Глава 3. Минорные биологически активные компоненты БАД (методы определения подлинности БАД

Глава 3
Минорные биологически активные компоненты БАД
(методы определения подлинности БАД)

1. Определение антоцианинов

Антоцианины являются водо-растворимыми пигментами, обусловливающими красную, синюю и фиолетовую окраску фруктов. Они относятся к классу флавоноидов и предсталяют собой гликозиды катиона флавония (рис. 1).

R_1	R_2	Агликон	Сокращенное название
Н	Н	пеларгонидин	Pgd
ОН	Н	цианидин	Cyd
ОМе	Н	пеонидин	Pnd
ОН	ОН	дельфинидин	Dpd
ОМе	ОН	петунидин	Ptd
ОМе	ОМе	мальвидин	Mvd
R_3 и R_4 - Н или гликозид

1.1. Методика определения качественного и количественного состава антоцианиновых пигментов с помощью ВЭЖХ

Образцы БАД с антоцианин-содержащими компонентами (экстракты черники, красного винограда и т.д.) экстрагируют дистиллированной водой; образцы соковых концентратов или сиропов разбавляют дистиллированной водой таким образом, чтобы суммарная концентрация антоцианинов составляла 0,05-0,2 мг в см3. Пробы фильтруют через мембранный фильтр Zetapor с диаметром пор 0,2 мкм. Разделение проводят на хроматографической колонке PLRP-S (полистирол-дивинилбензол), PolymerLabs, Великобритания), 100 А, 5 мкм, 250 х 4,6 ID мм, элюент: 4 об.% ортофосфорная кислота, ацетонитрил, 90:10 об. %, скорость подачи элюента 1,0 см3/мин. Детектирование фотометрическое, ламбда = 520 нм.

Идентификацию пиков проводят путем сравнения с хроматограммами ягод с известным составом антоцианиновых пигментов и с литературными данными. Относительное содержание индивидуальных пигментов определяют как отношение площади хроматографического пика и суммы площадей пиков всех идентифицированных антоцианинов. Факторы удерживания антоцианинов приведены в табл. 34.

Таблица 34

Факторы удерживания антоцианиновых пигментов

N	Антоцианины		k
1	Cyd-3-sop-5-glu	цианидин-3-софорозид-5-глюкозид	1,9
2	Dpd-3-gal	дельфинидин-3-галактозид	3,0
3	Dpd-3-glu	дельфинидин-3-глюкозид	3,6
4	Cyd-3-sop	цианидин-3-софорозид	3,9
5	Cyd-3-glu-rut	цианидин-3-глюкорутинозид	4,0
6	Dpd-3-rat	дельфинидин-3-рутинозид	4,2
7	Cyd-3-gal	цианидин-3-галактозид	5,2
8	Dpd-3-ara	дельфинидин-3-арабинозид	5,5
9	Cyd-3-glu	цианидин-3-глюкозид	5,9
10	Cyd-3-xyl-rut	цианидин-3-ксилозорутинозид	6,1
11	Cyd-3-rut	цианидин-3-рутинозид	7,0
12	Ptd-3-gal	петунидин-3-галактозид	7,5
13	Cyd-3-аrа	цианидин-3-арабинозид	7,9
14	Ptd-3-glu	петунидин-3-глюкозид	8,4
15	Pgd-3-glu	пеларгонидин-3-глюкозид	9,6
16	Pnd-3-gal	пеонидин-3-галактозид	10,0
17	Pgd-3-ara	пеларгонидин-3-арабинозид	11,9
18	Pnd-3-glu	пеонидин-3-глюкозид	12,3
19	Mvd-3-glu	мальвидин-3-глюкозид	16,1
20	Pnd-3-ara	пеонидин-3-арабинозид	16,2

На рис. 2 приведена хроматограмма антоцианинов сока черники, для которой характерен самый богатый профиль пигментов.

Систематизированные литературные и экспериментальные данные по составу антоцианиновых пигментов окрашенных соков представлены в табл. 35, являются основой при оценке подлинности и качества соков, сокосодержащей продукции и БАД.

1.2. Суммарное содержание антоцианиновых пигментов

Суммарное содержание антоцианиновых пигментов определяли методом pH-дифференциальной спектрофотометрии. Известно, что поглощение антоцианиновых пигментов сильно зависит от pH раствора: в сильнокислой среде окраска большинства антоцианинов ярко-красная, при увеличении pH она постепенно переходит в темно-синюю. Это связано с изменением структуры входящего в состав пигмента агликона. Различие в адсорбции при ламбда = 510 нм и pH 1 и 4,5 пропорционально содержанию антоцианина. Так как различие в величинах молярной адсорбции индивидуальных антоцианинов незначительно, суммарную концентрацию пигментов можно определять относительно одного из них, например, цианидин-3-глюкозида (эпсилон = 26900):

             A =(A      - A     )      - (A      - A     )     ,

                  510nm    700nm pH1,0     510nm    700nm pH4,5

                                        A x MW x F x V

       C (Сумма                   ) = ------------------ x 100%, где

               антоционин, масс. %      эпсилон х l х m

     А            - поглощение,

     эпсилон и MW - коэффициент молярного поглощения и молекулярная масса

                    антоцианина, используемого в качестве стандарта  (для

                    цианидин-3-глюкозида 26900 и 449,2 соответственно)

     AF           - разведение,

     АV           - объем, мл,

     Аl           - длина кюветы, см,

     m            - масса образца, мг.

Метрологическая характеристика метода

Предел обнаружения метода 0,001%. Стандартное отклонение сходимости (Sr) не превышает 0,1-0,15. Среднее значение открываемости - 92-95%.

Таблица 35

Сок	Относительное содержание антоцианинов, %
Сок	Cyd-3-sop-5-glu	Dpd-3-gal	Dpd-3-glu	Cyd-3-sop	Cyd-3-glu-rut	Dpd-3-rut	Cyd-3-gal	Dpd-3-ara	Cyd-3-glu	Cyd-3-xyl-rut	Cyd-3-rut	Ptd-3-gal	Cyd-3-ara	Ptd-3-glu	Pgd-3-glu	Pnd-3-gal	Pgd-3-ara	Pnd-3-glu	Mvd-3-glu	Pnd-3-ага
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21
Гранат	30	24		21					25
Черника		10	14				8	9	18			10	9	3				8	10
Красный виноград			22						3-2					20-22				4-5	52-38
Черная смородина			18			44			6		32
Красная смородина				1	12				1	70	10
Слива									53		47
Клюква							16		4				20			33		10		17
Клубника									2						92		6
Черешня				15					45		40
Вишня				2	74				4		20
Малина				25	6				39		6
Ежевика									94									1
Брусника							83		5				12
Арония							60		2				32					3
Крыжовник черный						4			14		80
Калина							98	2
Ирга							75		17					8

2. Определение органических кислот с помощью ВЭЖХ

Принцип метода

Органические кислоты определяют в условиях обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Разделение органических кислот происходит в хроматографической колонке, наполненной октадецилсиликагелем. Концентрации определяют с помощью спектрофотометрического детектора при ламбда = 210 нм по методу внешнего стандарта.

Приборы и реагенты

Хроматографическая система: насос высокого давления Altex 110А (США), инжектор Rheodyne 7125 (США), колонка Kromasil С18, 5 мкм, 250 x 4,6 ID мм (MetaChem, США), спектрофотометрический детектор Spectroflow 757 (Kratos, США), система для обработки хроматографических данных МультиХром 1,5х (Амперсенд, Россия).

Подвижная фаза: 0,2 М фосфатный буфер, pH 2,6. Объемная скорость: 1,0 см3/мин. Перед использованием, подвижную фазу фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0,45 мюм) или бумажный фильтр ("синяя лента").

Реагенты: калия дигидрофосфат (КН2РО4), фосфорная кислота (Н3РО4, 85%), ацетонитрил (CH3CN), дистиллированная вода.

Приготовление проб и стандартов

Стандартные растворы кислот готовят путем растворения точных навесок соответствующих кислот (purum, >= 99%, Fluka или Sigma) в мерных колбах. Градуировочные графики строят в координатах S (площадь пика) - С (концентрация кислоты), г/дм3 в интервале концентраций 0,1-30 г/дм3 для яблочной кислоты, 0,1-40 г/дм3 для лимонной кислоты, 0,1-1 г/ дм3 для аскорбиновой кислоты, 0,05-0,5 г/дм3 для изолимонной кислоты, 0,01-0,1 г/дм3 для фумаровой кислоты. Растворы фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0,45 мкм) или бумажный фильтр ("синяя лента").

Пробы готовят растворением сухих или разбавлением жидких концентратов БАД в в 10-25 раз дистиллированной водой. Приготовленные растворы фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0,45 мкм) или бумажный фильтр ("синяя лента").

ВЭЖХ определение органических кислот

Перед проведением анализа хроматографическую колонку кондиционируют подвижной фазой ацетонитрил: вода (70:30 об.%), затем систему промывают фосфатным буфером до установления ровной базовой линии. Стандартные растворы (5-20 мкл) вводят в хроматограф попеременно через каждые 2-3 пробы (10 мкл). Порядок элюирования органических кислот в условиях ОФ ВЭЖХ следующий:

Винная < хинная < янтарная < гидроксилимонная < яблочная < изолимонная < шикимовая < аскорбиновая < фумаровая < лимонная

Коэффициенты емкости основных органических кислот, определяемых в БАД на основе фруктов и ягод, представлены в табл. 36.

Таблица 36

Кислота	k'
Винная	0,4
Хинная	0,6
Янтарная	0,8
Гидроксилимонная	1,1
Яблочная	1,2
Изолимонная	1,4
Шикимовая	1,5
Аскорбиновая	1,8
Фумаровая	3,9
Лимонная	4,4

Концентрации органических кислот в пробах рассчитываю по площадям или высотам хроматографииеских пиков.

Примеры хроматограмм органических кислот апельсина и клюквы приведены на рис. 3 и 4.

3. Определение 5-оксиметилфурфурола в БАД на основе меда и углеводных сиропов

Принцип метода

Метод определения массовой концентрации 5-оксиметилфурфурола в соках, напитках и меде основан на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Метод включает следующие этапы:

- разбавление аликвоты или навески жидкого БАД дистиллированной водой; растворение навески меда или медосодержащего БАД в дистиллированной воде;

- фильтрование полученного раствора;

- обнаружение и количественное определение ОМФ с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором с использованием метода внешнего стандарта.

Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 см3/мин., оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных Мультихром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18) с размером частиц 5 мкм; длина колонки - 25 см, предколонки - 4,5 см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см;

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Спектрофотометр СФ-26, сф-46 или подобный, позволяющий проводить измерения при длинах волн 200-350 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%;

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью +-0,0001 г.

Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания до 200 г, с пределом допустимой погрешности +-0,0005 г по ГОСТ 2404-80;

Дистиллятор

Колбы мерные наливные 2-50-2,2-100-2,2-250-2,1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Термометр жидкостный стеклянный с пределами измерения 0-100°C и ценой деления 1°C по ГОСТ 28498.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Фильтры обеззольные ФО-ФС-15 "Синяя лента" по ТУ 2642-001-42624157-98;

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

Калий железистосинеродистый 3-водный по ГОСТ 4207, х. ч., раствор концентрацией 150 г/дм3 (раствор Карреза 1);

Цинк уксуснокислый 2-водный по ГОСТ 5823, ч. д. а., раствор концентрацией 300 г/дм3 (раствор Карреза II);

Фильтр нейлоновый имп. на шприце в обойме 25 мм, размер пор 0,45 мкм;

Бензол для хроматографии, х. ч. по ТУ 6-09-779-76;

Метанол - яд для жидкостной хроматографии, ос. ч. по ТУ 6-09-14-2192-85;

Кислота уксусная > 99,8%, ос. ч., ГОСТ 18270-72;

Баллон с сжатым азотом, ос.ч. по ГОСТ 9293-74;

5-оксиметилфурфурол (ОМФ) кристаллический, перекристаллизованный из метанола при температуре 64-65°C и атмосферном давлении.

Подготовка к проведению измерений

Приготовление стандартного раствора 5-оксиметилфурфурола

Приготовление основного стандартного раствора 5-ОМФ

0,05 г кристаллического 5-оксиметилфурфурола количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3, растворяют в 25 см3 ацетонитрила, доводят бензолом до метки и тщательно перемешивают. Получают стандартный раствор в смеси бензол-ацетонитрил (9:1) с массовой долей 5-оксиметилфурфурола 0,2 мкг/см3;

Приготовление рабочего стандартного раствора 5-ОМФ

Аликвоту в 1 см3 основного стандартного раствора ОМФ переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворитель отдувают досуха в токе азота, доводям метанолом до метки и тщательно перемешивают. Получают рабочий стандартный раствор ОМФ концентрацией 0,002 мкг/см3, который используют при градуировке хроматографа.

Основной и рабочий стандартные растворы 5-оксиметилфурфурола хранят в стеклянной посуде (пикнометре, мерной колбе) с притертой пробкой в прохладном месте (при температуре около 0°C). Сроки годности основного раствора 1 год, рабочего - 1 неделя.

Установление массовой доли 5-оксиметилфурфурола в рабочем стандартном растворе

Установление точной массовой доли 5-оксиметилфурфурола в рабочем стандартном растворе производят с помощью УФ-спектрофотометрии согласно данным о коэффициенте молярной экстинкции 5-оксиметилфурфурола в максимуме поглощения в УФ-спектре. Снимают УФ спектр рабочего стандартного раствора в метаноле и измеряют его оптическую плотность. Рассчитывают концентрацию ОМФ в рабочем стандартном растворе по формуле:

                               D x M x 1000

                          С = ---------------, где

                                  L х E

     С - концентрация исследуемого раствора, мкг/см3 или нг/мкл,

     D - оптическая плотность раствора;

     М - молекулярная масса 5-оксиметилфурфурола (126);

     Е - коэффициент молярной экстинкции для метанольного раствора

         (16830);

     L - толщина слоя раствора в см.

Значение относительной погрешности при определении масовой доли 5-оксиметилфурфурола в растворе с помощью УФ-спектрофотометрии не превышает 5% для доверительной вероятности 0,95.

Приготовление подвижной фазы

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 150 см3 метанола, примерно 500 см3 бидистиллированной воды и 10 см3 уксусной кислоты, перемешивают и выдерживают до комнатной температуры, затем доводят до метки бидистиллированной водой, тщательно перемешивают.

Подготовка образца

10 см3 сокосодержащего БАД или концентрата фруктового сока помещают в мерные колбы вместимостью 100 см3 или 250 см3, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Полученные растворы фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента" или нейлоновый фильтр.

5-10 г меда, медосодержащего пищевого продукта или БАД помещают в мерные колбы вместимостью 100 см3 или 250 см3, добавляют около 50 см3 дистиллированной воды, перемешивают до растворения, последовательно добавляют по 5 см3 растворов Карреза I и Карреза II, каждый раз перемешивая смесь, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента" или нейлоновый фильтр. Аликвоту полученных фильтратов вводят в хроматограф.

Выполнение измерений и вычисление результатов анализа

Условия хроматографического анализа

Подвижная фаза метанол-вода-уксусная кислота (15:84:1), скорость потока 1,0 мл/мин., обнаружение по поглощению в УФ-области спектра при длине волны 284 нм, чувствительность устанавливают 0,01 единиц адсорбции на всю шкалу, вводимый объем образца 5-15 мкл.

Вычисление результатов анализа

Массовую концентрацию 5-оксиметилфурфурола рассчитывают по формуле:

                         m x H     x V

                              обр.    общ.

                    M = ---------------------------, где

                         H   x V      x P  x 1000

                          ст    вкола

     М      - массовая концентрация 5-оксиметилфурфурола, мг/дм3 или мг/кг

              (ppm),

     m      - массовая   доля   внешнего   стандарта  ОМФ, введенного для

              калибровки, хроматографа, нг,

     Н      - высота   пика   исследуемого   компонента,  соответствующая

      обр     определенной массовой концентрации компонента в исследуемом

              образце, мм;

     Н      - средняя  высота пика внешнего стандарта ОМФ, введенного для

      cт.     калибровки хроматографа, мм;

     V      - общий объем анализируемой пробы, мкл;

      общ.

     V      - объем аликвоты, введенной в хроматограф, мкл;

      вкола

     Р      - навеска или объем пробы, см3 или г.

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком.

Основные характеристики метода

Предел обнаружения метода составляет 1,0 мг/кг.

Диапазон определяемых концентраций от 1,0 до 1000 мг/кг.

При соблюдении всех регламентируемых методикой условий проведения измерений относительная характеристика погрешности (стандартное отклонение сходимости) результата анализа при концентрации ОМФ в жидких БАД 2,0 мг/л не превышает 0,124 (3,43%) и при концентрации ОМФ в меде и медсодержащих БАД 5,0 мг/кг - 0,072 (5,34%).

Среднее значение открываемоеT ОМФ при концентрациях от 2,0 до 25 мг/кг составляет 87-95%.

4. Определение состава моно- и дисахаридов с помощью ВЭЖХ

Принципиальная схема метода

Метод заключается в пробоподготовке путем разбавления дистиллированной водой образцов жидких БАД или экстракции сухих БАД дистиллированной водой до концентрации сахаров примерно 2-10 мг/мл, фильтрования полученного раствора, разделении и количественном определении сахаров с помощью ВЖХ.

Приготовление стандартных растворов

Аналитические образцы фруктозы, глюкозы, сорбита и сахарозы сушат до постоянного веса согласно ГОСТ 12570-67 "Сахар-песок и сахар-рафинад. Метод определения содержания влаги".

Готовят стандартные растворы фруктозы, глюкозы, сорбита и сахарозы с концентрациями от 3 до 10 мг/см3 в зависимости от чувствительности рефрактометрического детектора. Для этого навески сахаров массой 1 +-0,001 г или 0,3 +-0,001 г помещают в мерные колбы вместимостью 100 см3, доводят бидистиллированной или дистиллированной фильтрованной через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC водой до метки и тщательно перемешивают.

