыми отмывками с последующей элюцией.

3.40. Детекция гена ure C Н. pylori осуществляется двумя способами.

1 способ. Гибридизационно-флуоресцентная детекция с анализом продуктов реакции по конечной точке (англ. End Point PCR).

Регистрируется накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала после завершения ПЦР с помощью детекторов флуоресценции. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются с комплементарным участком ДНК-мишени, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Детекция результатов осуществляется в закрытых пробирках, что позволяет свести к минимуму риск контаминации продуктами амплификации.

2 способ. Гибридизационно-флуоресцентная детекция с учетом результатов в режиме реального времени (англ. Real-time PCR).

Этот способ детекции обладает наибольшей точностью и надежностью результатов по сравнению с электрофоретической детекцией и End Point PCR. Принципиальной особенностью ПЦР с учетом результатов в реальном времени является возможность детекции продуктов амплификации непосредственно во время реакции амплификации.

ПЦР с учетом результатов в реальном времени включает в себя те же этапы: выделение ДНК из исследуемых образцов; ПЦР-амплификацию участка ДНК данного микроорганизма и гибридизационно-флуоресцентную детекцию, которая проводится непосредственно в каждом цикле ПЦР. Экстракция ДНК из исследуемых образцов проводится в присутствии внутреннего контрольного образца, который позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца.

Для постановки реакции амплификации используются реакционные смеси, содержащие праймеры, ДНК-зонды (существует несколько вариантов), дезоксинуклеотидтрифосфаты, Tag-полимеразу, буфер. В пробирку с реакционной смесью отдельным наконечником с фильтром вносят раствор выделенной ДНК в количестве, определяемом производителем тест-системы. Увеличение сигналов флуоресценции происходит благодаря использованию специфичных для данного участка ДНК Н. pylori гибридизационных ДНК-зондов, которые в ходе реакции связываются с одной из цепей ДНК, обеспечивая этим дополнительную специфичность метода. В одном из вариантов (TagMan) ДНК-зонд содержит на одном конце флуоресцентный краситель, а на другом гаситель флуоресценции. В ходе ПЦР зонд расщепляется и происходит разобщение красителя и гасителя, приводящее по мере накопления продукта реакции к возрастанию сигнала флуоресценции.

Для постановки ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени используются специальные амплификаторы с оптическим блоком, позволяющим детектировать флуоресценцию.

3.41. Для учета результатов ПЦР используют инструкцию к тест-системе. Регистрация полученных результатов при гибридизационно-флуоресцентной детекции проводится автоматически с помощью программного обеспечения.

3.42. Интерпретация результатов. Результатом анализа могут быть следующие варианты, формулируемые в заключении:

- ДНК Н. pylori обнаружена;

- ДНК Н. pylori не обнаружена.

Отрицательный результат исследования на выявление гена ure C Н. pylori подтверждается другим методом диагностики.

Иммунохроматографический анализ (ИХА)

3.43. Определение антигена Н. pylori в фекалиях проводят с помощью иммунохроматографического анализа с использованием моно- или поликлональных анти Н. pylori антител. Использование поликлональных анти Н. pylori антител ограничивается тем, что, несмотря на высокие чувствительность, специфичность, позитивное и негативное прогностическое значение до лечения, его чувствительность и позитивное прогностическое значение после лечения снижаются. Тест с использованием моноклональных анти Н. pylori антител имеет высокие прогностические показатели, чувствительность и специфичность как до эрадикационного лечения, так и после него.

3.44. Принцип метода: анализируемый образец жидкого биологического материала абсорбируется поглощающим участком тест-полоски. При наличии в образце клеток Н. pylori они вступают в реакцию со специфическими моноклональными антителами против Н. pylori, меченными окрашенными частицами и образуется окрашенный иммунный комплекс.

Подготовку образцов и анализ проводят в соответствии с рекомендациями производителей тест-систем.

Интерпретация результатов.

Выявление в тестовом окошке кассеты одной цветной контрольной линии свидетельствует об отрицательном результате анализа, т.е. указывает на отсутствие в анализируемом образце кала клеток Н. pylori. Выявление в тестовом окошке кассеты двух параллельных окрашенных линий свидетельствует о положительном результате анализа, т.е. указывает на наличие в анализируемом образце кала клеток Н. pylori. Интенсивность окрашенной аналитической линии в тестовом окошке кассеты может меняться в зависимости от концентрации клеток Н. pylori в образце. При появлении одной аналитической линии или отсутствии линий результат анализа считается недействительным. При этом анализ следует повторить с использованием другого теста.

Избыточное количество образца кала может привести к появлению в тестовом окошке кассеты нечетких линий темного цвета, которые не имеют диагностического значения. В этом случае следует добавить в образец кала большее количество растворителя и повторить анализ с использованием другого теста.

В случае отрицательного результата необходимы дополнительные исследования с использованием альтернативных методов.

Чувствительность и специфичность метода - до 95 - 98 %.

Иммунологический метод

3.45. Колонизация Н. pylori вызывает в организме системный иммунный ответ, который отражает продукцию антител в слизистой оболочке желудка. Через 3 - 4 недели после инфицирования в слизистой оболочке желудка и в крови появляются антитела к Н. pylori. Наилучшие результаты были получены при использовании ИФА и его производных - иммуноблота и иммунодота. Специфичность и чувствительность ИФА зависит от происхождения антигенов. Они должны быть высоко иммуногенными, общими для всех штаммов Н. pylori и отсутствовать у других бактерий, простыми в приготовлении и стабильными при хранении. В настоящее время большинство коммерческих наборов для ИФА используют смесь специфических антигенов Н. pylori (например, UreB, VacA, CagA), состав которых запатентован. Специфичность и чувствительность ИФА с использованием этих антигенов составляет более 90 %. Иммунологическое исследование проводится для эпидемиологического скрининга крови и диагностики заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки, как составная часть комплексного обследования пациентов.

Инфекция, вызванная Н. pylori, имеет хроническое течение, поэтому преобладающим классом антител являются иммуноглобулины (англ. immunoglobulin, далее - Ig) класса G. Ранние антитела класса IgM обнаруживают не часто, так как случаи острой Н. pylori-инфекции редко доступны для исследования. Уровень IgA повышается не всегда. Учитывая эти факты, большинство коммерческих тестов разработано для обнаружения IgG. Титр антител начинает снижаться после эрадикации, но возврат к исходному уровню может занять несколько месяцев или лет (снижение титра на 25 % происходит через 6 месяцев и более). Только в случае использования количественного метода ИФА и при наличии возможности сравнения уровня антител до и после лечения можно сделать определенные выводы. Информативным считается падение титра антител более чем на 50 %. Длительное ожидание для определения результатов лечения, трудность забора и хранения двух проб крови, меньшая доступность количественных методов ИФА в сравнении с качественными методами не позволяют рекомендовать серодиагностику для контроля эффективности эрадикационной терапии. В качестве диагностического теста для Н. pylori данный метод можно использовать при кровоточащих язвах, атрофии слизистой желудка, MALT-лимфоме желудка, раке желудка, недавнем использовании или использовании во время исследования ингибиторов протонной помпы (далее - ИПП) и антибиотиков.

Иммунологическую диагностику методом ИФА проводят с использованием наборов реагентов, разрешенных для применения в установленном порядке ²¹. Для исследования используется сыворотка крови, все манипуляции и интерпретация результатов проводятся по инструкции изготовителя диагностического набора. Результаты учитываются на спектрофотометре при длине волны 450/620 нм. Расчеты проводятся графоаналитическим методом. Присутствие взвеси или преципитата в сыворотке может быть причиной получения неправильных результатов. Такие образцы перед исследованием должны быть центрифугированы или профильтрованы.

------------------------------

²¹Ч. 4 ст. 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416.

------------------------------

Иммунологический метод применяется при первичной диагностике Н. pylori инфекции, для контроля эрадикации не используется. Специфичность иммунологического метода более 90 %, чувствительность 59 - 71 %.

Биохимический метод

3.46. Н. pylori - продуцент уреазы, которая разлагает мочевину до углекислого газа и ионов аммония. Для выявления уреазы предложен биохимический метод, лежащий в основе уреазного теста и дыхательного теста с мочевиной. Для адаптации в своей экологической нише Н. pylori производит огромное количество уреазы. Другие уреазоположительные микроорганизмы, присутствующие в слизистой оболочке желудка, такие как стафилококки, стрептококки, грибы рода Candida, продуцируют небольшое количество уреазы, которое не определяется при кратковременной детекции (менее 2 ч), делая этот метод специфичным при экспресс-диагностике инфекции, обусловленной Н. pylori.