Готовят стандартный раствор смеси фруктозы, глюкозы и сахарозы, с массовыми долями каждого компонента 10 мг/см3 или 3 мг/см3. Для этого навески сахаров массой 1 +-0,001 г или 0,3 +-0,001 г помещают в одну мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят бидистиллированной или дистиллированной фильтрованной через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC водой до метки и тщательно перемешивают.

Приготовление исследуемого образца

Анализируемый образец БАД растирают в ступке. Навеску массой 5 +-0,01 г помещают в мерную колбу вместимостью 250 см3, добавляют 150 см3 подогретой до 75-80°C дистиллированной воды и встряхивают на аппарате для встряхивания 20-30 мин. Добавляют 15 см3 30%-ного раствора ацетата цинка, встряхивают, охлаждают до комнатной температуры, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC или складчатый бумажный фильтр "синяя лента". Аликвоту фильтрата вводят в хроматограф.

20 см3 сокосодержащего БАД или 10 г углеводсодержащего сиропа помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят бидистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC или через складчатый бумажный фильтр обеззоленный марки ФОМ. Аликвоту фильтрата вводят в хроматограф.

Анализ с помощью ВЭЖХ

Анализ ВЭЖХ с использование амино фазы

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза ацетонитрил-вода (77:23), скорость подвижной фазы 1,0-1,5 мл/мин, аликвота, вводимая в инжектор 10-15 мкл; чувствительность рефрактометрического детектора устанавливают таким образом, чтобы ввод 100 мкг фруктозы, глюкозы или сахарозы соответствовал отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 1 до 3% от полной шкалы; входное напряжение регистрирующего потенциометра (самописца) или интегратора 10 mV.

Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах при использовании амино-фазы: фруктоза - 6 +-2, сорбит 6,5 +-2, глюкоза 7,5 +-1, сахароза 10 +-1.

Анализ ВЭЖХ с использованием колонки и предколонки с катионитом в форме Са(++)

Условия ВЭЖХ: катионообменная колонка и предколонка "Rezex RCU-USP Sugar Alcohols" в форме Са(++), температура колонки 80-90°C, подвижная фаза бидистиллированная, деионизированная и фильтрованная вода, скорость подвижной фазы 0,4-0,8 мл/мин., аликвота, вводимая в инжектор 10-15 мкл; чувствительность хроматографа устанавливается таким образом, чтобы 30 мкг фруктозы, глюкозы и сорбита соответствовало отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 1 до 3% от полной шкалы; входное напряжение регистрирующего потенциометра (самописца) или интегратора 10 mV.

Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах при использовании колонки и предколонки с катионитом в форме Са(++): сахароза 10 +-1, глюкоза 12 +-0,5, фруктоза - 14,5 +-0,2, сорбит 22 +-0,5.

Предел обнаружения метода 0,02-0,05%. Стандартное отклонение сходимости (Sr) при концентрации сахаров 10% не превышает 0,05-0,07. Среднее значение открываемости от внесенного количества сахаров - 97-99%.

Перед работой хроматограф калибруют, для чего в инжектор с помощью микрошприца вводят 0,002, 0,005 и 0,01 см3 стандартной смеси углеводов, что соответствует количествам 20, 50 и 100 мкг фруктозы, глюкозы и сахарозы (детектор RIDK 102) или 6, 15 и 30 мкг (детектор MERK L 7490). Для каждого количества углеводов определяют площадь пика на хроматограмме. Аналогичным образом проводят калибровку стандартного раствора сорбита.

Количественное определение углеводов

Идентификацию и количественное определение углеводов осуществляют методом внешних стандартов.

В инжектор хроматографа вводят 0,01 см3 (10 мкл) фильтрата. Определяют площадь пика углевода, соответствующего по времени удерживания одному из стандартов. Расчет концентрации фруктозы, глюкозы, сорбита и сахарозы проводят по формуле:

                             V  x m x S

                              1        oбp.

                    С = ------------------------, %, где

                         V  x M x S    x l0000

                          2        ст.

     С  - концентрация углевода в образце, %,

     V  - объем, до которого доведена навеска при разбавлении водой,  см3

      1   (100 см3),

     V  - объем фильтрата, внесенный в хроматограф, 0,01 см3,

     m  - масса стандарта, введенного в хроматограф, мкг,

     М  - навеска образца, взятая для анализа, г.

Если пик углевода в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ проводят повторно после разбавления фильтрата водой, т.е. после увеличения объема V_1.

5. Определение массовой концентрации кофеина, теобромина, теофиллина

Принцип метода

Метод определения массовой концентрации кофеина, теобромина, теофиллина в пищевых продуктах, БАД и безалкогольных напитках основан на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Метод анализа кофеина и теофиллина в БАДах включает следующие этапы:

- экстракцию пуриновых алкалоидов из БАД в дистиллированной воде при нагревании;

- фильтрование полученного раствора;

- обнаружение и количественное определение с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором с использованием метода внешнего стандарта.

Метод анализа теобромина, теофиллина и кофеина в пищевых продуктах и БАД на основе какао включает следующие этапы:

- экстакцию в дистиллированной воде, pH 7,3-7,8 при нагревании;

- переэкстракцию в хлороформ;

- переэкстракцию в фосфатный буфер, pH 3,0

- фильтрование полученного раствора;

- обнаружение и количественное определение пуриновых алкалоидов с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором с использованием метода внешнего стандарта.

Средства измерений, материалы и реактивы

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью +-0,0001 г.

Дистиллятор

рН-метр, модель "рН 150М".

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2,1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Термометр жидкостный стеклянный с пределами измерения 0-100°C и ценой деления 1°C по ГОСТ 28498.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Бумага фильтровальная "красная лента" и "синяя лента" по ТУ 6-09-1678-95.

Баллон с сжатым азотом марки ПНГ;

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч., ГОСТ 6552, раствор массовой концентрацией 2,72 г/дм3, доведенный до pH 3,2 добавлением 2-2,5 см3 ортофосфорной кислоты.

Кислота уксусная, ГОСТ 61-75, ч. д. а.

Кислота о-фосфорная, ч, ГОСТ 6552.

Кофеин, теобромин, теофиллин по действующей нормативно-технической документации.

Натрий гидроокись, х. ч., ГОСТ 4228, раствор массовой концентрации 0,4 г/дм3.

Натрий хлористый, х. ч., ГОСТ 4233.

Подготовка к проведению измерений

Приготовление рабочих растворов кофеина, теобромина, теофиллина (400 мг/см3)

Навески массой по 100,0+-0,1 мг помещают в мерные колбы вместимостью 250 см3, до половины заполненные дистиллированной водой. Перемешивают до полного растворения, затем доводят дистиллятом до метки и перемешивают.

Приготовление стандартных растворов кофеина, теобромина, теофиллина (0,004 мг/см)

Отмеряют пипеткой по 2,0 см3 каждого рабочего раствора кофеина, теобромина, теофиллина концентрациями 400 мг/см3, переносят в мерные колбы вместимостью 250 см3, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Приготовление подвижной фазы

Приготовление подвижной фазы для анализа кофеина

50 см2 ацетонитрила помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3, добавляют 10 см3 уксусной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу "красная лента".

Приготовление подвижной фазы для анализа смеси алкалоидов

2,72 г калия фосфорнокислого однозамещенного помещают в мерную колбу вместимостью 1 000 см3, растворяют в дистиллированной воде, перемешивают до полного растворения, доводят дистиллированной водой до метки. Полученный раствор ортофосфорной кислотой доводят до pH3,2 (2-2,5 см3). 850 см3 полученного буферного раствора смешивают с 150 см3 ацетонитрила и полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу "красная лента".

Подготовка образцов

Образцы тонизирующих напитков ("Кола", тоники) подвергают по необходимости дегазации по ГОСТ 6687.2 при температуре не более 25°C и отфильтровывают через бумажный фильтр. Аликвоту напитков (2-5 см3) помещают в мерную колбу вместимостью 250 см3, доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

Навеску пищевого продукта (2-5 +-0,01 г) (например, чай, кофе), БАД на основе натуральных растительных компонентов гуараны, орехов колы, листьев матэ и др. (5-10 капсул или таблеток, растерных в ступке) помещают в мерную колбу вместимостью 250 см3, добавляют до половины объема подогретой до 70-80°C дистиллированной воды, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 15-20 мин, охлаждают до комнатной температуры, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через бумажный фильтр с размером пор 0,5 мкм.

Навеску кондитерского изделия (10-20 +-0,01 г), содержащего какао-порошок (карамели, шоколад, ореховые пасты, глазурь и др.), измельченную на терке или в ступке, помещают в коническую колбу вместимостью 250 см3 и добавляют 100 см3 дистиллированной воды, подщелоченной 5-10 каплями раствора гидроокиси натрия (рН 7,5-8.0). Смесь подогревают до температуры 45-50°C, перемешивают на аппарате для встряхивания 20-30 мин, фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" и отбирают 80 см3 фильтрата. Если фильтрация затруднена, смесь центрифугируют при 2000 об/мин, и также отбирают 80 см3. К фильтрату добавляют 1,5-2 г хлористого натрия, перемешивают до растворения соли и переносят в делительную воронку. Пуриновые алкалоиды из водного раствора экстрагируют 50 см3 хлороформа. Хлороформный раствор отделяют и встряхивают с 50 см3 раствора калия фосфорнокислого однозамещенного, pH 3.2, после чего водный экстракт фильтруют через бумажных складчатый фильтр "синяя лента". Остатки хлороформа из фильтрата удаляют в токе азота. Аликвоту полученного экстракта вводят в хроматограф. При анализе используют метод внешнего стандарта.

Проведение анализа ВЭЖХ и расчет концентрации пуриновых оснований

Условия ВЭЖХ для хроматографического анализа кофеина: подвижная фаза ацетонитрил-вода дистиллированная-уксусная кислота (15:84:1). Скорость потока 0,7 см3/мин. Обнаружение по поглощению в УФ-области спектра при длине волны 272 нм, шкала чувствительности 0,01 Е. О.П. Вводимый объем образца 10,0 мм3.

Условия ВЭЖХ для хроматографического анализа смеси алкалоидов: подвижная фаза: раствор калия фосфорнокислого однозамещенного, pH3.2-ацетонитрил (85-15), скорость потока 0,8 см3/мин, УФ-детектирование, длина волны 272 нм, шкала чувствительности 0,01 Е. О. П. Вводимый объем образца 10,0 мм3.

Примерные времена удерживания пуриновых алкалоидов: теобромин 4.9 +-0,1, теофиллин 7.7 +-0,1, кофеин 12,0 +-0,1.

Расчет концентраций пуриновых оснований

Массовую концентрацию теобромина, теофиллина или кофеина рассчитывают по формуле:

                      S     x m    x V

                       oбp.    ст.    1

              Х = --------------------------, мг/кг, где

                   l0000 х S   х V  x M

                            ст.    2    обр.

     S    - площадь пика исследуемого компонента;

      обр.

     S    - площадь пика соответствующего стандарта;

      ст.

     V    - объем анализируемого раствора пробы, мм3;

     V    - объем экстракта, введенного в хроматограф, мм3;

     m    - масса     стандарта   пуринового  алкалоида,  введенная    в

      ст.   хроматограф, нг;

     М    - навеска образца, взятая для анализа и соответствующая объему

      обр.  фильтрата после экстракции подщелоченной водой, г, (8 г).

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений при доверительной вероятности Р = 0,95 не должно превышать 13%.

Характеристика погрешности измерений

При соблюдении всех регламентируемых методикой условий проведения измерений относительная характеристика погрешности (стандартное отклонение сходимости) результата анализа при концентрации кофеина в БАД 2,0 мг/таблетку или капсулу не превышает 0,154 (3,43%), при концентрации теобромина в пищевом продукте 5 мг/100 г - 0,066 (4,89%).

Предел обнаружения метода определения пуриновых алкалоидов (теобромина, теофиллина, кофеина) в пищевых продуктах составляет 1,0-2,0 мг/кг. Диапазон определяемых концентраций от 1.0 до 1000 мг/кг.

Среднее значение открываемости пуриновых алкалоидов в БАД при концентрациях от 2,0 до 20 мг/таблетку составляет 87-95%, в пищевых продуктах при концентрациях от 5,0 до 25 мг/100 г - 82-90%.

6. Определение массовой концентрации хинина

Приготовление стандартных растворов

Приготовление градуировочного раствора хинина (800 мг/см3)

Навеску хинина массой 200,0 мг помещают в мерную колбу вместимостью 250 см3, до половины заполненную бидистиллированной водой. Перемешивают до полного растворения, затем доводят бидистиллятом до метки и перемешивают.

Приготовление градуировочного раствора хинина (0,008 мг/см3)

Отмеряют пипеткой 2,0 см3 градуировочного раствора хинина концентрации 800 мг/см3, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки бидистиллированной водой и перемешивают.

Приготовление подвижной фазы

2,72 г калия фосфорнокислого однозамещенного (КН2РО4) помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3, растворяют в бидистиллированной воде, перемешивают до полного растворения. Полученный раствор ортофосфорной кислотой (Н3РО4) доводят до pH 3,0 и фильтруют через фильтровальную бумагу с диаметром пор 0,5 мкм. 760 см3 полученного буферного раствора смешивают с 240 см3 ацетонитрила (C2H3N). Срок годности полученного раствора не более недели.

Подготовка образца

Образцы напитков подвергают дегазации по ГОСТ 6687.2 при температуре не более 25°C и отфильтровывают через бумажный фильтр.

Проведение анализа

Условия хроматографического анализа

Подвижная фаза 24% ацетонитрила, 76% 0,02М раствора КН2РО4, доведенного ортофосфорной кислотой до pH 3,0. Скорость потока 2,0 мл/мин. УФ-детектирование, длина волны 254 нм.

Массовую концентрацию хинина рассчитывают сравнением площадей пиков образца и стандарта хинина по аналогии с формулой в разделе 5.

7. Определение содержания коэнзима Q10

Метод основан на определении высокоэффективной жидкостной хроматографией

Оборудование и реактивы

Жидкостной хроматограф с УФ-детектором

Стандартный раствор Коэнзим Q10 концентрацией 100 мкг/мл готовят в смеси этанол-эфир (1:1).

Подготовка проб

Коэнзим Q10 - убихинон, не растворим в воде, но хорошо растворим в спирте и эфире.

Из образца (обычно это капсулы) его выделяют растворением в смеси 96%-ный этанол-эфир (1:1) Капсулы прокалывают в нескольких местах иглой, заливают смесью растворителей и оставляют при комнатной температуре в темном месте в плотно укупоренной склянке на сутки. Через сутки пробы хроматографируют.

Проведение испытания

Условия ВЭЖХ: Колонка из нержавеющей стали, длина 150 мм, диаметр 4-6 мм. Сорбент - Сепарон SGX С18, размер частиц 7 мкм Перед работой новую колонку промывают 40 мл изопропанола, затем 80 мл деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной фазой до стабильной нулевой линии.

Подвижная фаза: 96% этанол, очищенный перегонкой. Детектирование: спектрофотометр, длина волны УФ 290 нм, шкала чувствительности 0,05 AUFS. скорость потока 10 мл/мин, время удерживания коэнзима Q - 8,2 мин.

Обработка результатов: стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз. Расчет содержания Коэнзима Q производят методом абсолютной калибровки. Ошибка метода +-5%.

8. Определение L-карнитина (гамма-триметил-р-гидроксибутиробетаин)

L-карнитин - гигроскопические кристаллы, хорошо растворимые в воде, в этаноле. Мало растворим в ацетоне, изопропаноле, не растворим в эфире.

Метод определения массовой концентрации L-карнитина в БАД и пищевых продуктах основан на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Метод анализа включает следующие этапы:

- экстракцию L-карнитина из БАД и пищевых продуктов подщелоченной дистиллированной водой при нагревании;

- осаждение высокомолекулярных составляющих экстракта ацетатом цинка;

- фильтрование полученного раствора;

- обнаружение и количественное определение с помощью ион-парной ВЭЖХ с УФ детектором и использованием метода внешнего стандарта.

Средства измерений, материалы и реактивы

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью +-0,0001 г.

Дистиллятор

рН-метр, модель "рН 150 М".

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Термометр жидкостный стеклянный с пределами измерения 0-100°C и ценой деления 1°C по ГОСТ 28498.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Бумага фильтровальная "красная лента" и "синяя лента" по ТУ 6-09-1678-95.

Баллон с сжатым азотом марки ПНГ;

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

Кислота о-фосфорная, ч, ГОСТ 6552.

Додецилсульфат, натриевая соль, SERVA, раствор 0,005М в дистиллированной воде.

L-карнитин по действующей нормативно-технической документации.

Натрий гидроокись, х.ч., ГОСТ 4228, раствор массовой концентрации 0,4 г/дм3.

Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233.

Цинк уксуснокислый 2-водный, ч.д.а., ГОСТ 5823-78, раствор 30%-ный в дистиллированной воде.

Подготовка к проведению измерений

Приготовление рабочего раствора L-карнитина (400 мг/см3)

Навеску L-карнитина массой 100,0 +-0,1 мг помещают в мерную колбу вместимостью 250 см3, до половины заполненную дистиллированной водой. Перемешивают до полного растворения, затем доводят дистиллятом до метки и перемешивают.

Приготовление стандартного раствора L-карнитина (0,004 мг/см3)

Отмеряют пипеткой 2,0 см3 рабочего раствора L-карнитина концентрацией 400 мг/см3, переносят в мерную колбу вместимостью 200 см3, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Приготовление подвижной фазы

1,44 г додецилсульфата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3, растворяют в дистиллированной воде, перемешивают до полного растворения, доводят дистиллированной водой до метки. Полученный раствор ортофосфорной кислотой доводят до pH 2.5 (2,5-3,06 см3). 850 см3 полученного буферного раствора смешивают с 350 см3 ацетонитрила и полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу "красная лента".