Виды уреазных тестов:

- БУТ;

- УДТ.

3.47. БУТ обнаруживают инфицирование Н. pylori по изменению цвета индикатора в результате защелачивания среды аммиаком, выделившимся в процессе гидролиза мочевины микробной уреазой. Большинство тестов содержат в качестве индикатора феноловый красный и изменяют свой цвет с желтого на красный в период времени от 20 мин до 24 ч. Но следует учитывать, что при желудочном кровотечении чувствительность уреазных тестов снижается примерно на 25 %.

Принцип метода. Для постановки БУТ в диагностическую среду, состоящую из мочевины и индикатора, помещают биоптат и отмечают время изменения окраски (от 1 ч до 24 ч), которое косвенно указывает на количество возбудителя.

Для проведения БУТ могут быть использованы среды, обычно применяемые в бактериологии, например, среда Кристенсена (п. 3.23), а также специально разработаны коммерческие тесты, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке ²².

------------------------------

²²Ч. 4 ст. 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416.

------------------------------

По консистенции основы уреазные тесты подразделяют на жидкие и твердые. Тесты, основанные на агаризованных средах, проявляют хорошую чувствительность только после 24 ч инкубирования (90 - 95 %), а после 1 ч чувствительность составляет 70 - 80 %, что не позволяет отнести их к быстрым методам диагностики. К тому же присутствие других уреазоположительных бактерий, таких как Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, снижает специфичность этих тестов.

Учет результата теста раньше рекомендованного времени приводит к снижению чувствительности на 20 %. Этот недостаток могут восполнить коммерческие тесты, учет результатов которых может быть произведен через 5 - 15 мин после помещения образца. К ложноположительным результатам может привести прием антисекреторных препаратов или присутствие в желудке других уреазоположительных бактерий рода Helicobacter, например, Н. heilmannii. Поэтому данный метод не может быть единственным для постановки диагноза и подтверждается другим, прямым методом диагностики. Возможно повторное использование биоптата после постановки БУТ для проведения молекулярно-биологического исследования по выявлению Н. pylori и генов резистентности к антибиотикам.

Чувствительность метода составляет 75 - 95 %, специфичность - 80 - 95 %.

3.48. УДТ (англ. urea breath test, UBT) является специфичным и чувствительным тестом для выявления Н. pylori инфекции. Данный метод относительно простой в исполнении, точный, с высокой степенью воспроизводимости.

Принцип метода. УДТ основан на регистрации активности фермента уреазы Н. pylori. При проведении теста раствор мочевины, меченной изотопом ¹³С, дается пациенту. Мочевина разлагается в желудке уреазой Н. pylori до образования аммония и меченного углекислого газа ( ¹³СО ₂). На уровне кишечника ¹³СО ₂ попадает в кровь и выводится легкими. Выдыхаемый воздух собирается в специальные контейнеры до приема мочевины (контроль) и спустя 30 мин после (опыт). Соотношение ¹³С/ ¹²С анализируют с помощью масс-спектрометра на основе лазерного и инфракрасного излучения. Если пациент не инфицирован Н. pylori, то большинство изотопа удаляется с мочой, а в выдыхаемом воздухе большую часть составляет немеченый СО ₂.

Методика проведения отбора проб. Перед началом проведения теста пациенту рекомендуется в качестве адъюванта прием 200 мл апельсинового или грейпфрутового сока. Через 5 - 10 мин после приема напитка проводится сбор выдыхаемого воздуха для базового замера соотношения ¹³СО ₂/ ¹²СО ₂ в выдохе. Для этого пациент должен осуществить выдох в первый пакет, особенно последнюю (альвеолярную) часть воздуха, что является весьма важным для обеспечения точности теста. Перед выдохом пакет N 1 маркируется любым принятым способом, включая штрихкодирование. Непосредственно после выдоха пакет герметично закрывается крышкой.

Далее готовят раствор, растворяя реагент ( ¹³С-мочевина 99 % обогащения по изотопу ¹³С) в 50 мл дистиллированной (питьевой кипяченой, минеральной негазированной) воды, при этом раствор должен использоваться в течение 5 мин после приготовления. Пациент выпивает приготовленный раствор с препаратом полностью (50 мл). После приема препарата пациент должен находиться в спокойном состоянии для того, чтобы на результаты исследования не влиял СО ₂, выделяемый при физической нагрузке. Через 30 мин после приема раствора пациент выдыхает воздух в пакет N 2, который маркируются любым принятым способом, включая штрихкодирование. Непосредственно после выдоха пакет герметично закрывается крышкой. Образцы отправляются в лабораторию для определения изотопного отношения ¹³С/ ¹²С на ИК-спектрометре. Герметично закрытые пакеты с пробами могут храниться при комнатной температуре до 7 дней.

Для данного исследования используются диагностические тест-наборы, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке ²³.

------------------------------

²³Ч. 4 ст. 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416.

------------------------------

Регистрация результатов. При проведении дыхательного теста с применением препарата ¹³С-мочевины измеряемым показателем является - относительная разница между определяемым IRx = ( ¹³С/ ¹²С)х и стандартным изотопным отношением IRstd = (1ЗС/12C)std, измеряемая в частях на тысячу (_), формула (1):

,

(1)

где:

- IRstd = 0,011237 для углерода.

3.49. Интерпретация результатов:

- значения менее 4 _ соответствуют отсутствию уреазной активности (отрицательная уреазная активность);

- значения от 4 _ и более отмечаются при положительной уреазной активности, характерной для хеликобактериоза.

Результаты дыхательного теста существенно занижаются и могут быть ложноотрицательными при лечении ИПП. Поэтому существуют рекомендации прекращать прием антацидных средств, Н2-блокаторов и ИПП как минимум за 2 недели до выполнения теста. Ингибирующее действие на результаты дыхательного теста количественно различается у разных препаратов. Негативный эффект свойственен ранитидину, омепразолу, лансопразолу и эзомепразолу.

Распространенная метаплазия и атрофия желудочного эпителия снижают чувствительность дыхательного теста, как и других методов, основанных на определении микроорганизма и продуктов его жизнедеятельности. Ложноотрицательные результаты могут также встречаться в случае кровотечения, то есть, при наличии кровоточащей язвы или даже после взятия образцов биоптатов желудка. Ложноположительные результаты могут быть связаны с наличием сопутствующей микрофлоры, при наличии уреазоположительной нормальной микрофлоры в полости рта и в ротоглотке. В связи с этим рекомендуется тщательное полоскание рта и горла перед выполнением УДТ.

IV. Заключение

4.1. Конечный выбор диагностического теста определяется клиническими или эпидемиологическими показаниями.

Для оценки Н. pylori гастрита оптимальным является получение двух биоптатов из антрального (большая и малая кривизна 3 см проксимальнее от пилорического отдела) и двух биоптатов из тела желудка. Последний локус для биопсии обязателен, так как на фоне антисекреторного лечения язвенной болезни или гастрита воспалительный процесс в большей или меньшей степени смещается из антральной части в тело желудка. Дополнительная биопсия из incisura берется для определения пренеопластических поражений.

Другие биологические материалы от больных (желудочный сок, биоптаты слизистой ротовой полости, рвотные массы) дают высокий процент ложноотрицательных результатов (до 60 %). Исключение составляет проба фекалий, в которой успешно определяются антигены Н. pylori (при строгом соблюдении условий хранения материала перед исследованием).

Тщательное соблюдение правил хранения образцов обеспечивает корректность результатов детекции Н. pylori, его ДНК и антигенов, что обусловлено выраженной нестабильностью этого патогена вне экологической ниши. Несоблюдение правил и сроков хранения образцов является наиболее частой причиной ложноотрицательных результатов диагностики инфекции Н. pylori.

Бактериальная нагрузка Н. pylori отличается при разных клинических формах инфекции. Как правило, она максимальна при хронических гастритах. Бактериальная нагрузка снижается при язвенном кровотечении, атрофическом гастрите, предраковом состоянии, злокачественных новообразованиях (карцинома, MALT-лимфома желудка), что понижает чувствительность "инвазивных" и "неинвазивных" тестов (за исключением серологического анализа).