Подготовка проб

Выделение L-карнитина осуществляли следующим образом: навеску (2 г) измельченного БАД или продукта помещали в мерную колбу вместимостью 250 см3, добавляли 125 см3 горячей (60-65°C) дистиллированной воды, подщелоченной раствором NaOH массовой концентрации 0,4 г/дм3 (рН 8,0-8,5), встряхивали на аппарате для встряхивания 30 минут, охлаждали до комнатной температуры, добавляли 30 см3 30%-ного раствора ацетата цинка доводили дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивали и фильтровали через бумажный фильтр "красная лента" или через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC.

Проведение испытания

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза раствор 0,005М додецилсульфоната натрия-ацетонитрил (65:35). Скорость потока 1,0 см3/мин. Обнаружение по поглощению в УФ-области спектра при длине волны 210 нм, шкала чувствительности 0,01 Е.О.П. Вводимый объем образца 10,0 мм3. Время удерживания карнитина - 7,5 +-1,0 мин.

Расчет концентраций L-карнитина

Массовую концентрацию L-карнитина рассчитывают по формуле:

                      S    x m   x V

                       oбp.   ст.   1

              Х = ------------------------, мг/100 г, где

                   l0000 х S   х V  x M

                            ст.   2    обр.

     S     - площадь пика исследуемого компонента;

      oбp.

     S     - площадь пика стандарта;

      ст.

     V     - объем анализируемого раствора пробы, мм3;

     V     - объем экстракта, введенного в хроматограф, мм3;

     m     - масса стандарта, введенная в хроматограф, нг;

      ст.

     М     - навеска образца, взятая для анализа.

      обр.

Обработка результатов

Характеристика погрешности измерений

За результат принимают среднее арифметическое результатов трех параллельных измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком. Относительное допустимое расхождение между результатами параллельных определений при доверительной вероятности Р = 0,95 не должно превышать 13%. Ошибка метода +-5%.

Среднее значение открываемости L-карнитина в БАД при концентрациях 10-20 мг/таблетку или в пищевых продуктах при концентрациях от 100 мг% составляет - 85-93%.

9. Определение полифенольных соединений

Принцип метода

Суммарное содержание фенольных соединений определяют модифицированным методом Фолина-Чокальтеу. Полифенольные соединения окисляются реактивом Фолина-Чокальтеу, состоящим из смеси фосфорно-вольфрамовой H2PW12O40 и фосфорно-молибденовой H3Pmo12O40 кислот, который, в свою очередь, восстанавливается в смесь окислов вольрама# (W8O23) голубого цвета и молибдена (Mo8O23). Абсорбция раствора при 750 нм пропорциональна содержанию фенольных соединений. В качестве полифенольного стандарта используют галловую кислоту.

Приборы и реактивы

Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный, позволяющий проводить измерения при длинах волн 200-350 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%.

Колориметр фотоэлектрический лабораторный КФК-2 (или аналогичный) ГОСТ 12083.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с пределом взвешивания 200 г и погрешностью +-0,0001 г.

рН-метр лабораторный ЭВ-74 (или аналогичный) по ТУ 25-05-27-57.

Дистиллятор.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Стакан мерный В-1-500ТС вместимостью 500 см3 по ГОСТ 25336.

Цилиндры 2-1000 и 2-100 по ГОСТ 1770.

Натрия вольфрамат по ГОСТ 18289.

Натрия молибдат по ГОСТ 10931.

Кислота ортофосфорная 85%-ная по ГОСТ 6552.

Кислота соляная конц. по ГОСТ 3118.

Литий сернокислый (сульфат лития).

Натрий углекислый (карбонат натрия) по ГОСТ 83.

Водорода перекись по ГОСТ 177.

Бром по ГОСТ 4109.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Галловая кислота по действующей нормативно-технической документации.

Подготовка к выполнению измерений

Приготовление реактива Фолина

100 г вольфрамовокислого натрия и 25 г молибденовокислого натрия растворяют в 700 см3 дистиллированной воды. Добавляют 50 см3 85%-ной фосфорной кислоты (d = 1,71 г/см3), 100 см3 концентрированной соляной кислоты (d = 1,19 г/см3) и кипятят на водяной бане в колбе с обратным холодильником под тягой в течение 10 ч. Добавляют 150 г сернокислого лития, несколько капель брома и снова кипятят в течение 15 мин. Смесь охлаждают до комнатной температуры, переносят в мерную колбу вместимостью 1 дм3 и доводят объем до метки дистиллированной водой. Хранят реактив в темной бутылке со шлифом в холодильнике.

Приготовление раствора карбоната натрия

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 наливают около 500 см3 дистиллированной воды и растворяют 200 г карбоната натрия при встряхивании. Доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Получают раствор карбоната натрия с концентрацией 20%.

Раствор галловой кислоты

В мерный стакан вместимостью 500 см3 помещают 50 см3 этилового спирта, доводят до метки 400 см3 дистиллированной водой. Погружают в стакан электроды pH-метра и добавляют соляную кислоту до значения pH 3,2-3,25. Переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью 500 см3, при встряхивании растворяют 15 мг галловой кислоты и доводят дистиллированной водой до метки. Концентрация галловой кислоты 0,03 мг/см3.

Построение градуировочной кривой

1, 2, 5, 10, 20 см3 расвора галловой кислоты помещают в 5 мерных колб вместимостью 100 см3. В шестую колбу вносят 1 см3 дистиллированной воды - контрольный раствор.

В каждую мерную колбу добавляют по 1 см3 реактива Фолина-Чокальтеу, по 10 см3 раствора карбоната натрия, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Через 20-30 мин измеряют оптическую плотность растворов в кювете 10 мм при длине волны 750 нм против контрольного раствора.

По полученным данным строят градуировочную кривую, откладывая по оси абсцисс массовую концентрацию галловой кислоты, а по оси ординат - оптическую плотность.

Выполнение измерений

БАД на растительной и фруктовой основе (таблетки, капсулы) растирают в ступке, навеску 1-2 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, заполненную до половины дистиллированной водой, нагретой до 40°C, и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 45-60 мин, периодически подогревая колбу.

Сокосодержащие БАД (растворы, сиропы) разбавляют в 5-10 раз дистиллированной водой.

1 см3 полученных растворов помещают в мерные колбы вместимостью 100 см3 и далее выполняют действия как в разделе "Построение градуировочной кривой".

Вычисление результатов определения

Значение массовой концентрации фенольных веществ (С) в мг/дм3 по галловой кислоте определяют по градуировочной кривой. Полученную величину умножают на коэффициент разведения - 100, если экстракт разбавляли в 5 раз или вычисляют по формуле:

                            С = А х ОП, где

     А  - коэффициент разбавления,

     ОП - оптическая плотность.

Вычисления проводят до первого десятичного знака и округляют до целого числа. За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.

Характеристика погрешности измерений

Допустимое значение погрешности измерений массовой концентрации фенольных соединений в БАД на растительной основе или сокосодержащих БАД не должно превышать:

для диапазона концентраций в экстракте или растворе 100-600 мг/дм3 - + 8 мг/дм3,

для диапазона концентраций в экстракте или растворе 600-3000 мг/дм3- +-33 мг/дм3.

10. Определение флавоноидов

10.1. Введение

Флавоноиды представляют собой большую группу природных полифенольных соединений с двумя ароматическими кольцами, имеющими основную структуру С6-С3-С6. Флавоноиды являются мощными природными антиоксидантами, обладающими широким спектром биологической активности. Особенно богаты флавоноидами высшие растения, относящиеся к семействам розоцветных (различные виды боярышников, черноплодная рябина), бобовых (софора японская, стальник полевой, солодка), гречишных (различные виды горцев - перечный, почечуйный, птичий: гречиха), астровых (бессмертник песчаный, сушеница томная, пижма), яснотковых (пустырник сердечный) и др.

В основе сруктуры# большинства флавоноидов лежат производные флавана (2-фенил-хроман или 2-фенил-бенз-гамма-пиран), приведенного на рис. 7, которые, в свою очередь, разделяются на производные хромана и хромона.

К производным хромана относятся катехины, лейкоантоцианидины и антоцианидины.

Катехины. Основные структуры катехинов (флаван-3-олов) приведены на рис. 8.

Лейкоантоцианидины. Как видно из приведенной структуры на рис. 9 лейкоантоцианидины или проантоцианидины (флаван-3,4-диолы) представляют собой 4-гидроксипроизводное катехина.

Антоцианидины. Особенность строения антоцианидинов (рис. 10) в том, что кислород в пирановом кольце в кислой среде образует оксониевый катион. Поэтому антоцианидины в кислом растворе ведут себя как катионы и образуют соли с кислотами, а в щелочном растворе - как анионы и образуют соли с основаниями. Антоцианидины являются интенсивно окрашенными природными пигментами, их окраска изменяется в зависимости от pH среды. Оксониевые формы (соли катионов) антоцианидинов окрашены в красный цвет с оттенками: желтоватыми (пеларгонидин), фиолетовым (цианидин), синеватым (дельфинидин). Щелочные соли окрашены в синий цвет.

Антоцианидины являются агликонами большого класса природных красителей - антоцианинов (см. раздел 1).

Среди других представителей этой группы следует отметить 2-фенилпроизводные хромана: флаваноны и флаванонолы, структуры которых представлены на рис. 11.

К флаванонам относятся нарингенин - 5,7,4'-тригидроксифлаванон, гесперетин- 5,7,3'-тригидрокси-4'-метоксифлаванон и эриодиктиол - 5,7,3',4'-тетрагидроксифлаванон. Наиболее распространенными в экстрактах цитрусовых являются 7-О-гликозил-нарингенин - нарингин и 7-О-гликозилгесперетин - геспередин (см. раздел 11.2).

В БАД на основе экстрактов лиственницы и ряда других растений содержатся производные флаванон-3-олов: дигидрокверцетин - 5,7,3',4'-тетрагидроксифлаванон-3-ол и дигидрокемпферол - 5,7,4'-тригидроксифлаванон-3-ол (см. раздел 11.3).

Из производных хромона, представленных на рис. 12, наиболее распространены в растениях соединения типа флавона и флавонола, имеющих непредельную связь в положении 2, 3. В отличии от их гидрированных аналогов - флаванонов и флаванонолов - это наиболее устойчивые флавоноиды.

Флавоноиды, у которых фенильная группа с С2 смещена к С3, называются изофлавоноидами (рис. 13).

Структуры и наименования основных флавонолов представлены на рис. 14, структуры флавонов - на рис. 15.

10.2. Методы определения флавоноидов

В основе количественного определения флавоноидов лежит спектрофотометрия при длине волны 415 нм продуктов взаимодействия с раствором хлорида алюминия. К флавоноидам относятся производные флавона: флавонолы (рутин - рутинозид кверцетина, гиперозид - галактозид кверцетина, морин, кверцетин, мирицетин, кемпферол, кверцитрин, галангин) и флавоны (хризин, апигенин, лютеолин, изовитексин, изоориентин). Для определения производных флавана: флаванон-3-олов (дигидрокверцетин или таксифолин, дигидрокемферол, силибин), флаванонов (нарингин, нарингенин, гесперетин) используется спектрофотометрия при длине волны 495 нм продуктов их реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.

РИС. 14 И 15 К РУКОВОДСТВУ Р 4.1.1672-03

Принцип колориметрического метода, основанного на взаимодействии с алюминий хлоридом, заключается в том, что реагент образует кислотоустойчивые комплексы с С-4 кето группой и или с С-3 или С-5 гидроксильной группой флавонов и флавонолов, имеющие максимумы поглощения в диапазоне длин волн 415-440 нм.

Принцип взаимодействия с 2,4-динитрофенилгидразином основан на его реакции с кетонами и альдегидами с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов. Следовательно, флавоны, флавонолы и изофлавоны с С2-С3 двойной связью не способны реагировать с 2,4-динитрофенилгидразином, в то время, как гидразоны и флавононы образуют соединения, имеющие максимум поглощения при 495 нм.

Приборы и реактивы

Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный (Shimadzu UV-160A, Япония), позволяющий проводить измерения при длинах волн 190-900 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%;

Метанол - яд для жидкостной хроматографии, ос. ч. по ТУ 6-09-14-2192-85;

Спирт этиловый ректификованный очищенный дистилляцией.

Алюминия хлористый, 6-водный, х. ч., ГОСТ 3759-75, раствор 10%-ный в 95%-ном этаноле;

2,4-динитрофенилгидразин (2,4-Д), раствор: 1 г 2,4-Д растворяют в 2 см3 96%-ной серной кислоты и доводят метанолом до объема 100 см3, концентрация полученного раствора 10 мг/см3;

Натрия гидроокись, х. ч.: 1%-ный раствор в 70%-ном метаноле;

Натрия ацетат, 1М раствор.

Приготовление стандартных растворов для калибровки спектрофотометра

10 +-0,1 мг кверцетина растворяют в 80%-ном этаноле и затем разбавляют в мерных колбах до концентраций 25, 50 и 100 мкг/см3.

20 +-0,1 мг+- - нарингенина растворяют в метаноле и затем разбавляют до концентрации 500, 1000 и 2000 мкг/см3.

Подготовка образца

1,0 г измельченного образца кипятят в 30 см3 90%-ного этилового спирта, содержащего 0,5% концентрированной серной кислоты, на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и экстракцию повторяют еще раз. Объединенную смесь охлаждают, фильтруют и доводят объем до 100 см3 90%-ным этанолом (раствор А).

Колориметрический метод с алюминий хлоридом (суммарное определение флавонолов)

По 0,5 см3 каждого разбавленного стандарта кверцетина смешивают с 1,5 см3 95%-ного этанола, 0,1 см3 10%-ного хлорида алюминия, 0,1 см3 1М ацетата натрия и 2,8 см3 дистиллированной воды. Смесь инкубируют при комнатной температуре 30 мин и измеряют оптическую плотность полученного раствора при 415 нм. Для приготовления раствора сравнения используют разбавленный в дистиллированной воде 10%-ный хлорид алюминия.

Колориметрический метод с 2,4-динитрофенилгидразином (суммарное определение флаванонов)

По 1,0 см3 каждого разбавленного стандартного раствора +- -нарингенина смешивают с 2,0 см3 1%-ого раствора 2,4-Д и 2,0 см3 метанола. Смесь выдерживают при 50°C в течение 50 мин. После охлаждения до комнатной температуры к смеси добавляют 5 см3 1%-ного раствора едкого натра в 70%-ном метаноле и инкубируют при комнатной температуре в течение 2-х минут. Затем к 1 см3 смеси добавляют 5 см3 метанола и центрифугируют при 1000 об/мин, в течение 10 мин. Отделяют супернатант и в мерной колбе доводят до объема 25 см3. Измеряют оптическую плотность раствора при 495 нм против раствора сравнения - метанола.

Проведение испытаний

Отбирают по 0,5 см3 гидролизата (раствор А) и проводят колориметрические реакции с хлоридом алюминия и 2,4-Д как описано выше. Определяют содержание флавоноидов согласно калибровочным графикам.

11. Анализ индикаторных показателей некоторых БАД на растительной основе

11.1. Определение катехинов и галловой кислоты в БАД на основе зеленого чая и в травяных чаях

Катехины - это флаван-3-олы, структура которых представлены на рис. 8.

Приборы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 см3/мин., обеспечивающий работу в режиме градиентного элюирования, оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных Мультихром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18) с размером частиц 5 мкм; длина колонки - 15 см, предколонки - 4,5 см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см;

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10,4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Спирт этиловый ректификованный.

Кислота о-фосфорная, ч, ГОСТ 6552, раствор 0,1%: 1,2 см3 фосфорной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 1 дм3, добавляют около 950 см3 дистиллированной воды, перемешивают, охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки и перемешивают.

Метанол - яд для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-2192-85;

Спирт этиловый ректификованный очищенный дистилляцией.

Капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC;

Фумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.

(+)-Катехин, (+)-эпикатехин, (-)-эпигаллокатехин, (-)-эпигаллокатехин галлат, галловая кислота - SIGMA Chemical Co.

Приготовление стандартного раствора

5 +-0,1 мг (+)-катехина предварительно высушенного при 105°C в течение 1 ч, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют около 70 см3 0,1%-ного раствора фосфорной кислоты, перемешивают до полного растворения вещества, охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки 0,1%-ным раствором фосфорной кислоты и перемешивают. Концентрация полученного стандартного раствора катехина 0,05 мг/см3. 5 см3 полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят до метки 0,1%-ным раствором фосфорной кислоты и перемешивают. Концентрация полученного рабочего стандартного раствора катехина 0,005 мг/см3. В хроматограф вводят 10 мкл.

Подготовка образца

1 г порошка экстракта листьев, 2 г измельченных листьев, таблеток или содержимого капсул помещают в химический стакан вместимостью 250 см3, добавляют 50 см3 0,1%-ного раствора фосфорной кислоты и проводят экстракцию в ультразвуковой бане в течение 5 мин. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента" в мерную колбу вместимостью 250 см3 или при необхоимости центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, а затем супернатант помещают в мерную колбу на 250 см3, доводят до метки 0,1%-ным раствором фосфорной кислоты и перемешивают (раствор А). Раствор анализируют с помощью ВЭЖХ.

Проведение анализа ВЭЖХ

Условия хроматографического анализа: колонка Hypersil ODS, размер колонки 250 х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм, подвижная фаза ацетонитрил - 85%-ная фосфорная кислота (15:85), скорость подвижной фазы 1,0 см3/мин., объем петли инжектора 20 мм3. УФ детектор, длина волны 280 нм. Времена удерживания: галловая кислота 2,9 +-0,1 мин, эпигаллокатехин 4,5 +-0,1 мин, катехин 5,8 +-0,2 мин, эпикатехин 6,8 +-0,2 мин., эпигаллокатехин галлат 9,8 +-0,2 мин., галлокатехин галлат 12,0 +-0,1 мин, эпикатехин галлат 13,5 +-0,1 мин, катехин галлат 15,5 +-0,1 мин.

Количественный расчет

При количественном анализе используют метод абсолютной калибровки. Количественный расчет каждого катехина в пересчете на катехин проводят по формуле:

                      S    x m x V  x K x 100

                       обр.       1

                 X = ------------------------- %, где

                            V  x S   х М

                             1    ст.

     S     - площадь пика исследуемого компонента;

      обр.

     S     - площадь пика стандарта катехина;

      ст.

     V     - объем анализируемого раствора пробы, мм3;

     V     - объем экстракта, введенного в хроматограф, мм3;

     m     - масса стандарта катехина, введенная в хроматограф, мг;

      ст.

     М     - навеска образца, взятая для анализа, мг,

      обр.

     К     - коэффициент  пересчета содержания  индивидуального  катехина

             относительно катехина - согласно нижеприведенной таблице:

Катехин	К, по катехину
(+)-катехин	1,000
(-)-эпикатехин	1,020
(-)-катехин галлат	0,327
(-)-эпикатехин галлат	0,382
(-)-галлокатехин галлат	0,482
(-)-эпигаллокатехин галлат	0,543
(-)-эпигаллокатехин	3,450

Относительное стандартное отклонение, вычисленное по площадям пиков не менее двух параллельных измерений катехина не должно превышать 0,4%.

11.2. Определение флаванонов в БАД на фруктовой основе

Гесперидин, нарингенин относятся к разряду флаванглюкозидов, широко представленных во фруктах, особенно в кожуре зеленых апельсинов. При отжатии сока под высоким давлением флаваноны переходят в сок.

Приборы и реактивы

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Кислота серная, х. ч.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Спирт этиловый ректификованный.

Фумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.

Гесперидин, раствор в 50%-ном этиловом спирте концентрацией 0,02 мг/см3.

Нарингенин, раствор в 50%-ном этиловом спирте концентрацией 0,02 мг/см3.

Подготовка образца

1 г измельченных таблеток или содержимого капсул помещают в плоскодонную колбу, добавляют 40 см3 50% этилового спирта, смесь нагревают на водяной бане при 55-60°C в течение 30 мин. Экстракцию повторяют пятикратно. Спиртовые экстракты, охлаждают, фильтруют, доводят объем до 250 см3 50%-ным этиловым спиртом.

Проведение анализа

Условия хроматографического разделения: колонка ODS -Hypersil (HP 799160D-552), размеры колонки 100 х 2,1 мм, размер частиц 5 мкм, объем петли инжектора 20 мм. Подвижная фаза: раствор серной кислоты, pH 2,5 - ацетонитрил (85:15), скорость потока 0,5 см3/мин., УФ детектор, длина волны 280 нм. Ориентировочные времена удерживания нагингенина 4.8 +-0,1 мин., гисперидина 6,0 +-0,1 мин.

При количественном анализе используют метод абсолютной калибровки. Относительное стандартное отклонение, вычисленное по площадям пиков не менее двух параллельных измерений стандартов гесперидина и нарингенина, не должно превышать 0,4%.

11.3. Определение флаванонолов в БАД из экстрактов лиственницы

К флаванонолам относятся дигидрокверцетин, дигидрокемпферол, эриодиктиол.

Приборы и реактивы

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

ГСО дигидрокверцетина ВФС 42-2399-94.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Спирт этиловый ректификованный.

Кислота уксусная ледяная, х. ч., ГОСТ 6709-72, раствор 2%.

Кислота соляная, х. ч., ГОСТ 3118.

Капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC.

Фумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.

Цинк гранулированный, ч.

Приготовление стандартного раствора

0,05 +-0,0001 г дигидрокверцетина, предварительно высушенного при 105°C в течение 1 ч, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, заполненную до половины ацетонитрилом, перемешивают до полного растворения образца, доводят до метки ацетонитрилом и тщательно перемешивают. 1 см3 полученного раствора концентрацией 0,5 мг/см3 переносят в мерную колбу вместимостью 25 см3, доводят ацетонитрилом до метки и тщательно перемешивают. Концентрация рабочего стандартного раствора дигидрокверцетина 0,02 мг/см3. В хроматограф вводят 10 мкл.

Подготовка образца

1 г измельченных таблеток или содержимого капсул помещают в мерную колбу вместимостью 250 см3, добавляют 50 см3 подвижной фазы ацетонитрил-2%-ная уксусная кислота (30:70), встряхивают 30 мин, доводят подвижной фазой до метки и тщательно перемешивают. Полученный раствор фильтруют через капроновый фильтр или центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин. Раствор используют для проведения качественной реакции на флаванонолы (дигидрокверцетин) или анализируют с помощью ВЭЖХ.

Проведение качественной реакции

1 г измельченного образца встряхивают с 50 см3 спирта 96%-ного, раствор фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента", к 1 см3 фильтрата добавляют 0,5 см3 концентрированной соляной кислоты и 0,05 г цинка гранулированного. О наличии в растворе флаванонолов свидетельствует малиновое окрашивание.

Проведение анализа ВЭЖХ

Условия хроматографического анализа: колонка Hypersil ODS, размер колонки 250 х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм, подвижная фаза ацетонитрил-2%-ная уксусная кислота (30:70), скорость подвижной фазы 1,0 см3/мин., объем петли инжектора 20 мм3. УФ детектор, длина волны 287 нм. Времена удерживания флаванонолов: дигидрокверцетин - 5,0 +-0,1 мин, дигидрокемпферол - 6,5 +-0,1 мин, эриодиктиол - 7,5+-0,1 мин.

При количественном анализе используют метод абсолютной калибровки. Относительное стандартное отклонение, вычисленное по площадям пиков не менее двух параллельных измерений дигидрокверцетина не должно превышать 0,4%.

11.4. Определение изофлавонов в БАД

Принцип метода

Метод определения массовой концентрации изофлавонов в соясодержащих продуктах и БАД основан на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). К изофлавонам относятся даидзеин, генистеин и глицитеин и их гликозиды даидзин, генистин, глицитин, структура которых указана на рис. 13.

Средства измерений, материалы и реактивы

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Ультразвуковая баня.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Метанол - яд для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-2192-85.

Бумага фильтровальная "красная лента" и "синяя лента" по ТУ 6-09-1678-95.

Фильтры капроновые марки 0,45 мкм RC или целлюлозные.

Баллон с сжатым азотом марки ПНГ.

Вода деионизированная.

Кислота о-фосфорная, ч., ГОСТ 6552.

Подготовка к проведению измерений

Приготовление рабочих растворов изофлавонов

Навеску изофлавона (генистеин) массой 10,0 +-0,1 мг помещают в мерную колбу вместимостью 25 см3, до половины заполненную 70%-ным метанолом, перемешивают до полного растворения вещества, доводят 70%-ным метанолом до метки и тщательно перемешивают. Получают раствор с массовой концентрацией генистеина 0,4 мг/см3.

Подготовка образца

Содержимое капсул или растертых таблеток БАД или 1,0 г измельченного образца помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 см3, прибавляют около 50 см3 70%-ного метанола, экстрагируют с помощью ультразвука в течение 10 минут и встряхивают 20 минут на аппарате для встряхивания. Экстракт охлаждают до комнатной температуры, надосадочную жидкость фильтруют через целлюлозный или капроновый фильтр с размером пор до 0,45 мкм в мерную колбу вместимостью 100 см3. Объем экстракта доводят 70%-ным метанолом до метки и тщательно перемешивают.

Проведение анализа

Условия ВЭЖХ. Колонка с сорбентом Kromasil 100 С18 или аналогичная, размер частиц 5 мкм. Подвижная фаза: градиент 0,1% фосфорной кислоты - ацетонитрил от (90:10) до (65:35) за 40 мин., скорость потока 0,8 см3/мин, температура колонки 25°C. Детектор спектрофотометрический, длина волны УФ 255 нм, шкала 0.01 AUFS. Параметры разделения изофлавонов: даидзин 9,5 +-0,5, глицитин 10,5 +-0,5, генистин 14,5 +-0,5, даидзеин 23,5 +-0,5.мин., глицитеин 24,5 +-0,5 и генистеин 31,5 +-0,5мин.

Расчет концентраций изофлавонов

Массовую концентрацию каждого изофлавона относительно стандарта генистеина рассчитывают по формуле:

                          S    x m x V  x K x 100

                           обр.       1

                     X = -------------------------%, где

                                V  x S   x M

                                 1    ст.

     S    - площадь пика исследуемого компонента;

      обр.

     S    - площадь пика стандарта генистеина;

      ст.

     V    - объем анализируемого раствора пробы, мм3;

     V    - объем экстракта, введенного в хроматограф, мм3;

     m    - масса стандарта генистеина, введенная в хроматограф, мг;

      ст.

     М    - навеска образца, взятая для анализа, мг,

      обр.

     К    - коэффициент  пересчета  содержания индивидуального изофлавона

            относительно генистеина - согласно нижеприведенной таблице:

Изофлавон	К
Генистеин	1,000
Генистин	1,458
Даидзеин	1,203
Даидзин	1,931
Глицитеин	1,630
Глицитин	2,118

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений при доверительной вероятности Р = 0,95 не должно превышать 10%.

11.5. Определение гиперозида и рутина в БАД, содержащих боярышник (Crataegus Monoguna)

Приборы и реактивы

Высокоэффективный жидкостной хроматограф с колонкой ODS (Nucleosil) 250 х 4,6 мм, предколонкой ODS 20 х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм, объем петли инжектора 20 мкл, фотометрический детектор, длина волны 590 нм.

Пластины для ТСХ "Silufol".

Облучатель ультрафиолетовый.

Спектрофотометр.

Реактив Neu: а) смесь аминоэтанол дифенилбората, 1%-ный раствор в метаноле и полиэтиленгликоль 400R, 5%-ный раствор в метаноле; б) алюминий хлористый 5%-ный раствор в спирте.

Кислота уксусная ледяная.

Кислота муравьиная безводная.

Этилацетат.

Стандартные растворы

Гиперозид, раствор в метаноле концентрацией 0,5 мг/см3. Гиперозид, раствор в 96%-ном этиловом спирте концентрацией 1 мг/см3. Витексин-2-рамнозид, раствор в метаноле концентрацией 0,02 мг/см3. Рутин, раствор 0,05%-ный в метаноле.

Подготовка образца

1) 1,0 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу, добавляют 10 см3 метанола, смесь перемешивают в течение 15 мин. Раствор фильтруют.

2) 0,5 г измельченного продукта кипятят в течение 15 мин в 5 см3 95%-ного этилового спирта, экстракт фильтруют (для качественного анализа).

3) 2 г измельченного продукта нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 ч в 100 см3 95%-ного этилового спирта, после охлаждения доводят объем до первоначального, экстракт фильтруют, 50 см3 фильтрата упаривают до 2-3 см3, переносят в мерную колбу на 10 см3 доводят объем до 10 см3 96%-ным этиловым спиртом, перемешивают и дают осесть образовавшемуся аморфному осадку.

4) На стартовую линию пластины Silufol (20 х 20 см), отстоящую от края пластины на 20-25 мм микрошприцем или стеклянным капилляром наносят в виде полосы 80 мкл экстракта и 80 мкл контрольного раствора ГСО гиперозида. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и проводят разделение в системе хлороформ-метиловый спирт (8:2). Когда фронт растворителя дойдет до края пластинки, ее высушивают в течение 2 мин и вторично хроматографируют в той же системе. Высушивают и просматривают в УФ-свете при 360 нм. Отмечают пятна гиперозида в образце и стандарте. Элюируют вещество со слоя сорбента 10 см3 смеси диоксан-вода (1:1) (раствор А).

Идентификация тестового соединения

На стартовую линию пластины Silufol (20 х 20 см), отстоящую от края пластины на 20-25 мм с помощью микрошприца или стеклянного капилляра наносят в виде полосы 20 х 3 мм 20 мкл анализируемого экстракта и 5 мкл контрольного раствора. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и элюируют в системе ледяная уксусная кислота-муравьиная кислота безводная-метилэтилкетон-этилацетат (10:10:30:50). Дают фронту растворителя подняться на 10-15 см, затем пластину высушивают, после испарения растворителя помещают на 2 мин. под струю горячего воздуха и опрыскивают реактивом Neu. В длинноволновом УФ-свете (длина волны 365 нм) гиперозид обнаруживают по полосе с желтой флуоресценцией и R_f 0,5, 2,2-рамнозил витексина - по зеленоватой и R_f 0,25, хлорогеновую кислоту - по белой и R_f 0,4 и изохлорогеновую кислоту - по голубой флуоресценции и R_f 0,7.

В системе хлороформ:метанол (8:2) на уровне гиперозида в УФ-свете 360 нм наблюдают пятно темно-коричневого цвета. При обработке пластинки 5% спиртовым раствором АlСl3 и последующим нагреванием при 100-105°C - 2-3 мин, пятно приобретает ярко-желтую окраску при дневном свете и желто-зеленую флуоресценцию в УФ-свете 360 нм.

Количественное определение тестовых соединений

Содержание гиперозида

Измеряют оптическую плотность исследуемого раствора А при 365 нм, против раствора сравнения - контрольный опыт (экстракт полосы сорбента). Калибровку проводят по раствору стандарта ГСО гиперозида.

Содержание витексин-2-рамнозида и гиперозида

0,5 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу, соединенную с обратным холодильником, добавляют 50 см3 метанола, смесь нагревают на водяной бане при перемешивании в течение 30 мин. Раствор охлаждают, фильтруют, растворитель упаривают на ротационном испарителе до небольшого объема. Остаток растворяют в 25 см3 метанола, а затем разбавляют подвижной фазой в соотношении 1:5 и анализируют с помощью ВЭЖХ.

Условия хроматографического разделения: колонка ODS (Nucleosil) 250 х 4,6 мм, предколонка ODS 20 х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм, объем петли инжектора 20 мкл УФ-детектор, длина волны 590 нм, подвижная фаза:

А: вода-тетрагидрофуран-этанол-фосфорная кислота (90:10:5:1);

В: вода-тетрагидрофуран-пропанол-2-фосфорная кислота (20:80:5:1).

     Градиент  элюирования:   А -> В 0:100 за  45  мин, скорость потока 1

см3/мин.

Ориентировочные времена удерживания:

витексин-2-рамнозида - 22,59 мин, гиперозида - 31,90 мин.

Записывают хроматограммы стандартного образца и экстракта. Отмечают пик, совпадающий по времени удерживания с соответствующим стандартом и по площадям пиков расчитывают содержание в продукте.

11.6. Определение флавонолгликозидов в БАД на основе экстракта Ginkgo biloba

Согласно фармакопее США экстракт листьев Ginkgo biloba должен содержать не менее, чем 22,0% и не более, чем 27,0% флавоноловых гликозидов (рис. 14). В стандартизованных экстрактах Ginkgo biloba, содержание кверцетина, кемпферола и изорамнетина колеблется около 9,5%, 10,5% и 2,0%, соответственно. Такое качественное и количественное соотношение флавонолгликозидов уникально для высших растений и может служить специфическим индикаторным показателем качества препаратов гинкго.

В качестве метода анализа используется высокоэффективная обращенно-фазная жидкостная хроматография.

Подготовка проб для анализа

Содержимое капсул или растертые таблетки, содержащие около 0,3 г сухого экстракта или 1,0 г порошка листьев гинкго помещают в круглодонную колбу объемом 250 см3, прибавляют 80 см3 смеси метанол-вода-соляная кислота (60:20:8). Экстракцию проводят на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1-1,5 ч. Экстракт охлаждают до комнатной температуры, надосадочную жидкость фильтруют через целлюлозный или тефлоновый фильтр с размером пор до 0,45 мкм в мерную колбу объемом 100 см3. Объем экстракта доводят дистиллированной водой до 100 см3.

Приготовление рабочих стандартных растворов

Точные навески 1 мг стандартных образцов кверцетина, кемпферола и изорамнетина переносят в мерные колбы, встряхивают с метанолом до полного растворения, доводят объем растворителя до метки и тщательно перемешивают.

Проведение анализа

Колонка: Kromosil С18, 5 мкм, 250 мм х 4,6 мм ID;

Подвижная фаза: метанол - ортофосфорная кислота, pH 2,6 (53:47), скорость потока 1,2 см3/мин.

Детектирование: UV, 370 нм.

Объем вводимой пробы 5-20 мкл.

Параметры разделения кверцетина, кемпферола и изорамнетина в табл. 37.

Таблица 37

Флавоноид	tR, мин	К - коэффициент емкости колонки
Кверцетин	13,3	5,4
Кемпферол	24,0	10,6
Изорамнетин	27,9	12,5

Таблица 38

Метрологические характеристики метода определения флавонолгликозидов

Статистический параметр	Кверцетин
Предел обнаружения, %	0,01
Интервал определяемых концентраций, мг/кг	0,01-15
Среднее значение открываемости (показатель правильности), %	90-95
Максимально допустимое расхождение между результатами двух параллельных внутрилабораторных определений (сходимость), при р=0,95, %	7,0
Максимально допустимое расхождение между результатами двух параллельных межлабораторных определений, (воспроизводимость) при р=0,95, %	10,0

Для определения содержания флавонолгликозидов найденные концентрации кверцетина умножают на коэффициент 2,5, кемпферола - на 2,05, изорамнетина - на 2,4.

11.7. Определение флавоноидов в БАД, содержащих солодку (Radix Glicyrrisae)

Солодка содержит тритерпеноидные сапонины (4-24%), главным образом, глицирризин, смесь натриевой и кальциевой солей глицирризиновой кислоты; флавоноиды (1%), в основном флаваноны, ликвиритин и ликвиритигенин, халконы изоликвиритин, изоликвиритигенин и изофлавоноиды (формононетин).

Анализ основан на определении глицерризиновой кислоты и тестовых соединений с помощью ТСХ и ВЭЖХ.