Противомикробные препараты при лечении гастродуоденальных и иных (сопутствующих) заболеваний значительно понижают бактериальную нагрузку Н. pylori, в ряде случаев до неопределяемого диагностическими тестами уровня. В связи с этим, рекомендуется прекращение приема противомикробных средств за 4 недели до лабораторной детекции Н. pylori с помощью "инвазивных" и "неинвазивных" тестов, за исключением серологического исследования, результаты которого не зависят от приема противоинфекционных средств. Контроль эрадикации Н. pylori после антихеликобактерной терапии, по тем же причинам, рекомендуется выполнить через 4 недели после ее завершения.

Антисекреторные средства (ИПП и в меньшей степени - ингибиторы Н ₂-рецепторов) также уменьшают бактериальную нагрузку, поскольку снижают кислотность желудочного содержимого и это сказывается на размножении Н. pylori. Прием пациентом антисекреторных препаратов прекращают за 2 недели до лабораторной диагностики Н. pylori инфекции. В случаях, когда отмена противомикробных и антисекреторных средств невозможна по клиническим показаниям, меняют тактику диагностики - отрицательный результат "инвазивных" и "неинвазивных" тестов обязательно подтверждают с помощью определения антихеликобактерных IgG-антител в сыворотке крови пациента.

При обследовании детей предпочтение отдается "неинвазивным" методам диагностики. УДТ является наиболее часто рекомендуемым тестом для детей. Доза мочевины должна быть снижена (в зависимости от массы тела). У маленьких детей используется маска, чтобы собрать весь выдыхаемый воздух. Рекомендуется использовать тест определения антигена Н. pylori в кале с использованием моноклональных антител. Содержание антихеликобактерных антител у детей ниже, чем у взрослых, поэтому отрицательный результат серологического анализа еще не означает отсутствия Н. pylori инфекции. У детей чаще встречается состояние "избыточного роста" различной микрофлоры в желудочно-кишечном тракте, что может приводить к ложноположительным результатам уреазных тестов, поскольку некоторые виды микроорганизмов, в частности, стрептококки, грибы рода Candida и стафилококки продуцируют уреазу (хотя и с меньшей интенсивностью, чем хеликобактерии).

У пациентов пожилого возраста, в связи с частой атрофией железистого эпителия желудка и многими сопутствующими заболеваниями и лечебными мерами против них, повышена вероятность ложноотрицательных результатов. В связи с этим, отрицательные данные "инвазивных" и "неинвазивных" тестов подтверждаются иммунологическим методом.

4.2. Наиболее оптимальными тестами первичной диагностики Н. pylori инфекции являются УДТ и определение антигена Н. pylori в кале с помощью ИХА. Выявление антител класса IgG к Н. pylori методом ИФА может применяться дополнительно для первичной диагностики инфекции Н. pylori, особенно в случаях кровотечений при язве желудка, MALT-лимфомы, рака желудка, атрофии, недавнего применения АМП и ИПП.

Если больным проводится ЭГДС, то методом первичной диагностики может быть БУТ. Биоптат, используемый для постановки БУТ, может быть в дальнейшем использован для проведения молекулярно-биологического исследования. БУТ и иммунологический метод не рекомендуется для оценки эрадикации Н. pylori после лечения. Гистологический (иммуногистохимический) и цитологический методы проводятся для выявления морфологических изменений слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки и обнаружения Н. pylori.

Бактериологический метод применяется для выявления чувствительности к кларитромицину до назначения антимикробной терапии и в случаях неэффективности лечения для определения чувствительности к другим АМП, входящим в схемы эрадикации Н. pylori. Для выявления генов резистентности Н. pylori к кларитромицину и другим АМП непосредственно в биоптате можно использовать молекулярно-биологический метод.

Для контроля эрадикации рекомендуется применять УДТ или определение антигена Н. pylori в фекалиях. Исследование должно быть проведено не ранее 4 недель после окончания приема химиопрепаратов и 2 недель после завершения приема ИПП. Отрицательный результат исследования на инфекцию Н. pylori подтверждается другим методом диагностики, кроме иммунологического.

Выбор метода диагностики Н. pylori-инфекции проводится в конкретной клинической ситуации и определяется необходимостью первичной диагностики инфекции или верификации эрадикации возбудителя, оснащенностью лабораторно-диагностической базы, кадровым составом специалистов МО, а также состоянием пациента.