Приборы и реактивы

Пластины "Silufol"

Колонка и пред колонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18) с размером частиц 5 мкм; длина колонки - 15 см, предколонки - 4,5 см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см.

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Спирт этиловый ректификованный.

Метанол - яд для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-2192-85.

Бумага фильтровальная "красная лента" и "синяя лента" по ТУ 6-09-1678-95.

Ликуразид, раствор в 50%-ном этиловом спирте концентрацией 1 мг/см3.

Глицирризиновая кислота, аммониевая или натриевая соль: раствор в 50%-ном этиловом спирте концентрацией 1 мг/см3.

Подготовка образца

1 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу, добавляют 50 см3 50%-ного этилового спирта, смесь нагревают на водяной бане при 55-60°C в течение 30 мин. Экстракцию повторяют пятикратно. Спиртовые экстракты, охлаждают, фильтруют, доводят объем до 250 см3 50%-ным этиловым спиртом.

Идентификация тестовых соединений ТСХ

На стартовую линию пластины Silufol-УФ 254 (20 х 20 мм), отстоящую от края пластины на 20-25 мм с помощью микрошприца или стеклянного капилляра наносят в виде полосы 20 х 3 мм 10 мкл экстракта и по 5 мкл растворов стандартов: ГСО ликуразида, глицирризиновой кислоты. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и элюируют в смеси хлороформ: метанол: вода, взятых в объемном соотношении 61:32:7. Дают фронту растворителя подняться на 10 см, затем после высушивания пластинку рассматривают в видимом и УФ свете при длинах волн 254 и 360 нм: наблюдают желтые (видимый свет) или темно-фиолетовые (УФ свет) пятна с Rf 0,9 - изоликвиритигенин, Rf 0,5 - изоликвиритин, Rf - 0,4 - ликуразид. Только в УФ-свете проявляются синим цветом пятна: глицирризиновой кислоты - Rf 0,1, ликвиритигенин Rf 0,8, ононин Rf 0,6, ликвиритин Rf 0,5. При опрыскивании пластины диазореагентом все вещества, кроме ононина, проявляются в виде желтых или оражевых пятен.

Количественное определение ВЭЖХ

Условия хроматографического разделения: колонка Zorbax ODS, 5 мкм, 250 х 4,6 мм, предколонка - ODS, 5 мкм, 20 х 4,6 мм, объем петли инжектора 20 мкл. Подвижная фаза: градиент метанол - 1,5% уксусная кислота от (20:80) до (40:60) за 60 мин, скорость потока 1 см3/мин, температура колонки 45°C. УФ-детектор, длины волн: 275 нм для обнаружения ликвиритина и 375 нм для обнаружения ликуразида. Время выхода 10 и 25 мин., соответственно.

11.8. Определение флавоновых гликозидов в БАД, содержащих страстоцвет (Passiflora incarnata L)

Приборы и реактивы

Пластины для ТСХ с силикагелем ("Silufol", "Sorbfil").

Реактив Neu: а) смесь 1%-ного раствора дифенилбората аминоэтанола в метаноле и 5%-ного раствора полиэтиленгликоля - 400R (PEG-400R) в метаноле; б) 2%-ный раствор хлорида алюминия в метаноле.

Стандартные растворы в метаноле витексина, изовитексина, сапонарина концентрацией 0,5-1,0 мг/см3.

Подготовка образца

К 1 г порошка БАД добавляют 10 см3 метанола, нагревают с обратным холодильником и при перемешивании на водяной бане при 60°C в течение 10 мин. Экстракт фильтруют через сульфат натрия и упаривают до 1 см3.

К 20 г порошка БАД добавляют 200 см3 этилового спирта, кипятят с обратным холодильником на водяной бане в течение 1 ч, фильтруют и упаривают досуха. Остаток растворяют при перемешивании в 0,5%-ной серной кислоте в течение 15 мин, раствор фильтруют, фильтрат подщелачивают 20%-ным КОН до pH 9 и экстрагируют хлористым метиленом (3 х 50 см3). Экстракт обезвоживают сульфатом натрия и упаривают досуха. Остаток растворяют в 1 см3 метанола.

Идентификация тестового соединения

На стартовую линию пластины Silufol (20 х 20 см), отстоящую от края на 20-25 мм с помощью микрошприца или стеклянного капилляра наносят в виде полосы 20 х 3 мм по 20 мкл экстракта и эталонного раствора витексина, изовитексина или сапонарина. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и элюируют в системе растворителей безводная муравьиная кислота-вода-этилацетат-метилэтилкетон (10:20:50:30). Дают фронту растворителя подняться на 12 см, пластинку высушивают и опрыскивают проявляющим реагентом. На хроматограмме в УФ-свете (365 нм) флавоновые гликозиды проявляются в виде зеленых пятен изовитексин с R_f 0,5, витексин - с R_f 0,65, сапонарин - с R_f 0,15.

Количественное определение суммы флавоновых гликозидов

Количественное определение суммы флавоновых гликозидов проводят с помощью метода спектрофотометрии, согласно разделу 10.

12. Определение содержания гинзенозидов в БАД, содержащих женьшень

В настоящее время корни культивируемого и дикорастущего многолетнего травянистого растения женьшеня (Раnах ginseng С.А.Меу, сем. аралиевых - Araliaceae) и его экстракты используются в качестве добавок при изготовлении ряда пищевых продуктов, а также входят в состав биологически активных добавок к пище. Его биологическая активность связывается, в основном, с соединениями группы тритерпеновых гликозидов (гинзенозидов). Основными гинзенозидами женьшеня являются Re, Rg_1#, Rg_1, Rf, Rg_2, Rbi, Rc, Rb_2, Rd, остальные присутствуют в минорных концентрациях. Для стандартизации корня женьшеня и его препаратов обычно определяют содержание шести гинзенозидов - Re, Rg_1, Rb_1, Rc, Rb_2, Rd. В настоящее время стандартные образцы существуют только для Re#, Rb_1 и Re# (рис. 17).

В качестве метода анализа используется высокоэффективная обращенно-фазная жидкостная хроматография. Предел обнаружения содержания гинзенозидов Rb_1, Re, Re# составляет 0,001 мг/ см3. Отклик детектора линеен в диапазоне концентраций гинзенозидов от 0,001 до 1,00 мг/ см3.

Подготовка проб для анализа

Напитки и биологически активные добавки к пище в жидком виде

10 см3 напитка с женьшенем наносят на патрон Диапак С18, предварительно активированный 10 см3 метилового спирта и 20 см3 дистиллированной воды. Патрон промывают 20 см3 дистиллированной воды. Гинзенозиды смывают 10 см3 метилового спирта в круглодонную колбу вместимостью 25 см3. Раствор отгоняют досуха на роторном испарителе при температуре не более 50°C. Сухой остаток в колбе растворяют в 1 см3 метилового спирта. 200 мкл полученного раствора помещают поверх мембранного фильтра в патрон набора для микрофильтрации образцов на 1,0 см3 (НПФ "БИОХРОМ", Москва, Россия) и центрифугируют на микроцентрифуге-вортекс "MINIGEN" (фирма "Диа-М", Москва, Россия) или Опн-8 при 3 000 об/мин в течение 10 мин.

Биологически активные добавки к пище в сухом виде

Определение содержания суммы гинзенозидов Rb_1, Re, Re

0,005 г (точная навеска) препарата помещают поверх мембранного фильтра в патрон набора для микрофильтрации образцов на 1,0 см3. Добавляют 400 мкл гексана и центрифугируют на микроцентрифуге-вортекс "MINIGEN" при 3 000 об/мин в течение 3 мин. Промывку гексаном повторяют трижды. Затем патрон для образцов сушат под вакуумом до удаления запаха гексана. Фильтр с образцом количественно переносят в герметически закрывающуюся пробирку вместимостью 5 см3 и добавляют 2 см3 дистиллированной воды. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге-вортекс "MINIGEN" или аналогичной в течение 1 мин. 1 см3 раствора помещают в микропробирку из полипропилена объемом 1,5 см3 и центрифугируют на микроцентрифуге-вортекс "MINIGEN" или Опн-8 при 3 000 об/мин в течение 10 мин.

Мед

10 +- 0,01 г меда с женьшенем помещают в коническую колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в 50 см3 воды дистиллированной. 40 см3 полученного раствора наносят на патрон Диапак С18, предварительно активированный 10 см3 метилового спирта и 20 см3 дистиллированной воды. Далее проводят те же операции, которые были описаны выше для напитков и биологически активных добавок к пище в жидком виде.

Приготовление рабочих стандартных растворов

Для приготовления раствора РСО гинзенозида Rb_1 (Rc или Re) в фирменный флакон с РСО соответствующего гинзенозида (Sigma, кат. N G-0777, G-0902 и G-1027) прибавляют 5 см3 метилового спирта и перемешивают до растворения. Срок годности раствора РСО при хранении его при температуре не выше 4°C - 1 мес.

Проведение анализа

Колонка: Кромасил 100 С18 (Kromasil), 7 мкм, 150 х 4 мм ID.

Элюент: ацетонитрил - 0,05% ортофосфорная кислота (30:70), 1,0 см3/мин.

Детектирование: UV, 203 нм.

Таблица 39

Метрологические характеристики методики определения гинзенозидов Rb_1, Rc, Re в корнях женьшеня

Статистический параметр	Rb_1, Rc, Re
Предел обнаружения, мг/мл	0,001
Интервал определяемых концентраций, мг/мл	0,001-1,00
Среднее значение открываемости (показатель правильности), %	95,5
Максимально допустимое расхождение между результатами двух параллельных внутрилабораторных определений (сходимость), при р = 0,95, %	7,0
Максимально допустимое расхождение между результатами двух параллельных межлабораторных определений, (воспроизводимость) при р = 0,95, %	10,0

13. Определение содержания схизандрина в БАД, содержащих лимонник китайский (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill)

Метод основан на определении схизандрина с помощью метода ВЭЖХ.

Температура плавления схизандрина 133°C; [альфа](20)_D + 78° (с 1,0; хлороформ); склонен удерживать кристаллизационную вод# даже при нагревании в вакууме. В УФ-спектре максимумы длин волн в диапазонах 221-224 нм и 249-251 нм.

Подготовка проб для анализа

Напитки и биологически активные добавки к пище в жидком виде, содержащие лимонник, его экстракты, настои и настойки

1 см3 пробы переносят в пробирку для микропроб однократного применения объемом 1,5 см3 и центрифугируют на микроцентрифуге-вортексе "MINIGEN" (фирма "Диа-М", Москва, Россия) или на центрифуге медицинской лабораторной ОПн-8 при 3 000 об/мин в течение 10 мин. Если при анализе пик схизандрина не обнаружен, то раствор предварительно центрифугируют и супернатант упаривают досуха на роторном испарителе. Остаток растворяют в 1-3 см3 30% этилового спирта.

Биологически активные добавки к пище в сухом виде, содержащие лимонник, его экстракты, настои и настойки

Навеску 0,5 г +-0,001 биологически активной добавки к пище помещают в коническую колбу вместимостью 25 см3 и приливают 5 см3 30% этилового спирта. Содержимое колбы перемешивают в течение 5 мин. 1 см3 раствора переносят в пробирку для микропроб однократного применения объемом 1,5 см3 и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

Мед, содержащий лимонник, его экстракты, настои и настойки

Навеску 10 +-0,01 г меда растворяют в 25 см3 дистиллированной воды при нагревании. Концентрирующий патрон Диапак С16 активируют 10 см3 спирта и отмывают 10 см3 воды. 20 см3 водного раствора образца наносят на патрон концентрирующий Диапак С16, порциями по 10 см3, после каждой порции патрон промывают 20 см3 воды. Вещества элюируют с патрона 10 см3 спирта и помещают в круглодонную колбу вместимостью 25 см3. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе. В колбу приливают 2 см3 спирта и растворяют сухой остаток. 1 см3 раствора помещают в пробирку для микропроб однократного применения объемом 1,5 см3 и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

Приготовление рабочих стандартных растворов

5 +-0,1 мг стандартного образца схизандрина переносят в мерную колбу на 10 см3, растворяют в небольшом количестве метанола и затем доводят до метки метанолом. Получают раствор РСО с концентрацией 0,5 мг/см3. Раствор РСО хранят в темном месте в холодильнике в посуде с пришлифованной пробкой не более 3 мес. В хроматограф вводят 5-10 мкл раствора образца.

Проведение анализа

Предколонка: мини-картридж Элсикарт, 8x4 мм, Диасорб 130 С16Т;

Колонка: Диасорб 130 С16Т, 11 мкм, 250 х 4 мм ID;

Подвижная фаза - ацетонитрил - вода (50:50), 1,0 см3/мин;

Детектирование: UV, 216 нм.

Время удерживания схизандрина составляет около 12 мин.

Таблица 40

Метрологические характеристики методики определения схизандрина в плодах, семенах и лианах лимонника

Статистический параметр	Схизандрин
Предел обнаружения, мг/мл	0,001
Интервал определяемых концентраций, мг/мл	0,001-1,00
Среднее значение открываемости (показатель правильности), %	95,5
Максимально допустимое расхождение между результатами двух параллельных внутрилабораторных определений (сходимость), при р = 0,95, %	7,0
Максимально допустимое расхождение между результатами двух параллельных межлабораторных определений (воспроизводимость) при р=0,95, %	10,0

14. Определение содержания элеутерозида В (сирингина) в БАД, содержащих элеутерококк колючий

Компонентами элеутерококка являются стероиды (даукостерин), фенилпропаноиды с замещенными фенольными группами (сирингин), лигнаны (элеутерозид D), оксикумарины (7-O-бета-D-глюкозилизофраксидин), алканы (этил-альфа-D-галактозид или элеутерозид С), а также негликозилированные соединения различных классов: фенилпропаноиды со свободными фенольными гидроксилами (хлорогеновая кислота, конифериловый альдегид, этиловый эфир кофейной кислоты, синаповый спирт), лигнаны (сирингарезинол, сезамин), тритерпеноиды (олеаноловая кислота), кумарин (изофраксидин), ситостерины (бета-ситостерин, кампестерин), полисахариды и др.

Сирингин мало и медленно растворим в воде и в 95%-ном спирте.

В качестве метода анализа используют высокоэффективную обращенно-фазную жидкостную хроматографию. Предел обнаружения элеутерозида В составляет 0,001 мг/см3. Диапазол определяемых концентраций - от 0,001 до 1,00 мг/см3.

Приборы и реактивы

Облучатель ультрафиолетовый.

Пластины для ТСХ "Сорбфил ПТСХ-П-А" 10 х 15 см.

Пластины Silufol.

ВЭЖХ с УФ - детектором.

Приготовление рабочего раствора сирингина (элеутерозида В)

0,01 +-0,0005 г сирингина помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, прибавляют 40 см3 60% этилового спирта, перемешивают до растворения и доводят объем раствора до метки. Срок хранения рабочего раствора при температуре 5-10°C составляет 1 мес.

Подготовка образца

К 0,2 г препарата (содержание элеутерококка 15%) добавляют 25 см3 этилового спирта 30% и перемешивают в течение 30 мин. Центрифугируют при 3 000 об/мин 1,5 см3 экстракта в пробирке для микропроб однократного применения.

0,05 г змельченного сырья обезжиривают 3-х кратной экстракцией хлороформом или гексаном, из остатка экстрагируют элеутерозиды метанолом или 95% этанолом (10 см3) при нагревании с обратным холодильником при 50°C в течение 1 ч, раствор фильтруют и доводят объем до первоначального.

Идентификация тестового соединения с помощью метода ТСХ

На пластину для ТСХ полосой наносят 30 мкл экстракта, высушивают при 100°C в течение 15 мин. Хроматографирование проводят в системе растворителей: этиловый спирт 96% - хлороформ (7:3). Пластину сушат при 100°C в течение 5 мин. В УФ - свете (360 нм) наблюдают бледно-голубую полоску с Rf 0,64.

Проводят хроматографирование экстракта (п. 3.2) на пластинах Silufol в системе хлороформ-метанол-вода (61:32:7). Проявление пятен производят опрыскиванием пластины 20% серной кислотой.

Проведение ВЭЖХ

Колонка: Диасорб 130 С16Т, 11 мкм, 250 х 4 мм ID или аналогичная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода-ледяная уксусная кислота (85:15:0,5), 1 см3/мин.

Детектирование: UV, 266 нм.

Время удерживания элеутерозида В около 12 мин.

Таблица 41

Метрологические характеристики методики определения элеутерозида В в напитках и БАД в сухом виде

Статистический параметр	элеутерозид В (сирингин)
Предел обнаружения, мг/мл	0,001
Интервал определяемых концентраций, мг/мл	0,001-1,00
Среднее значение открываемости, (правильность), %	95,5
Максимально допустимое расхождение между результатами двух параллельных внутрилабораторных определений (сходимость), р = 0,95%, %	7,0
Максимально допустимое расхождение между результатами двух параллельных межлабораторных определений (воспроизводимость), р = 0,95, %	10,0

15. Определение производных кофейной (3,4-дигидрокси-коричной) кислоты в БАД на основе экстрактов эхинацеи пурпурной

Идентификации и количественного# определение производных кофейной кислоты в препаратах эхинацеи проводится с помощью метода ВЭЖХ.

Приготовление пробы

1 г измельченной травы, содержимое капсул или растертых таблеток помещают в колбу объемом 200 см3, прибавляют 100 см3 смеси метанол - вода (7:3) и ведут экстракцию при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течении 10-15 мин. Экстракт охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр.

Приготовление рабочего стандартного образца (РСО)

В качестве внутреннего стандарта, используют 3-О-метилпроизводное кофейной кислоты - феруловую кислоту V (3-(4'-гидрокси-3'-метоксифенил)-проп-2-еновая кислота) - вещество близкое по хроматографической подвижности и спектральным свойствам к анализируемым производным кофейной кислоты. Для приготовления РСО с концентрацией 0,1 мг/см3, в мерную колбу на 50 см3 вносят навеску 5 мг феруловой кислоты и добавляют до метки метанола. Смесь взбалтывают до полного растворения. Концентрация РСО проверяют с помощью УФ-спектрофотометрии (длина волны максимума 234 нм (log E 4,10).

Проведение анализа

Условия ВЭЖХ. К 1 см3 экстракта добавляют 1 см3 стандартного раствора феруловой кислоты с концентрацией 0,1 мг/см3 (100 мкг). Анализ проб проводят с помощью жидкостного хроматографа с УФ-спектрофотометрическим детектором. Колонка с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом "Нуклеосил С 18" (250 х 4,6 мм) или аналогичная. Подвижная фаза: ацетонитрил-0,05М NaH2PO4, pH 2,6 (15:85); скорость потока 1,2 см3/мин; детектирование при ламбда = 330 нм; объем вводимой пробы 5-20 мкл.

Содержание цикориевой, кафтаровой и хлорогеновой кислот в образце вычисляют по формуле:

                          K x C x S  x V x 100%

                    X% = -----------------------, где

                                S  x M

     С    - концентрация  внутреннего  стандарта  в  анализируемой пробе,

            мг/мл;

     S    - площадь пика цикориевой кислоты;

     S    - площадь пика феруловой кислоты;

     V    - общий объем экстракта, мл;

     М    - масса навески, мг;

     К    - коэффициент, учитывающий различие в УФ-поглощении внутреннего

            стандарта V и анализируемых кислот I-III.

     K    = 1,212 (для цикориевой кислоты)

     К    = 1,548 (для кафтаровой кислоты)

II

     K    = 1,744 (для хлорогеновой кислоты)

III

Таблица 42

Метрологические характеристики методики определения 3,4-дигидроксикоричной кислоты

Статистический параметр	Цикориевая кислота
Предел обнаружения; %	0,005
Интервал определяемых концентраций, %	0,005-10
Среднее значение открываемости, (правильность), %	90-95
Максимально допустимое расхождение между результатами двух параллельных внутрилабораторных определений (сходимость), р = 0,95%, %	8,0
Максимально допустимое расхождение между результатами двух параллельных межлабораторных определений (воспроизводимость), р = 0,95, %	10,0

16. Определение берберина и иохимбина в БАД

Описание берберина

Светло-желтые кристаллы. Растворимость: растворим в воде; легко растворим в спирте; очень легко растворим в горячем спирте и воде; растворим в бензоле, хлороформе, эфире. Алкалоид встречается в корневищах канадского желтокорня (Hydrastis canadensis), а также в растениях сем. Лютиковых (Ranunculaceae), барбарисовых (Веrberidaceae), лунносемянниковых (Menispermaceae), рутовых (Rutaceae), и др.

Описание берберина гидрохлорида

Из Н2О кристаллизуется в виде игл. Растворимость: практически не растворим в спирте. UV спектр - 228 нм (Е1% 814), 263 нм (Е1%794), 345 нм (Е1%722), 421 нм (Е1%160) (данные по стандарту на гидрохлорид берберина Национального института здравоохранения Японии Eisei Shikenjo Hokoku 1995; 113:121-126) (рис. 23).

Описание иохимбина C21H26O3N2, М-354,43

Белый или беловатый кристаллический порошок, без запаха, слабо горького вкуса. Кристаллизуется в иглах из разбавленного спирта. Растворимость: трудно растворим в воде, спирте и хлороформе; растворим в эфире. Т_пл, 234-235°C, [альфа](20) от 50°C до 55°C (С2Н5ОН); 11°C (СHCl3); 108°C (пиридин).

Описание иохимбина гидрохлорида

Кристаллизуется в виде орторомбических листочков или призм. Растворимость: легко растворим в воде; растворим в спирте. Т_пл 288-290°C (с разл.). [альфа](20)_D 100°C (с = 1, Н2О).

Подготовка проб для хроматографического анализа

Методика включает предварительную экстракцию алкалоидов из препаратов БАД смесями растворителей, близкими по составу к подвижной фазе при ВЭЖХ. Полноту экстракции алкалоидов оценивали по методике Британской фармакопеи (British Pharmacopoeia, 1990, vol., Арр. ХЗ G, A112).

Для БАД, содержащих порошок коры иохимбе (корневища желтокорня)

0,5-1,0 г измельченного содержимого капсул или растертых таблеток помещают в коническую плоскодонную колбу вместимостью 25 см3 с притертой пробкой, прибавляют 5-10 см3 0,01N и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10-15 мин. Водно-кислотный экстракт фильтруют через слой окиси алюминия.

Для БАД, содержащих экстракт коры иохимбе (корневища желтокорня)

0,5-1,0 г измельченного содержимого капсул или растертых таблеток помещают в в# коническую плоскодонную колбу с притертой пробкой, прибавляют 25 см3 метанола, подкисленного раствором соляной кислоты и оставляют на 1 ч. (рассчитать количество 0,01N HCl для подкисления метанола до pH 2,9). Метанольный раствор фильтруют через слой окиси алюминия.

Приготовление стандартных растворов (РСО)

Для приготовления РСО с концентрацией 50 нг/мкл в мерную колбу на 100 см3 вносят точные навески по 0,005 г стандартных образцов иохимбина гидрохлорида (берберина гидрохлорида); добавляют по 50 см3 воды и метанола для хроматографии (ТУ 6-09-4326-76, "ХЧ"), затем взбалтывают до полного растворения. Чистоту РСО проверяют с помощью ВЭЖХ, ТСХ и УФ-спектрофотометрии. Полученные растворы РСО используют как для идентификации компонентов БАД по параметрам удерживания при ВЭЖХ, так и для количественной оценки их содержания в образцах.

Проведение анализа

ТСХ-скрннинг#

Для ТСХ скрининга алкалоидов применяют пластинки с силикагелем с УФ-254 нм индикатором (силуфол, Чехия).

Подвижные фазы

Берберин: этилацетат-изопропанол-уксусная кислота 20% (4:6:1).

Иохимбин: бензол-этилацетат-изопропанол-аммиак (12:6:4:0,5).

В качестве свидетелей применяют растворы стандартных образцов (РСО).

Зоны веществ на хроматограммах детектируют с помощью реактива Драгендорфа, по флуоресценции при 366 нм и по гашению флуоресценции индикатора при 254 нм. После разделения пластинки подсушивают и детектируют в УФ-свете при длине волны 360 нм. Чувствительность метода составляет от 1,5 до 0,5 мкг в пятне каждого алкалоида.

Условия ВЭЖХ

Анализ проб проводят с помощью жидкостного хроматографа со спектрофотометрическим детектором. Колонка с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом "Нуклеосил С 18" (200 х 4,6 мм) или аналогичная.

Подвижная фаза - метанол-вода-85%-о-фосфорная кислота (35:65:0,2, pH 3,0).

Содержание алкалоидов определяют методом абсолютной калибровки по внешнему стандарту. В качестве стандартных образцов используют химически чистые для хроматографии - Yohimbine hydrochloride (Y3125 SIGMA), Berberine Chloride (B3251 SIGMA).

Содержание действующего вещества в 1 таблетке/капсуле в миллиграммах (X) в образце вычисляют по формуле:

                         H  x m   x V  x 1000

                          x    st    1

                    X = ----------------------, где

                              H   x V

                               st    2

     Н   - площадь пика соответствующего компонента в испытуемом образце;

х

     H   - площадь пика соответствующего компонента в растворе РСО;

st

     m   - масса стандарта, нг;

st

     V   - объем испытуемого раствора, мл;

     V   - объем введенной пробы, мкл.

Пределы обнаружения алкалоидов: в таблетках БАД массой от 0,5 до 2,0 г составляют для иохимбина - 0,1 мг/табл., для берберина - 0,02 мг/табл.

17. Определение стевиозидов в БАД, содержащих стевию (Stevia rebaudiana)

Содержание стевиозида в листьях стевии 10-12%, в растениях, выращенных в Средней Азии, до 18%, в Крыму, Украине, Молдавии, Грузии 5-7%. Стевиозид хорошо растворим в воде, спирте, при нагревании неустойчив.

Подготовка образца

Таблетки или содержимое капсулы перетирают в ступке до порошка и экстрагируют трижды 60%-ным этанолом при 50°C с обратным холодильником в течение 15 мин на водяной бане. Спиртовые экстракты объединяют, спирт отгоняют на роторном испарителе при температуре не выше 40°C. К сухому остатку прибавляют воду, а затем хлороформ. Пробу переносят в делительную воронку и встряхивают. Сливают нижний слой и экстракцию проводят еще два раза. Хлороформ полностью отделяют (если необходимо пробу центрифугируют), к водному слою прибавляют этанол до конечной его концентрации 50%.

Идентификация и количественное определение стевиозида

ВЭЖХ: Колонка из нержавеющей стали, длина 250 мм, диаметр 4,0 мм. Сорбент - сепарон SGX NH2, зернение 7 мкм. Перед работой новую колонку промывают 40 см3 изопропанола, затем 80 см3 деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной фазой до стабильной нулевой линии.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (80:20).

Стандартный раствор стевиозида концентрацией 200 мкг/см3 в 50%-ном этаноле.

Детектирование: спектрофотометр, длина волны УФ 208 нм. шкала 0.02 AUFS, скорость потока 1,0 см3/мин., время удерживания стевиозида - 12,4 +-0,1 мин. Обработка хроматографических данных по программе МультиХром для Windows, версия 1.39.

Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз. Ошибка метода +-2%.

18. Определение салидрозидов в БАД, содержащих родиолу розовую (Rhodiola rosae L)

Приборы и реактивы

Пластины для ТСХ "Silufol".

Облучатель ультрафиолетовый.

Спектрофотометр.

Раствор ацетата свинца 10%. Раствор натрия карбоната, 2%. Насыщенный раствор сульфата натрия.

Диазотированный сульфанил: 7 г сульфацила натрия растворяют в 50 см3 воды в мерной колбе вместимостью 100 см3, добавляют 9 см3 концентрированной соляной кислоты, доводят раствор до метки. 1 см3 полученного раствора помещают в колбу вместимостью 100 см3 ставят на лед, добавляют 50 см3 воды, 0,2 см3 10% натрия нитрита.

Подготовка образца

1. 1,0 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу, добавляют 10 см3 метанола, смесь нагревают на водяной бане с обратным холодильником при температуре 65°C и перемешивании в течение 20 мин. Раствор фильтруют.

2. 0,5 г продукта экстрагируют 10 см3 воды при нагревании с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Раствор фильтруют или центрифугируют, осадок экстрагируют еще трижды по 10 см3 воды, объединенный экстракт фильтруют, охлаждают.

Идентификация тестовых соединений с помощью ТСХ

На стартовую линию пластины Silufol (20 х 20 см), отстоящую от края пластины на 20-25 мм с помощью микрошприца или стеклянного капилляра наносят в виде полосы 20 х 3 мм 10 мкл экстракта, приготовленного по п. 1. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и элюируют в смеси хлороформа, метанола и воды, взятых в объемном соотношении 26:14:3. Дают фронту растворителя подняться на 10 см, затем после высушивания пластинку просматривают в УФ-свете (254 нм). На хроматограмме обнаруживают доминирующее пятно фиолетового цвета с R_f 0,4 - розавин. Пластинку опрыскивают 10% водным раствором натрия карбоната, нагревают в сушильном шкафу при температуре 110°C в течение 2 мин., опрыскивают диазотированным сульфанилом и снова нагревают 2 мин при 100°C. На хроматограмме салидрозид наблюдают в виде полосы красноватого цвета с R_f 0,42.

Количественное определение салидрозида

К экстракту, полученному по п. 2, прибавляют 6 см3 10% ацетата свинца, 2 см3 насыщенного раствора сульфата натрия, перемешивают, доводят объем до 50 см3, фильтруют, первые 15 см3 отбрасывают. В мерную колбу на 25 см3 переносят 5 см3 фильтрата, прибавляют 2,5 см3 натрия карбоната и 2,5 см3 диазотированного сульфанила, доводят объем до метки, перемешивают и через 5 мин измеряют оптическю плотность раствора относительно воды при 486 нм.

Содержание салидрозида, %, вычисляют по формуле:

                           D x 250 x 100

                    X = ---------------------, где

                         253 х m х (100 - W)

     D   - оптическая плотность,

     253 - удельный показатель поглощения (Е/% см),

     m   - масса в г,

     W   - влажность, %

19. Определение дубильных веществ в БАД, содержащих черемуху (Padus Avium Mill); ольху (ALNus incana); дуб (Qercus robur); бадан (Bergenia crassifolia)

Приборы и реактивы

Раствор перманганата калия 0,02 М.

Раствор индигосульфокислоты: в мерную колбу помещают 1 г индиго кармина, 50 см3 концентрированной серной кислоты, объем доводят водой до 1 дм3.

Подготовка образца

К 2 г измельченных корней добавляют 250 см3 нагретой до кипения воды, смесь кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин, экстракт фильтруют.

Количественное определение дубильных веществ

25 см3 раствора, полученного выше, разбавляют водой до 500 см3, добавляют 25 см3 раствора индигосульфокислоты и титруют раствором перманганата до золотисто-желтого окрашивания.

1 см3 раствора перманганата соответствует 4,157 мг таннина.

Содержание дубильных веществ по галловой кислоте

Приборы и реактивы

0,05 М раствор натрия тетрабората - буры (тетраборнокислого 10-ти водного): 19,07 г буры растворяют в 1000 см3 воды.

0,1Н раствор соляной кислоты: 8,5 см3 соляной кислоты концентрированной (плотность 1,190) разбавляют до 1 дм3 водой.

Буферный раствор pH 9: смешивают 900 см3 0,05 М раствора буры и 100 см3 0,1 Н соляной кислоты.

Количественное определение дубильных веществ

2-4 см3 исследуемого раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, добавляют 30 см3 50%-ного этилового спирта, взбалтывают до растворения, доводят до метки 50%-ным этиловым спиртом (раствор А).

1 см3 раствора А помещают в колбу вместимостью 50 см3, доводят до метки буферным раствором (раствор В).

Через 10 мин измеряют оптическую плотность раствора В при 277 нм. В качестве раствора сравнения используют буферный раствор.

Массовую долю дубильных веществ в пересчете на галловую кислоту, % (X), определяют по формуле:

                     50 x 50 x D x 10 x 100 x K

                Х = ----------------------------, где

                       m х Е х 1%/1см х 1000

     Е - удельный показатель  поглощения  галловой  кислоты,  равный  508

         (оптическая плотность 1% раствора галловой кислоты - мг/см3);

     m - масса образца, г;

     К - коэффициент разведения (10 = 250/25);

     или по формуле

                    0,0197 х 50 х 50 х 100 х K

               X = -----------------------------, %, где

                           m x 1000

     0,0197 - концентрация раствора галловой кислоты, мг/см3,  оптическая

              плотность которого равна 1.

20. Определение производных антрахинона

20.1. В БАД, содержащих марену красильную (Rubia tinctorum L.), Марену грузинскую (Rubia iberica (FICH.EX.DC.)C.COCH)

Приборы и реактивы

Спектрофотометр или ФЭК.

Щелочно-аммиачный раствор: 50 г едкого натра растворяют в 870 см3 воды, добавляют 80 см3 концентрированного раствора аммиака.

Подготовка образца

0,1 г измельченного продукта помещают в колбу на 200 см3, добавляют 7,5 см3 ледяной уксусной кислоты, 1 см3 концентрированной соляной кислоты, смесь нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 15 мин, периодически встряхивая и смывая осадок со стенок. Колбу охлаждают и проводят экстракцию эфиром 3 х 30 см3 при нагревании на водяной бане при 35°C с обратными холодильником в течение 15 мин с момента закипания эфира. Объединенные эфирные извлечения после охлаждения фильтруют через вату в делительную воронку на 250 см3, промывают водой 2 х 20 см3. При непрерывном охлаждении приливают малыми порциями сначала 15 см3 30%-ного раствора едкого натра, затем 25 см3 щелочно-аммиачного раствора, не переставая охлаждать смесь, встряхивают 5 мин и окрашенный раствор собирают в мерную колбу на 500 см3. Экстракцию щелочно-аммиачным раствором повторяют несколько раз до прекращения окрашивания щелочного раствора. К объединенному извлечению добавляют 3 капли пергидроля, перемешивают и доводят объем щелочно-аммиачным раствором до метки (раствор 1).

Для извлечения свободных производных антрахинона 0,1 г измельченного продукта помещают в колбу на 300 см3, прибавляют 50 см3 эфира и нагревают на водяной бане с обратным холодильником 10 мин. Экстракцию повторяют трижды, эфирные извлечения объединяют, охлаждают и экстрагируют призводные антрахинона 4 х 20 см3 щелочно-аммиачным раствором, каждый раз встряхивая по 5 мин, щелочной раствор переносят в мерную колбу на 100 см3, прибавляют каплю пергидроля, доводят объем до метки щелочно-аммиачным раствором (раствор 2).

Количественное определение антрахиноновых производных

Количественное определение антрахиноновых производных#

Измеряют оптическую плотность растворов 1 и 2 при 530 нм, в качестве калибровочных используют растворы хлорида кобальта концентрациями 10-50 мг/см3. 10 мг/см3 хлорида кобальта соответствует концентрации свободных производных антрахинона 0,0027 мг/см3.

Содержание суммы производных антрахинона (%) вычисляют по формуле:

                           C  x 500 x 100 x 100

                     X  = ----------------------.

                      1       M x (100 - W)

Содержание свободных производных антрахинона (%) вычисляют по формуле:

                       С  х 100 x 100 x 100

                 X  = ---------------------- , где

                  2      M x (100 - W)

     С  и С  - концентрации производных анатрахинона, определенные в

      1    2   растворах 1 и 2,

     М       - масса образца,

     W       - потеря при высушивании, %.

Содержание связанных производных антрахинона (X, %)Х = Х_1 - X_2.