Нормативные и методические документы

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Федеральный закон от 21.11.2011 N 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации".

3. Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий".

4. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".

5. Приказ Минздрава России от 02.05.2023 N 206н "Об утверждении квалификационных требований к медицинским и фармацевтическим работникам с высшим образованием".

6. Приказ Минтруда России от 14.03.2018 N 145н "Об утверждении профессионального стандарта "Специалист в области клинической лабораторной диагностики".

7. Приказ Минздрава России от 18.05.2021 N 464н "Об утверждении Правил проведения лабораторных исследований".

8. Приказ Минтруда России от 25.06.2015 N 399н "Об утверждении профессионального стандарта "Специалист в области медико-профилактического дела".

9. Приказ Минтруда России от 08.06.2021 N 384н "Об утверждении профессионального стандарта "Специалист в области медицинской микробиологии".

10. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности".

11. МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам".

12. Клинические рекомендации. Выделение, идентификация и определение чувствительности Helicobacter pylori к антимикробным препаратам.

13. Клинические рекомендации. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам.

14. ГОСТ 177 "Реактивы. Перекись водорода".

15. ГОСТ 3118 "Реактивы. Кислота соляная".

16. ГОСТ 4172 "Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный".

17. ГОСТ 4198 "Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный".

18. ГОСТ 4233 "Реактивы. Натрий хлористый".

19. ГОСТ 4599 "Реактивы. Феноловый красный".

20. ГОСТ 6038 "Реактивы. D-глюкоза".

21. ГОСТ 6259 "Реактивы. Глицерин. Технические условия".

22. ГОСТ 6691 "Реактивы. Карбамид".

23. ГОСТ 10444.1 "Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе".

24. ГОСТ 13805 "Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей".

25. ГОСТ Р 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

Библиографические ссылки

1. Аруин Л.И. Хронический гастрит / Аруин Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А. и др. //Амстердам. 1993. 362 с.

2. Гастроэнтерология: национальное руководство / Под ред. В.Т. Ивашкина, Т.Л. Лапиной // М.: ГЭОТАР-Медиа. 2008. 704 с. (серия Национальные руководства).

3. Исаева Г.Ш. Окраска катионовым синим О для цитологического выявления Helicobacter pylori / Исаева Г.Ш., Ефимова Н.Г., Хайрутдинова Г.Н. // Клиническая лабораторная диагностика. 2009. N 5. С. 19 - 20, 37.

4. Bordin D.S. Current Helicobacter pylori / Bordin D.S., Voynovan I.N., Andreev D.N. et al. // Diagnostics. Diagnostics (Basel). 2021. Vol. 12. N 11(8). 1458.

5. Blanchard T.G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. / Blanchard T.G., Nedrud J.G. // Current Protocols in Microbiology. Epsilon Proteobacteria (suppl. 24). Unit 8B.1.1 - 8B.1.19. 2012.

6. Fox J.G. The non-H.pylori helicobacters: their expanding role in gastrointestinal and systemic diseases // Gut. 2002.Vol.50. P. 273 - 283.

7. Isaeva G. Biological properties and pathogeneciry factors of Helicobacter pylori / Isaeva G., Fagoonee S. // Minerva Gastroenterologica e Dietologica 2018. Vol. 14.

8. Malfertheiner P. Management of Helicobacter pylori infection - the Maastricht VI/Florence Consensus Report / Malfertheiner P., Megraud F., Rokkas T. et al. // Gut. 2022. Vol. 8.

9. Marshall В.J. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration / Marshall B.J., Warren L.R. // Lancet. 1984. Vol. 1(8390). P. 1311 - 1315.

10. Medakina I. Helicobacter pylori Antibiotic Resistance: Molecular Basis and Diagnostic / Medakina I., Tsapkova L., Polyakova V. et al. // Methodslnt J Mol Sci. 2023. Vol. 29; 24(11): 9433.

11. Solnick J.V. Emergence of diverse Helicobacter species in the pathogenesis of gastric and enterohepatic diseases / Solnick J.V, Schauer D.B // ClinMicrobiol Rev. 2001. Vol. 14(1). P. 59 - 97.