20.2. В БАД, содержащих ревень тангутский (Rheum palmatum L.)

Приборы и реактивы

Спектрофотометр или ФЭК.

Подготовка образца

1. 1,0 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу, добавляют 10 см3 10%-ного спиртового раствора едкого натра, смесь кипятят в течение 3-5 мин. Раствор фильтруют, охлаждают, подкисляют разбавленой соляной кислотой до слабо кислой реакции по индикаторной бумаге, прибавляют 10 см3 эфира, взбалтывают в течение 2-3 мин. Эфирный слой окрашивается в желтый цвет.

2. 0,05 г продукта экстрагируют 7,5 см3 ледяной уксусной кислоты при нагревании с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения в колбу через обратный холодильник добавляют 30 см3 эфира и кипятят 15 мин, экстракты охлаждают, фильтруют или центрифугируют, промывают осадок на фильтре или центрифугат эфиром. Эфирные экстракты объединяют, фильтруют или центрифугируют. Осадок экстрагируют еще трижды по 10 см3 воды, объединенный экстракт фильтруют, охлаждают, фильтрат подкисляют разбавленой соляной кислотой до слабо кислой реакции по индикаторной бумаге, прибавляют 10 см3 эфира, встряхивают в течение 2-3 мин.

Идентификация тестовых соединений

5 см3 эфирного экстракта, полученного по п. 1, смешивают с 5 см3 раствора аммиака. Аммиачный слой приобретает вишнево-красное окрашивание (эмодины), эфирный слой остается окрашенным в желтый цвет (хризофон).

Количественное определение антраценовых производных (в пересчете на истизин)

К экстракту, полученному по п. 2., прибавляют 100 см3 щелочно-аммиачного раствора и осторожно встряхивают в течение 5-7 мин, охлаждая воронку под струей воды. После полного расслоения прозрачный красный нижний слой сливают в мерную колбу на 250 см3. Из эфирного слоя экстракцию продолжают аммиачно-щелочным раствором до прекращения окрашивания раствора, объединенные экстракты доводят до метки аммиачно-щелочным раствором. 25 см3 этого раствора помещают в коническую колбу на 100 см3, нагревают 15 мин. на кипящей водяной бане при периодическом перемешивании. После охлаждения раствор переносят в мерную колбу на 25 см3 и доводят объем водой до метки. Измеряют оптическую плотность раствора при 530 нм, в качестве калибровочных используют растворы хлорида кобальта 10-50 мг/см3. Концентрация 2,5 мг/см3 хлорида кобальта соответствует концентрации истизина 0,0009 мг/см3.

20.3. В БАД, содержащих крушину ольховидную (Frangula alnus mill)

Приборы и реактивы

Спектрофотометр или ФЭК.

Подготовка образца

1. 1,0 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу, добавляют 10 см3 10%-ного спиртового раствора едкого натра, смесь кипятят в течение 3-5 мин. Раствор фильтруют, охлаждают, подкисляют разбавленой соляной кислотой до слабо кислой реакции по индикаторной бумаге, прибавляют 10 см3 эфира, встряхивают в течение 2-3 мин, эфирный слой окрашивается в желтый цвет.

2. 0,05 г образца экстрагируют 7,5 см3 ледяной уксусной кислоты при нагревании с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения в колбу через обратный холодильник добавляют 30 см3 эфира и кипятят 15 мин, экстракт охлаждают, фильтруют или центрифугируют, промывают осадок на фильтре или центрифугат эфиром. Эфирные экстракты объединяют, фильтруют или центрифугируют. Осадок экстрагируют еще трижды по 10 см3 воды, объединенный экстракт фильтруют, охлаждают, фильтрат подкисляют разбавленой соляной кислотой до слабо кислой реакции по индикаторной бумаге, прибавляют 10 см3 эфира, встряхивают в течение 2-3 мин.

Идентификация тестовых соединений

Количественное определение антраценовых производных (в пересчете на истизин)

К экстракту, полученному по п. 2, прибавляют 100 см3 щелочно-аммиачного раствора и осторожно взбалтывают в течение 5-7 мин перемешивают, охлаждая воронку под струей воды. После полного расслоения прозрачный красный нижний слой сливают в мерную колбу на на# 250 см3, из эфирного слоя экстрагируют аммиачно-щелочным раствором до прекращения окрашивания раствора, объединенные экстракты доводят до метки аммиачно-щелочным раствором. 25 см3 этого раствора помещают в коническую колбу на 100 см3, нагревают 15 мин. на кипящей водяной бане при периодическом перемешивании, после охлаждения раствор переносят в мерную колбу на 25 см3 и доводят объем водой до метки. Измеряют оптическую плотность раствора при 530 нм, в качестве калибровочных используют растворы хлорида кобальта 10-50 мг/см3. Концентрация 2,5 мг/см3 хлорида кобальта соответствует концентрации истизина 0,0009 мг/см3.

20.4. В БАД, содержащих сенну (Salvia officinalis L)

Приборы и реактивы

Спектрофотометр или ФЭК.

Подготовка образца

1. 0,5 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу, добавляют 10 см3 10%-ного спиртового раствора едкого натра, смесь кипятят в течение 3-5 мин. Раствор фильтруют, охлаждают, подкисляют разбавленой соляной кислотой до слабо кислой реакции по индикаторной бумаге, прибавляют 10 см3 эфира, взбалтывают в течение 2-3 мин. Эфирный слой окрашивается в желтый цвет.

2. 0,4 г продукта экстрагируют 100 см3 воды при нагревании с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 20 мин. После охлаждения в колбу через обратный холодильник, добавляют эфир, экстрагируют 2 раза по 30 см3, эфирные экстракты отбрасывают, водную фазу подогревают до исчезновения запаха эфира, добавляют 0,1 г натрия гидрокарбоната, 10 см3 10%-ного раствора хлорида окисного железа, нагревают на кипящей водяной бане при перемешивании в течение 20 мин, добавляют 5 см3 50%-ной серной кислоты и нагревают еще 20 мин. После охлаждения раствор переносят в делительную воронку, колбу ополаскивают 20 см3 воды и 75 см3 эфира, экстрагируют из объединенной водной фазы эфиром еще дважды по 20-30 см3, объединенные эфирные экстракты фильтруют, промывают водой. К эфирному экстракту добавляют 100 см3 щелочно-аммиачного раствора, перемешивают 5 мин., водную фазу переносят в колбу на 300 см3, к эфирному экстракту добавляют 20 см3 воды и 3 см3 концентрированной соляной кислоты, воронку охлаждают под струей воды и перемешивают слои, водную фазу переносят в колбу с водно-щелочной вытяжкой. Объединенные щелочно-аммиачные эктракты доводят до метки щелочно-аммиачным раствором.

Идентификация тестовых соединений

5 см3 эфирного экстракта, полученного по п. 1, встряхивают с 5 см3 раствора аммиака. Аммиачный слой приобретает вишнево-красное окрашивание (эмодины), эфирный слой остается окрашенным в желтый цвет (хризофановая кислота).

Количественное определение антраценовых производных (в пересчете на хризофановую кислоту)

Измеряют оптическую плотность раствора, полученного по п. 2, при 530 нм, в качестве калибровочных используют растворы хлорида кобальта 1-5%; 1%-ный раствор хлорида кобальта соответствует концентрации хризофановой кислоты 4,3 мг/дм3 щелочно-аммиачного раствора.

21. Определение гидрохинона и его производных в БАД, содержащих толокнянку (Uvae ursi folium)

Арбутин (бета-глюкозид гидрохинона) является полифенольным индикаторным компонентом толокнянки Uva Ursi. Метод анализа арбутина включает стадии кислотного гидролиза с последующим определением гидрохинона с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с спектрофотметрическим детектором при длине волны 280 нм.

Приборы и реактивы

Система ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором.

Гидрохинон, Sigma.

Приготовление рабочего стандартного раствора

Точную навеску 1 мг стандартного образца гидрохинона переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, до половины содержащую метанол, встряхивают до полного растворения вещества, доводят обьем метанолом до метки и тщательно перемешивают.

Подготовка образца

Содержимое капсул или растертых таблеток, содержащих около 1,0 г порошка листьев или экстракта толокнянки помещают в круглодонную колбу объемом 250 см3, добавляют 90 см3 смеси метанол-вода-концентрированная соляная кислота (70:30:2) и экстрагируют на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа. Экстракт охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через целлюлозный или тефлоновый фильтр с размером пор до 0,45 мкм в мерную колбу вместимостью 100 см3. Объем экстракта доводят дистиллированной водой до метки.

Проведение анализа

Колонка: Kromosil С18 или аналогичная, 5 мкм, 250 х 4,6 мм ID;

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1М ортофосфорная кислота, pH 2,6 (20:80), скрость# потока 1,0 см3/мин

Детектирование: УФ, 280 нм.

Обьем вводимой пробы 5-20 мкл.

Примерное время удерживания гидрохинона 4,5-5 мин.

Идентификацию гидрохинона проводят сравнением времени удерживания со стандартным образцом. При количественном определении используют метод внешней калибровки, сравнивая площади пиков гидрохинона в образце и стандарте.

Концентрацию арбутина определяют умножением найденной концентрации гидрохинона на коэффициент пересчета 2,473.

22. Определение производных кумарина

22.1. В БАД, содержащих крапиву (Urtica dioica L)

Скополетин (6-метокси-7-оксикумарин-гельзелиновая кислота)

Приборы и реактивы

Пластины для ТСХ "Silufol".

Облучатель ультрафиолетовый.

10%-ный водный раствор серной кислоты.

20%ный раствор аммиака.

Стандартный раствор: 0,05%-ный раствор скополетина в метаноле (раствор 1).

Подготовка образца

Экстракция стеринов

5,0 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу соединенную с обратным холодильником, добавляют 100 см3 хлористого метилена, смесь нагревают на водяной бане при перемешивании в течение 30 мин. Раствор охлаждают, фильтруют, растворитель упаривают на ротационном испарителе до небольшого объема, остаток растворителя удаляют в токе воздуха. Вещество растворяют в 2 см3 хлористого метилена.

2,0 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу, соединенную с обратным холодильником, добавляют 100 см3 циклогексана, смесь нагревают на водяной бане при перемешивании в течение 30 мин. Смесь фильтруют, повторяют экстракцию в тех же условиях. Объединенные экстракты охлаждают, фильтруют, растворитель упаривают на ротационном испарителе до небольшого объема, остаток растворителя удаляют током воздуха. Вещество растворяют в 5 см3 смеси ацетонитрил-тетрагидрофуран (96:4).

Экстракция скополетина

5,0 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу, соединенную с обратным холодильником, добавляют 50 см3 метанола, смесь нагревают на водяной бане при перемешивании в течение 30 мин. Раствор охлаждают, фильтруют, растворитель упаривают на ротационном испарителе до небольшого объема, остаток растворителя удаляют в токе воздуха. Вещество растворяют в 2 см3 метанола.

Качественный анализ скополетина с помощью метода ТСХ

На стартовую линию пластины Silufol (20 х 20 см), отстоящую от края пластины на 20-25 мм микрошприцем или стеклянным капилляром наносят в виде полосы 20 х 3 мм 10 мкл экстракта и 5 мкл контрольного раствора 1. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и элюируют в смеси толуол-эфир диэтиловый (40:60), насыщенной раствором 10%-ной уксусной кислоты. Дают фронту растворителя подняться на 10 см, затем после высушивания пластинку опрыскивают 20% раствором аммиака. При рассматривании в УФ-свете (длина волны 360 нм) обнаруживают синюю флуоресцирующую полосу с Rf 0,25, соответствующую полосе скополетина в контрольном образце.

22.2. В БАД, содержащих вздутоплодник сибирский (Pholojodicarpus sibiricus-fisch.ex. sp re ng)

Производные пиранокумаринов: виснадин, дигидросамидин

Приборы и реактивы

Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором.

Раствор фловерина (природная смесь дигидросамидина и виснадина) - 0,5 мг/см3 в 95%-ном этаноле.

Подготовка образца

1 г измельченного сырья экстрагируют в аппарате сокслета хлороформом в течение 1 часа (9-10 сливов). Хлороформ упаривают до объема 1-2 см3. К остатку добавляют 5 см3 95% этанола, содержимое количественно переносят в мерную колбу на 10 см3, объем доводят до метки 95% этанолом.

Идентификация и количественное определение тестовых соединений

Проводят ГЖХ определение суммарного содержания производных пиранокумаринов. Условия ГЖХ: стеклянная колонке 1200 х 2 мм, заполненная хроматоном N-AW-HMDS с размером частиц 0,16-0,20 мм с 2% лукопрена G1000.

Температура колонки - 200°C, испарителя - 240°C.

Скорость газа-носителя (азот) 50 см3 /мин.

В инжектор вводят 5-6 мкл исследуемого раствора и такое же количество контрольного раствора фловерина.

Фловерин при данных условиях разделения элюируется одним пиком. Расчет производят по площадям пиков контрольного образца и пробы.

23. Определение содержания эфирных масел и подтвержение состава компонентов

Таблица 43

Компонентный состав эфирных масел (краткий перечень)

	Состав эфирного масла
Анис обыкновенный (Anisum vulgare Gaerth), плоды	анетол (80%), метилхавикол, анискетон, ацетальдегид, анисовая кислота
Кориандр посевной (Coriandrum sativum L.), плоды	d-линалоол (65%.), i-пинен, n-цимол, феландрен, дипентен, терпинолен, терпинен, гераниол, борнеол, геранилацетат, борнилацетат
Эвкалипт шариковый (Eucaliptus globulus Labill), листья	Цинеол(60%), d-пинен, эвгенол, глобулол, пинакарнеол, сесквитерпены, альдегиды
Фенхель обыкновенный (Foeniculum vulgare Mill), плоды	Анетол (60%), фенон (20%)метилхавикол(10%), пинен, камфен, диптен, фелландрен
Лаванда колосовая (Lavandula spica L.), соцветия	1-линалилацетат(35%), спирты (10-30%): 1-линалоол, изоамиловый спирт, гераниол
Мята перечная (Mentha piperita L.), листья и другие наземные части	1-ментол (50%),1-ментон (10-20%), эфиры ментола с уксусной, валериановой и др. кислотами (4-9%)

Приборы и реактивы

ГХ-МС с энергией ионизирующих электронов 70 эВ, квадрупольный анализатор, диапазон массовых чисел 39-450 а. е. м., температура источника ионов и переходных линий 200-250°C. Обработка данных на МС-станции с библиотечным поиском.

ГХ с пламенно-ионизационным детектором (ГХ-ПИД).

Подготовка образца

Эфирные масла извлекают общепринятыми методами: перегонкой с водяным паром, экстракцией органическими растворителями (ГФ IX, с. 328, ГФ XI, т. 1, с. 287). Суммарное количественное определение содержания эфирных масел проводят гравиметрическим методом.

Идентификация и количественное определение состава

Анализ выделенных эфирных масел проводят с помощью методов ГХ-ПИД и ГХ-МС с использованием двух колонок разной полярности. В случае ГХ-ПИД идентификацию проводят с использованием индексов Ковача (http://www.nysaes.cornell.edu/fst/faculty/acree/flavornet/OV101.html) при одинаковых условиях хроматографического разделения. Количественный анализ проводят с использованием метода внутреннего стандарта.

Условия хроматографического разделения (примеры)

1. ГХ-МС/ПИД: кварцевая капиллярная колонка длиной 30-50 м, внутренним диаметром 0,2-0,25 мм с неподвижной полиметилсилоксановой фазой толщиной пленки 0,2-0,3 мкм типа SE30 или SE54. Анализ проводят при программировании температуры: 60°C (5 мин) ->280°C, 5°/мин. Газ-носитель - гелий, давление на входе колонки 1-1,5 атм. Температура инжектора - 200-250°C, температура интерфейсной линии ГХ-МС-200°C.

2. ГХ-МС/ПИД: кварцевая капиллярная колонка длиной 30-50 м, внутренним диаметром 0,2-0,32 мм с неподвижной полиэтиленгликолевой фазой типа ПЭГ-20М или ФФАП толщиной пленки 0,2-0,3 мкм. Анализ проводят при программировании температуры: 50°C (5 мин) ->220°C, 5°C мин. Газ-носитель - гелий, давление на входе колонки 0,5-1,0 атм. Температура инжектора - 200-220°C, температура интерфейсной линии ГХ-МС - 200°C.

Примечание. Из БАД на основе плодов и ягод эфирные масла предпочтительно анализировать на полярных колонках, т.к. достигается лучшее разделение основных компонентов - смешанных сложных эфиров. Эфирные масла, выделенные из БАД на основе цитрусовых и хвойных растений, содержащие терпеновые компоненты, предпочтительнее разделять на колонках SE30 и SES4.

24. Определение содержания инулина в БАД

Метод основан на определении инулина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Приборы и реактивы

Жидкостной хроматограф с рефрактометрическим детектором

Смола Дауэкс 50x4, 200-400 меш. и Дауэкс 1 х 8,200-400 меш.

Стандартный раствор инулина 10 мг/см3: предварительно высушивают в сушильном шкафу при 105°C до постоянного веса в стеклянных бюксах.

Подготовка смол

Смолу Дауэкс 50 х 4, 200-400 меш последовательно промывают на бюхнеровской воронке большими объемами 2Н NaOH, дистиллированной водой, 3H HCI и опять водой. Избыток воды удаляют путем длительного отсасывания насосом. Готовят суспензию смолы в дистиллированной воде (1:1) и используют ее для заполнения колонки.

Ионнообменная способность для Дауэкса 50 х 4 в сухом виде составляет 5.1 мэкв/см3 и во влажном 1,7 мэкв/см3, соответственно.

Для работы нужна формиатная форма смолы. Последнюю готовят из смолы Дауэкс 1x8 (СГ-форма), пропуская через смолу на бюхнеровской воронке 3H формиат натрия до тех пор, пока проба на СГ не станет отрицательной (проба с азотнокислым серебром). После этого смолу промывают большими объемами дистиллированной воды и заполняют колонку.

Ионнообменная способность для Дауэкс 1x8 в сухом виде составляет 3,2 мэкв/см3 и во влажном виде - 1.4 мэкв/см3.

Проведение испытания

Подготовка пробы

Моно- и дисахара экстрагируют 80% этиловым спиртом с учетом естественной влаги. Навеску образца заливают в колбе в соотношении 1:4 по сухим веществам 96%-ным этанолом и необходимым количеством воды с расчетом, чтобы общая концентрация спирта была в пределах 80-82%. Колбу нагревают с обратным холодильником на водяной бане при 70-80°C в течение 15 мин. Затем спиртовую вытяжку отфильтровывают. Экстракцию повторяют в тех же условиях еще 3-4 раза. Спиртовые экстракты объединяют, спирт отгоняют на ротационном испарителе при температуре не выше 40°C. Предназначенные для определения экстракты нейтральных сахаров содержат также вещества, имеющие заряд (аминокислоты, пептиды и др.) Чтобы освободить нейтральные сахара от этих примесей, экстракты пропускают через колонку со смолой Дауэкс 50 х 4, непосредственно соединенную с колонкой, содержащей Дауэкс 1 х 8. С двух колонок собирают элюат и, если необходимо, его концентрируют на роторном испарителе. Чтобы в бане не поднимать высоко температуру, воду упаривают азеотропной отгонкой с этанолом. Сконцентрированный образец количественно переносят в мерную емкость, замеряют объем и хроматографируют.

Навеску исходного образца гидролизуют 2%-ным раствором щавелевой кислоты в течение часа при 100°C. В качестве контроля на полноту гидролиза параллельно гидролизуют раствор инулина. Полученный после гидролиза продукт пропускают через колонки выше описанным способом, после чего хроматографически определяют суммарное количество фруктозы с помощью ВЭЖХ.

Условия ВЭЖХ

Перед работой новую хроматографическую колонку с сепароном переводят на обратнофазный режим работы. Для этого колонку промывают 40 см3 изопропанола, затем 80 см3 деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной фазой до стабильной нулевой линии. Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (77:23). Смесь дегазируют на роторном испарителе. Детектирование - рефрактометрическое. Скорость потока 2,5 см3/мин.

Обработка результатов

От общего количества фруктозы вычитают фруктозу моно- и дисахаров и получают количество инулина и полифруктозидов. При расчете используют коэффициент 0,9, который учитывает присоединение воды при гидролизе. Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз.

Ошибка метода +-2%.

Качественный тест на инулин

Пробу обрабатывают 1-2 каплями 20% спиртового раствора нафтола и 1 каплей концентрированной серной кислоты. Наблюдают красно-фиолетовое окрашивание. При замене - нафтола резорцином и тимолом, соответственно, красное и розово-малиновое окрашивание.

25. Определение содержания аралозидов А, В, С в БАД, содержащих аралию маньчжурскую (Araliae elatae (Mig) Seem)

Приборы и реактивы

Приготовление пластин для ТСХ

6 г силикагеля КСК, предварительно промытого соляной кислотой и водой и высушенного, и 0,6 г сульфата кальция растирают в ступке, добавляют 17 см3 воды и выливают на пластинку 20 х 20 см. Сушат в течение суток на воздухе, активируют при 120-140°C 30-40 мин.

Стандартный раствор - 0,6% раствор сапарала в метиловом спирте.

Подготовка образца

1. 1 г измельченного образца кипятят с 20 см3 метилового спирта на водяной бане при 80-85°C с обратным холодильником в течение 1 ч, дают раствору отстояться.

2. 5 г измельченного образца помещают в аппарат сокслета с рабочим объемом 150-200 мл. В колбу-приемник наливают 250 мл метанола, 70 мл 50%-ного раствора серной кислоты и проводят экстракцию на кипящей водяной бане в течение 7 ч. Полученную в приемнике смесь разбавляют водой 1:1 и колбу охлаждают под струей холодной воды в течение 10 мин. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре водой, подсушивают на фильтре под вакуумом. Осадок количественно переносят 50 см3 горячей смеси метилового и изобутилового спиртов (1:1,5).

Качественный тест на аралозиды

20 мкл экстракта, полученного по п. 1., и 10 мкл стандартного раствора сапарала наносят на стартовую линию пластинки с силикагелем, хроматографируют в системе хлороформ-метиловый спирт - вода (61:32:7). Дают фронту растворителя подняться на 16-18 см, затем после высушивания пластинку опрыскивают 20% раствором серной кислоы и нагревают в сушильном шкафу при 105°C 10 мин. На пластинке должны проявиться три основных пятна вишневого цвета аралозидов, соответствующих по Rf аралозидам в сапарале.

Количественное суммарное определение аралозидов

Полученный по п. 2 раствор титруют потенциометрически 0,1М раствором едкого натра в смеси метилового спирта и бензола. При титровании отмечают количество титранта, израсходованного на доведение pH испытуемого раствора до 7,0.

Расчет суммарного содержания аралозидов в пересчете на аммонийную соль аралозидов А, В, С с усредненной молекулярной массой не менее 5% в % на сухое вещество расчитывают по формуле:

                  0,10422 x (V - V  - V ) x 100 x 100

                                  1    2

             X = -------------------------------------, где

                          M x (100 - W)

     0,10422 - количество аммонийных солей   аралозидов,  соответствующих

               1 см3 раствора едкого натра 0,1 М;

     V       - объем титранта, израсходованный на титрование пробы;

     V       - объем титранта, израсходованный на доведение pH до 7,0;

     V       - объем титранта, израсходованный на холостой опыт;

     W       - потеря при высушивании, %;

     0,2020  - коэффициент пересчета бихромата калия на гнафалозид А;

     1,03    - поправочный коэффициент на неполное элюирование гнафалозида

               А с сорбента;

     W       - потеря массы при высушивании, %.

26. Определение содержания экдистена в БАД, содержащих левзею сафлоровидную (Leuzea carthamoides (Willd.DC)

Приборы и реактивы

Приготовление пластин для ТСХ: сорбент состоит из смеси AI2O3 нейтральной и силикагеля, промытого последовательно 5Н соляной кислотой (15-20 ч) и водой и высушенного при 120°C 12 час. Для приготовления пластинок 9 г силикагеля и 3 г оксида алюминия растирают в ступке с 0,4 г сульфата кальция, постепенно прибавляя 25 см3 воды, массу перемешивают и выливают на пластинку 20 х 20 см, высушивают и активируют при 120°C 1 ч.

Спектрофотометр.

Раствор ГСО экдистена: 0,15 г ГСО экдистена (ВФС42-1713-87) помещают в мерную колбу на 25 см3 и доводят раствор до метки 95%-ным этанолом. 7 см3 полученного раствора переносят в мерную колбу на 25 см3 и объем доводят до метки 95% этанолом (раствор А).

Раствор ванилина в концентрированной серной кислоте.

Подготовка образца

15 г измельченного образца экстрагируют 180-200 см3 метилового спирта в аппарате Сокслета с рабочим объемом 150 см3 в течение 7 час (25-30 сливов). Экстракт концентрируют на ротационном испарителе при температуре 40°C до объема 5 см3, количественно переносят в мерную колбу на 25 см3, доводят объем метанолом до метки (раствор Б). На пластинку, разделенную на 5 зон, с помощью микрошприца или стеклянного капилляра наносят в виде полос 20 х 3 мм 150 мкл раствора Б и 150 мкл стандартного раствора экдистена (раствор А) - на 4 зоны, пятая зона остается пустой (для раствора сравнения). Пластинку помещают в хроматографическую камеру и элюируют в смеси метанол-хлороформ-ацетон (2:6:1). Дают фронту растворителя подняться на 16-18 см. После высушивания пластинки две зоны опрыскивают раствором ванилина, отмечают полосу стандарта и собирают сорбент из необработанных зон стандарта и образца. Вещества смывают с силикагеля 15 мл метанола в течение 4 час.

Проведение анализа

Спектрофотометричекое количественное определение экдистена

Измеряют оптическую плотность растворов стандарта и образца относительно раствора "холостого опыта" при длине волны 242 нм в кюветах 10 мм. Содержание экдистена в сырье должно быть не менее 0,1%.

Качественный тест на инулин

Сухой порошок обрабатывают 1-2 каплями 20% спиртового раствора нафтола и 1 каплей концентрированной серной кислоты. Наблюдают красно-фиолетовое окрашивание. При замене нафтола резорцином и тимолом наблюдают, соответственно, красное и розово-малиновое окрашивание.

27. Определение содержания четвертичных аммонийных оснований (глицинбетаин) в БАД, содержащих солянку холмовую (Salsola collina PALL)

Приборы и реактивы

Спектрофотометр.

ВЭЖХ с УФ-детектором.

5% раствор соли Рейнеке (1,25 г соли Рейнеке, перекристаллизованной из воды и высушенной при 60°C, растворяют при перемешивании в 25 см3 дистиллированной воды, нагретой до 60°C).

Подготовка образца

1. 2-3 г измельченного продукта эктрагируют в Сокслете 200 см3 70% этилового спирта в течение 2-2,5 ч. Экстракт фильтруют и упаривают досуха, остаток растворяют в 10 см3 1М HCl, фильтруют через бумажный фильтр, промывают 1 М HCl.

Получение производного глицинбетаина для ВЭЖХ: р-бромфенациловый эфир глицинбетаина

2. Экстракт переносят в мерную колбу на 200 см3 и доводят объем 70% этанолом. 1,25 см3 этого экстракта переносят в реакционную пробирку с пробкой на 10 см3 и растворитель упаривают досуха в токе воздуха при нагревании 80-90°C. В пробирку добавляют 0,25 см3 40% раствора ацетонитрила, содержащего 10 мМ КН2РО4, 10 мМ КНСОз, 5мМ 18-краун-6 эфира и после встряхивания добавляют 1,0 см3 раствора р-бромфенацилбромида (15 мг/см3) в ацетонитриле. После инкубации 30 мин. при 80°C пробирку охлаждают и добавляют по 2,5 см3 0,1Н раствора серной кислоты и хлороформа. Пробирку встряхивают и центрифугируют 3 мин. Отбирают водную фазу.

Количественное определение четвертичных оснований с помощью метода спектрофотометрии

К фильтрату, полученному по п. 1., добавляют при перемешивании 5 см3 горячего 5% раствора соли Рейнеке. Через 1 ч выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре 20 см3 эфира, переносят в стаканчик и растворяют в 15 см3 ацетона. Раствор фильтруют в мерную колбу на 25 см3, добавляют 7,5 см3 воды, доводят до метки ацетоном. Определяют оптическую плотность раствора при 520 нм. Раствор сравнения ацетон-вода (7:3).

Расчет содержания четвертичных оснований в пересчете на глицинбетаин, %, проводят по формуле:

                              D x 153 x V

                         Х = ---------------, где

                              10 х 118 х a

     D   - оптическая плотность раствора,

     153 - молекулярная масса глицинбетаинхлорида,

     118 - коэффициент молярного поглощения рейнеката  глицинбетаина  при

           520 нм,

     а   - навеска травы,

     V   - объем пробы.

Количественное определение четвертичных оснований с помощью метода ВЭЖХ

Условия хроматографии: сорбент: а) катионообменный (Nucleosil-50,SA) или б) ионно-парный (Silasorb-5,C18), размеры колонки 2 х 64 мм, подвижная фаза - раствор додецилсульфоната натрия, скорость потока 0,1 мл/мин. Детектор УФ-210 нм.

В хроматограф вводят 5 мл водной фазы (п. 2). Расчет - по производному глицинбетаина. Время выхода р-бромфенацилового эфира глицинбетаина - 6 мин.

28. Определение содержания гексозаминов

Для определения гексозаминов используют колориметрический медод Элсона и Моргана. (Biochem.J., 27. 1824 (1933). Метод основан на конденсации аминосахара с щелочным ацетилацетоном с образованием 2-метил-3-ацетилпиррола и 2-метилпиррола; в присутствии реактива Эрлиха (4-диметиламинобензальдегида) 2-метилпиррол является основным хромогеном. Образование этих хромогенов сопровождается появлением красновато-розоватой окраски. В реакции этого типа глюкозамин и галактозамин дают одинаковую окраску с одинаковой величиной молярной экстинкции. Взаимодействие между сахарами и аминокислотами мешает определению, поэтому гексозамины отделяют от аминокислот на ионообменной колонке.

Если гексозамины находятся в связанном виде, то их отделяют путем гидролиза в 4Н соляной кислоте при 100°C в течение 4 часов в запаянных ампулах под азотом.

Выделение фракции гексозаминов и отделение их от нейтральных сахаров, аминокислот и пептидов осуществляют хроматографией на смоле Дауэкс 50 х 4 (200-400 меш, Н(+)-форма). Смолу последовательно промывают на бюхнеровской воронке большими объемами 2Н NaOH, дистиллированной водой, 3H HCI и опять водой. Избыток влаги удаляют путем длительного отсасывания насосом. Готовят суспензию промытой смолы в дистиллированной воде (1:1) и используют ее для заполнения хроматографических колонок.

Перед нанесением на колонку образец освобождают от соляной кислоты. Для этого его помещают в вакуумный эксикатор с NaOH. Для защиты от кислоты насос снабжают ловушкой с негашеной известью. Используют хроматографическую колонку с внутренним диаметром 10 мм (можно использовать в качестве колонки пластмассовый шприц). На дно колонки помещают маленький фильтр из стеклянной ваты, сверху наливают 5 см3 суспепзии и дают ей осесть. После того, как образец проникнет в смолу, колонку промывают четырьмя порциями по 5 см3 дистиллированной воды. Гексозамины элюируют 5-10 см3 2Н HCI. Элюат освобождают от кислоты указанным выше способом, и в остатке сразу определяют количество гексозаминов колориметрическим методом.

Реактивы

Приготовление щелочного раствора ацетилацетона.

2,4-пентандион (ацетилацетон) должен быть бесцветным. Его накануне перегоняют и хранят в темной посуде при 4°C. Непосредственно перед использованием 2 мл ацетилацетона растворяют в 98 см3 1 М Na2CCh

Реактив Эрлиха 2,7%-ный (вес/объем) раствор 4-диметиламинобензальдегида в смеси этанол-концентрированная HCI (1:1, по объему). Этот реактив следует готовить в день определения.

Проведение анализа

В пробирках со стеклянными пробками смешивают 1 см3 раствора гексозамина (5-30 мкг) с 1 см3 раствора щелочного ацетилацетона. Пробы нагревают в течение 45 мин при 100°C и затем охлаждают водопроводной водой. Добавляют 4 см3 (95%-ного этанола и тщательно перемешивают, а затем добавляют 1 см3 реактива Эрлиха и опять интенсивно перемешивают. На последнем этапе следует периодически выпускать образующийся СОг, приоткрывая пробку несколько раз во время перемешивания. Пробирки оставляют на 1 ч при комнатной температуре и затем определяют оптическую плотность раствора при 530 нм. Параллельно проводят обработку стандартных и слепых проб.

29. Определение содержания гуминовых кислот и глицина в мумие

Методика основана на гравиметрическом определении содержания гуминовых кислот, экстрагированных из продукта щелочным раствором. Глицин идентифицируют в кислотном гидролизате методом ТСХ при обнаружении пятен аминокислот обработкой нингидроновым реагентом.

Приборы и реактивы

Спектрофотометр.

1% раствор NaOH.

6Н, 0,5Н растворы HCl.

0,3% раствор нингидрина в н-бутаноле.

Уксусная кислота концентрированная.

25% раствор аммиака.

Раствор глицина в 0,5 н HCl - 2 мг/см3.

Подготовка образца

К 2 г образца добавляют 25 см3 1% раствора NaOH и нагревают в колбе с обратным холодильником в течение 2-2,5 ч на кипящей водяной бане. Экстракт фильтруют или центрифугируют при 3000 об./мин., остаток снова обрабатывают 10 см3 раствора щелочи. Объединенные экстракты фильтруют или центрифугируют, фильтрат подкисляют 5% HCl до pH 3-4, колбу с выпавшим осадком помещают на 30-60 мин в холодильник, далее взвесь переносят в ц/ф пробирку с известным весом, центрифугируют, осадок промывают водой, снова центрифугируют, супернатант отделяют, а осадок высушивают при температуре 105°C до постоянного веса. В образце определяют содержание золы, прокалив его при температуре 350°C в течение 5-6 ч. Содержание беззольных гуминовых кислот рассчитывают по разнице массы гуминовых кислот и золы. Записывают спектры раствора гуминовых кислот с концентрацией 2 мг/см3 в 0,1Н NaOH в области длин волн 465-730 нм. Раствор гуминовых кислот мумие характеризуется максимами с убывающей интенсивностью при 726, 665, 620, 575, 530, 500, 465 нм.

200 мг образца помещают в запаяную стеклянную ампулу, добавляют 10 см3 6Н HCl и проводят гидролиз при 100-105°C в течение 24 ч; далее кислоту упаривают досуха. Остаток растворяют в 0,5Н HCl.

Идентификация глицина

На стартовую линию пластины Силуфол наносят по 2-3 мкл растворов образца и глицина и помещают в хроматографическую камеру, содержащую смесь бутанола, уксусной кислоты и воды, взятых в объемом соотношении 4:1:1. Дают растворителю поднятся на 10 см, пластинку вынимают, сушат от растворителя и опрыскивают 0.3% раствором нингидрина. Помещают пластину на 5-10 мин в термостат при 105°C. Глицин обнаруживают в виде красного пятна с Rf 0,5.

<< Глава 2. Методы определения микронутриентов		Глава 4. >> Методы определения пищевых добавок в составе БАД
	Содержание Руководство Р 4.1.1672-03 "Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище" (утв....

Глава 3. Минорные биологически активные компоненты БАД (методы определения подлинности БАД

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас