Методические рекомендации МР 1.2.0052-11 "Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 29 декабря 2011 г.)

Методические рекомендации МР 1.2.0052-11
"Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 29 декабря 2011 г.)

Введены в действие 29 декабря 2011 г.

Введены впервые

I. Область применения

1.1. Настоящие методические рекомендации определяют порядок и методы оценки безопасности искусственных наноматериалов по их воздействию на функцию иммунитета.

1.2. Настоящие методические рекомендации могут применяться:

- при оценке безопасности разрабатываемых новых и уже используемых наноматериалов;

- при оценке рисков, связанных с процессами производства, оборота, использования и утилизации наноматериалов;

- в процессе проведения экспертизы продукции сельского хозяйства, пищевых продуктов, фармацевтической промышленности, биотехнологического производства, содержащих наночастицы и наноматериалы;

- при проведении мероприятий по осуществлению надзора (контроля) в процессе производства, переработки и утилизации искусственных наноматериалов.

1.3. Методические рекомендации разработаны с целью обеспечения единства измерений и представления результатов при оценке воздействия наноматериалов на функцию иммунитета.

1.4. Методические рекомендации предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями и иными организациями и учреждениями, проводящими исследования по оценке безопасности наноматериалов и продукции наноиндустрии.

II. Введение

В связи с расширением использования нанотехнологий в различных отраслях промышленности, наночастицы и наноматериалы могут содержаться в значимых количествах в объектах окружающей среды (атмосферный воздух, вода, почва), продовольственном сырье и пищевых продуктах. Ввиду этого, оценка риска, связанного с их воздействием на организм, представляет собой важную задачу, решаемую в ходе осуществления санитарно-эпидемиологического надзора.

Одним из важнейших этапов оценки риска является характеристика опасности, то есть количественное определение степени воздействия опасного фактора (в данном случае наноматериалов) на наиболее чувствительные органы и системы. В их числе, согласно имеющимся в настоящее время данным, одно из ведущих мест принадлежит иммунной системе. Это связано, во-первых, с тем, что клетки иммунной системы принадлежат к числу наиболее быстро дифференцируемых и обновляемых клеток организма, в них с высокой эффективностью протекают процессы митоза, биосинтеза ДНК и других биополимеров. Ввиду наличия у наночастиц многих типов способности проникать через биологические мембраны в клетки и взаимодействовать с биополимерами, нормальная функция иммунных клеток должна рассматриваться как одна из наиболее чувствительных к повреждающему действию этих факторов. Аналогией повреждающего действия наноматериалов на генетический аппарат клетки и биосинтетические процессы является в данном случае действие ионизирующей радиации, как известно, повреждающей также, в первую очередь, клетки иммунной системы.

В рамках Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии на 2008-2011 гг." был разработан и утвержден в установленном порядке Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ряд методических документов, включающих порядок и методы тестирования эффектов наночастиц и наноматериалов в биологических системах различного уровня организации (МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов"; МУ 1.2.2634-10 "Микробиологическая и молекулярно генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза"; МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов"; МУ 1.2.2741-10 "Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных"; МУ 1.2.2745-10 "Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных"; МУ 1.2.2869-11 "Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных"; МУ 1.2.2874-11 "Порядок выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных"; МР 1.2.2522-09 "Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека"; МР 1.2.2566-09 "Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo"). Рассматриваемый комплекс методик позволяет проводить оценку безопасности наночастиц и наноматериалов на иерархически организованной системе биологических объектов in vitro и in vivo, включая культуры микроорганизмов, клеточные культуры, гидробионты (беспозвоночные и рыбы), высшие растения, организмы лабораторных животных с использованием комплекса морфологических, биохимических, токсикологических, микробиологических, физиологических и иных методов. Вместе с тем, вопрос об учёте в рамках указанной методологии воздействия наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета сохраняет свою актуальность.

В настоящих методических рекомендациях представлены методические подходы к оценке воздействия наночастиц и наноматериалов, в первую очередь, на клеточное звено иммунитета (пролиферация иммунокомпетентных клеток, их функциональные характеристики), а также на гуморальное звено иммунитета, оцениваемое по продукции специфических антител. Изучение перечисленных показателей осуществляется на модели экспериментальных животных, которым вводили наноматериалы, принципиально в двух возможных режимах: а) in vivo, когда количественно оцениваются параметры системы иммунитета непосредствено в организме экспонированных лабораторных животных, и б) ex vivo, когда лабораторные тесты проводятся в строго контролируемых условиях, в культурах клеток, полученных от животных, которым предварительно вводили наноматериалыи по определённой схеме. В качестве экспериментальных моделей предлагается использование как предварительно иммунизированных посторонним (по отношению к тестируемым наноматериалам) антигеном, так и не иммунизированных животных.

III. Нормативные ссылки

3.1. Федеральный закон от 30 марта 1999 года N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

3.2. Федеральный закон от 2 января 2000 года N 29-ФЗ "О качестве и безопасности пищевых продуктов".

3.3. Федеральный закон от 26 июня 2008 года N 102-ФЗ "Об обеспечении единства измерений"

3.4. Федеральный закон от 27 декабря 2002 года N 184-ФЗ "О техническом регулировании".

3.5. Федеральный закон от 10 января 2002 года N 7-ФЗ "Об охране окружающей среды".

3.6. Постановление Правительства Российской Федерации от 30 июня 2004 года N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека".

3.7. Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 года N 987 "О государственном надзоре и контроле в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов".

3.8. Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 года N 988 "О государственной регистрации новых пищевых продуктов, материалов и изделий".

3.9. Постановление Правительства Российской Федерации от 2 февраля 2006 года N 60 "Об утверждении Положения о проведении социально-гигиенического мониторинга".

3.10. Постановление Правительства Российской Федерации от 15 сентября 2005 года N 569 "О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации".

3.11. Приказ Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 года N 755 "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных".

3.12. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. N 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики".

3.13. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 23 июля 2007 года N 54 "О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащих наноматериалы".

3.14. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 года N 79 "Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов".

3.15. СП 2.2.2.1327-03 "Гигиенические требования к организации технологических процессов, производственному оборудованию и рабочему инструменту".

3.16. МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

3.17. МУ 1.2.2636-10 "Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции, полученной с использованием нанотехнологий и наноматериалов".

3.18. МУ 1.2.2741-10 "Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных".

3.19. МУ 1.2.2745-10 "Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных".

3.20. МУ 1.2.2874-11 "Порядок выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных".

3.21. МУ 1.2.2634-10 "Микробиологическая и молекулярно генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза".

3.22. МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов".

3.23. МУ 1.2.2869-11 "Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных"

3.24. МУК 4.2.2429-08 "Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах".

3.25. МР 1.2.2522-09 "Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека".

3.26. МР 1.2.2566-09 "Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo".

3.27. МР 1.2.0022-11 "Порядок отбора проб для контроля за наноматериалами".

3.28. МР 1.2.0023-11 "Контроль наноматериалов в пищевой продукции".

3.29. МР 1.2.0024-11 "Контроль наноматериалов, применяемых в химической промышленности".

3.30. МР 1.2. 2641-10 "Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах".

3.31. ГОСТ 25336-82 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

3.32. ГОСТ 26678-85 "Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия".

3.33. ГОСТ Р 51652-2000 "Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия".

3.34. ГОСТ 24104-2001 "Весы лабораторные. Общие технические требования".

3.35. ГОСТ 1770-74 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

3.36. ГОСТ 27987-88 "Анализаторы жидкости потенциометрические ГСП. Общие технические условия".

3.37. ГОСТ 24861-91 "Шприцы инъекционные однократного применения".

3.38. ГОСТ 3-88 "Перчатки хирургические резиновые. Технические условия".

3.39. ГОСТ 4328-77 "Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия".

3.40. ГОСТ 4198-75 "Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия".

3.41. ГОСТ 4233-77 "Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

3.42. ГОСТ 4172-76 "Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия".

3.43. ГОСТ 25336-82 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

3.44. ГОСТ 6709-72 "Вода дистиллированная. Технические условия".

3.45. ГОСТ 2493-75 "Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия".

3.46. ГОСТ 4204-77 "Реактивы. Кислота серная. Технические условия".

3.47. ГОСТ 4201-79 "Haтpий углекиcлый киcлый. Tеxничеcкие уcлoвия".

3.48. ГОСТ 11293-89 "Желатин. Технические условия".

3.49. ГОСТ 908-2004 "Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия".

3.50. ГОСТ 22280-76 "Реактивы. Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия".

3.51. ГОСТ 3773-72 "Реактивы. Аммоний хлористый. Технические условия".

3.52. ГОСТ 245-75 "Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия".

3.53. ГОСТ 2263-79 "Натр едкий технический".

3.54. ГОСТ 3118-77 "Реактивы. Кислота соляная. Технические условия".

3.55. ГОСТ 17299-78 "Спирт этиловый технический. Технические условия".

3.56. ГОСТ 7.32-2001 "Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления".

3.57. ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 "Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий".

IV. Общие положения

4.1. Целью оценки воздействия наноматериалов искусственного происхождения на функцию иммунитета является:

- выявление процессов иммунной защиты организма, являющихся мишенями токсического действия наночастиц и наноматериалов;

- установление зависимости доза-эффект, возможных эффектов кумуляции наночастиц в организмах животных по показателям воздействия на функцию иммунитета;

- токсиколого-гигиеническая и медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов и продукции, их содержащей;

- гигиеническое нормирование содержания наноматериалов в объектах окружающей среды и потребительской продукции;

- экспертиза наночастиц и наноматериалов, производимых на территории Российской Федерации или ввозимых на территорию Российской Федерации;

- оценка риска для здоровья населения при поступлении наноматериалов в организм с пищей, водой, атмосферным воздухом и иными путями;

- разработка мероприятий по охране здоровья населения и окружающей среды от воздействия наночастиц и наноматериалов.

4.2. Оценка воздействия наноматериалов на показатели системы иммунитета проводится в экспериментах in vivo, при путях поступления наночастиц и наноматериалов, максимально приближенных к условиям экспонирования ими через объекты окружающей среды в обстановке реального воздействия, а также в системах ex vivo, включающих тестирование в культуре клеток, полученных от животных, которым вводили наноматериалы.

4.3. Объектами оценки воздействия наноматериалов на систему иммунитета являются состав и численная характеристика популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток, их функциональные характеристики в базальных условиях и при антигенной и неспецифической стимуляции, показатели апоптоза, уровни гуморальных факторов иммунитета (цитокинов, антител).

4.4. Выбор биологического объекта воздействия наночастиц и наноматериалов (вида, линии лабораторных животных), принципы выбора действующих доз, пути, длительность и кратность введения наночастиц и наноматериалов, состав опытных и контрольных групп тестируемых организмов устанавливаются для отдельных тест-систем в соответствии с МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов", МР 1.2.2566-09 "Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo", МУ 1.2.2634-10 "Микробиологическая и молекулярно генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза", МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов", МУ 1.2.2869-11 "Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных".

4.5. При выборе наноматериалов, являющихся объектами оценки токсического действия на иммунную систему, необходимо принимать во внимание:

- возможность экспозиции работников нанотехнологических производств, потребителей продукции наноиндустрии и населения в целом наночастицами и наноматериалами на данной территории, в условиях промышленного производства или при потреблении продукции определённого типа;

- данные литературы из источников, отвечающих критериям научной полноты и достоверности о наличии у тестируемых наноматериалов и их близких аналогов цитотоксических, генотоксических, мутагенных, иммунотоксических свойств;

- степень потенциальной опасности наноматериалов для здоровья человека в соответствии с МР 1.2.2522-09 "Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека".

4.6. Лаборатория (организация), проводящая исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должна быть аккредитована на проведение работ в соответствующей области. В лаборатории должны соблюдаться правила надлежащей лабораторной практики в соответствии с приказом Министерства здравоохранения и социально развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года N 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики".

4.7. В организации (лаборатории), проводящей исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должна быть разработана программа по обеспечению качества проводимых исследований. Все производственные операции проводятся в соответствии со Стандартными операционными процедурами (СОП), осуществляемыми в целях обеспечения качества, достоверности и воспроизводимости результатов исследования.

4.8. Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должны быть укомплектованы необходимым оборудованием и средствами измерений, прошедшими поверку (калибровку) в установленном порядке. Эксплуатация оборудования и средств измерений проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения поверки (калибровки) и текущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание. Применяются средства измерений, имеющие сертификат и зарегистрированные в Государственном реестре средств измерений.

4.9. Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должны иметь помещения для содержания и работы с лабораторными животными (виварии, клиники лабораторных животных), требования к которым изложены в МУ 1.2.2869-11 "Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных".

4.10. Организации (лаборатории) проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должны иметь условия для работы с биологическим материалом, включая культуры иммунокомпетентных клеток, чистые боксированные помещения, ламинарные шкафы с горизонтальным потоком воздуха, обеспечивающих длительную экспозицию облучения внутренних поверхностей ультрафиолетовым светом.

4.11. Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должны иметь оборудование, обеспечивающее безопасность работы с наноматериалами неорганического и биогенного происхождения: ламинарные вытяжные шкафы, перчаточные боксы, снабжённые системой вентиляции (НЕРА-фильтры), препятствующие поступлению аэрозоля наноматериалов в воздух производственных помещений и в окружающую среду.

4.12. Документом, подтверждающим результаты проведённых исследований по влиянию наноматериалов на функцию иммунитета, является отчёт о проведённом исследовании. Отчет содержит следующие сведения:

- название исследования;

- адрес организации;

- даты начала и завершения исследований;

- цель и задачи исследования;

- характеристика тестируемых наночастиц и наноматериалов (химический состав, CAS-номер, средний, минимальный и максимальный размер частиц, форма частиц, наличие примесей, состав дисперсионной среды (носителя) в соответствии с МУ 1.2.2636-10 "Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции, полученной с использованием нанотехнологий и наноматериалов");

- применяемая биологическая модель и обоснование её использования;

- перечень исследованных биологических образцов и применяемых стандартных образцов;

- вид, линию, пол и возраст используемых лабораторных животных;

- состав применяемых рационов, условия содержания животных;

- метод введения наночастиц/наноматериалов, применяемые дозы, длительность и кратность введения;

- план (дизайн) исследования;

- перечень использованных средств измерений и вспомогательного оборудования и режимы их работы;

- методы статистической обработки результатов;

- результаты исследования, представленные в виде обобщающих таблиц, рисунков с соответствующей статистической обработкой и комментариев к ним;

- заключение; выводы; список использованных источников.

Оформление отчёта о результатах исследования должно соответствовать требованиям ГОСТ 7.32-2001 "Отчёт о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления".

Отчет о результатах проведенного исследования составляется ответственным исполнителем, утверждается руководителем организации и скрепляется печатью организации.

4.13. Организация (лаборатория), проводящая исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должна обеспечить конфиденциальность результатов исследований в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации.

V. Порядок оценки воздействия искусственных наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета у иммунизированных животных

5.1. Модель оценки функции иммунитета у крыс, иммунизированных белковым антигеном

5.1.1. Тестирование проводят на шести группах крыс самцов линии Вистар или линии Спрейг-Доули исходной массой 100-120 г (группы N N 1-6). Численность групп животных составляет не менее 10 особей. Животные всех групп на протяжении всего периода тестирования получают полусинтетический рацион в соответствии с МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов". Крыс размещают в клетках из ударопрочной пластмассы группами по 3-4 особи; рацион и питьевую воду предоставляют в режиме свободного неограниченного доступа.

Примечание: возможно использование при проведении тестирования крыс других линий, а также нелинейных животных. Используемые схемы иммунизации при этом должны быть модифицированы в соответствии с индивидуальными особенностями иммунного реагирования у этих животных.

5.1.2. Тестируемые наночастицы и наноматериалы диспергируют в дистиллированной воде и дополнительно обрабатывают ультразвуком (частота 44 кГц, время и мощность обработки устанавливаются опытным путём) во избежание процессов агрегации. При необходимости степень диспергирования наноматериала проверяют методом электронной микроскопии согласно МР 1.2.2641-10 "Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах". Дисперсию наночастиц вводят ежедневно внутрижелудочно (в/ж) через зонд на протяжении 28 дней.

5.1.3. Иммунизацию крыс осуществляют к парентерально вводимому модельному белковому антигену - овальбумину куриного яйца (ОВА). ОВА представляет собой фосфопротеид, состоящий из одной аминокислотной цепи, имеющий молекулярную массу 44 кД. Данный белок высоко иммуногенен для большинства видов млекопитающих. В целях повышения интенсивности иммунного ответа используют адъювант - свежеосаждённый гидроксид алюминия.

Иммунизацию осуществляют по следующей схеме. На 1-й, 3-й и 5-й день опыта крысам внутрибрюшинно (в/б) вводят дозу 100 мкг ОВА, адсорбированного на 10 мг гидроксида алюминия в 0,2 физиологического раствора. На 21-й день опыта вводят дополнительно еще 10 мкг ОВА в тех же условиях для индукции вторичного иммунного ответа.

5.1.4. Взятие биологического материала (цельная кровь, сыворотке крови) осуществляют на 29-ый день тестирования в три пробирки, из которых одна обработана для предотвращения свёртываемости крови 1,6 мг трикалиевой соли ЭДТА, а другая - 100 1% раствора гепарина путём взятия крови из нижней полой вены под глубокой эфирной анестезией.

5.1.5. План (дизайн) тестирования рекомендуется составлять в соответствии с данными, представленными в таблице 1.

Таблица 1

Типовой дизайн лабораторного теста по влиянию наночастиц на показатели системы иммунитета у иммунизированных ОВА крыс

NN п/п групп	Обозначение групп	Число крыс	Сенсибилизация	Внутрижелудочное введение препаратов
1	Контроль	10	Не сенсибилизированные	В/ж введение дистиллированной воды в дозе 10 на кг массы тела с 1-го по 28-ой дни опыта
2	Сенсибилизация	10	В/б сенсибилизация овальбумином на на 1,3,5 и 21-ый дни опыта	В/ж введение дистиллированной воды 10 на кг массы тела с 1-го по 28-ой дни опыта
3	Введение наночастиц, доза "А"	10	Не сенсибилизированные	В/ж введение дисперсии наночастиц в дистиллированной воде в дозе "А" с 1-го по 28-ой дни опыта
4	Введение наночастиц, доза "Б"	10	Не сенсибилизированные	В/ж введение дисперсии наночастиц в дистиллированной воде в дозе "Б" с 1-го по 28-ой дни опыта
5	Сенсибилизация + наночастицы, доза "А"	10	В/б сенсибилизация овальбумином на на 1,3,5 и 21-ый дни опыта	В/ж введение дисперсии наночастиц в дистиллированной воде в дозе "А" с 1-го по 28-ой дни опыта
6	Сенсибилизация + наночастицы, доза "Б"	10	В/б сенсибилизация овальбумином на на 1,3,5 и 21-ый дни опыта	В/ж введение дисперсии наночастиц в дистиллированной воде в дозе "Б" с 1-го по 28-ой дни опыта

Примечание: 1) величину дозы "А" наноматериала устанавливают на основе анализа возможных сценариев пероральной экспозиции наноматериалом человека в условиях контаминации пищевых продуктов и воды отходами деятельности нанотехнологических производств и (или) возможного поступления наноматериала, входящего в состав потребительской продукции с учётом возможной неопределённости и 10-кратного коэффициента запаса, определяемого биологической природой используемой модели (тестирование на грызунах); 2) доза "Б" является 10-100-кратно агравированной (увеличенной) в сравнении с дозой "А"; 3) при выборе доз наноматериала следует учитывать данные о его собственных токсических свойствах () - при наличии таковых.

5.1.6. Антиген для сенсибилизации готовят в соответствии со следующей прописью.

Готовят следующие растворы.

1) 20 или 2 мг ОВА (5-кратно перекристаллизованный препарат производства "Sigma-Aldrich" (США) или аналогичный) в 1 стерильного апирогенного физиологического раствора (0,15 М NaCl) по ГФ СССР, Х, 426.

2) 10% по массе алюмокалиевые квасцы х.ч. в дистиллированной воде "для инъекций".

3) 4% по массе (1М) гидроксид натрия х.ч. в дистиллированной воде "для инъекций".

Все растворы фильтруют через мембранные фильтры с размером пор 0,2 мкм для удаления пыли и бактерий.

В стерильном стеклянном флаконе смешивают 1 раствора 1,1 раствора 2 и добавляли по каплям 0,6 раствора 3. Смесь перемешивают и оставляют на 5 минут, после чего переносят в центрифужную пробирку объёмом 10 . Отмывают образовавшийся осадок троекратно объёмами по 10 стерильного апирогенного физиологического раствора; после каждой отмывки осадок седиментируют центрифугированием при ускорении 3000 g в настольной лабораторной центрифуге с охлаждением в течение 5 минут. Окончательно осадок диспергируют в 40 стерильного апирогенного физиологического раствора. Полученную смесь вводят крысам. Препарат антигена годен к использованию в течение не более 48 часов.

Примечание: перед использованием дисперсию антигена необходимо взбалтывать.

5.2. Определение гуморального иммунного ответа по специфическим антителам класса IgG у крыс

Интенсивность гуморального иммунного ответа оценивают по концентрации циркулирующих специфических IgG антител с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного теста на полистироле.

5.2.1. Оборудование

- Фотометр планшетный автоматический "ЭФОС 9305" (производства "ОАО МЗ Сапфир", Россия) с интерференционными светофильтрами на длину волны 492 и 620 нм или иной другой прибор с аналогичными параметрами;

- воздушный термостат на температуру +37°С;

- водяная баня на температуру +37°С;

- лабораторный настольный встряхиватель;

- устройство для отмывки лунок иммуноферментных планшет на 8 каналов;

- весы аналитические лабораторные электронные с верхним пределом взвешивания 120 г 2-го класса точности _0,1 мг с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104-2001;

- весы технические лабораторные электронные с верхним пределом взвешивания 120 г и ценой деления 0,01 г по ГОСТ 24104-2001;

- иономер универсальный со стеклянным электродом для измерения рН водных растворов; погрешность измерения ед. рН по ГОСТ 27987-88;

- секундомер;

- пипетка полуавтоматическая 8-канальная регулируемая на объем 20-200 с наконечниками;

- пипетки полуавтоматические 1-канальные на объемы 0-20; 20-200 и 200-1000 с наконечниками;

- дистиллятор лабораторный;

- магнитная мешалка;

- колбы мерные наливные на объемы 500, 1000 и 2000 по ГОСТ 1770-74;

- цилиндры мерные на 25,50,100 по ГОСТ 1770-74;

- стаканы стеклянные на 500 и 1000 ;

- шприц на объем 2 по ГОСТ 24861-91.

5.2.2. Материалы и реактивы

- Овальбумин куриного яйца (ОВА), 5-кратно перекристаллизованный, производства "Sigma-Aldrich" (Германия) или другой с аналогичными параметрами;

- кроличьи моноспецифические антитела против IgG крысы, меченные пероксидазой, лиофилизованные производства НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России или аналогичные;

- нормальная лошадиная сыворотка (НЛС);

- фосфат калия однозамещенный, х.ч. по ГОСТ 4198-75;

- фосфат калия двузамещенный трехводный, квалификации х.ч. по ГОСТ 2493-75;

- хлорид натрия, х.ч. по ГОСТ 4233-77;

- лимонная кислота х.ч. по ГОСТ 908-2004;

- фосфат натрия двузамещенный 12-водный, х.ч. по ГОСТ 4172-76;

- кислота серная d = 1,84 квалификации х.ч.по ГОСТ 4204-77;

- гидроксид натрия х.ч. по ГОСТ 4328-77;

- натрий двууглекислый безводный х.ч. по ГОСТ 4201-79;

- твин-20 (полиоксиэтиленсорбитан монолаурат) производства "Sigma-Aldrich", Германия или другой с аналогичными параметрами;

- орто-фенилендиамин градации "Analytical grade";

- перекись водорода "медицинская" 33% по ТУ 6-02-570-75;

- желатин ("пищевая марки П-11") по ГОСТ 11293-89;

- планшеты полистирольные разборные плоскодонные со "средней" степенью связывания.

5.2.3. Приготовление рабочих растворов

Буфер для иммобилизации антигенов. Навеску 4 г гидроксида натрия х.ч. переносят в мерную колбу на 100 , растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Навеску 8,4 г натрия двууглекислого помещают в стакан на 1000 , растворяют в 800-900 дистиллированной воды на магнитной мешалке. Добавляют раствор гидроксида натрия при перемешивании под контролем иономера до достижения рН . Смесь количественно переносят в мерную колбу на 1000 и доводят водой до метки.

Фосфатно-солевой буфер (ФСБ). Навеску 68 г калия фосфата однозамещенного переносят в мерную колбу на 500 , растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Навеску 228 г калия фосфата двузамещенного трехводного переносят в мерную колбу на 1000 , растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Полученные растворы смешивают под контролем иономера до достижения величины . Навеску 180 г натрия хлорида переносят в мерную колбу на 1000 , растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. В мерную колбу на 2000 вносят мерным цилиндром 20 смеси раствора фосфатов и 100 раствора натрия хлорида и доводят дистиллированной водой до метки.

Раствор Твин-ФСБ. В мерную колбу на 2000 вносят с помощью шприца 2 Твин-20 и доводят ФСБ до метки.

Раствор НЛС- ФСБ. 100 ФСБ смешивают с 1 нормальной лошадиной сыворотки.

Блокирующий реагент. 0,2 г желатины смешивают с 20 ФСБ, оставляют на 16 ч в холодильнике, после чего нагревают при +37°С на водяной бане до полного растворения.

Субстратный буфер. В стакан на 1000 вносят навески 26,3 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного и 5,6 г лимонной кислоты тригидрата. Растворяют на магнитной мешалке в 800-900 дистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу на 1000 , доводят до метки и проверяют рН, который должен составлять .

Раствор субстрата (готовится непосредственно перед употреблением). Навеску мг орто-фенилендиамина растворяют при нагревании до 40-50°С в 15 субстратного буфера и непосредственно перед нанесением на планшету вносят 40 33% перекиси водорода, разведенной 1:1 дистиллированной водой.

Останавливающий реагент (фиксатор). В мерную колбу на 1000 вносят 900-950 дистиллированной воды и отмеряют цилиндром 28 серной кислоты. Раствор перемешивают, охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до метки.

5.2.4. Проведение анализа

В лунки полистирольных планшет вносят по 1,0 мкг ОВА в 100 0,1 М Na-бикарбонатного буфера рН и оставляют на 16 ч в холодильнике. По окончании адсорбции антигена буфер удаляют путем промывки 0,01 М Na-фосфатным буфером рН с 0,15 М NaCl и 0,1% Твин-20 (Твин-ФСБ). В лунки на 30 мин вносят по 200 1% раствора желатина в Твин-ФСБ. Отмывку повторяют, после чего вносят в лунки по 100 стандартных растворов крысиных антител к ОВА, очищенных методом аффинной хроматографии, или исследуемых сывороток крови крыс в разведении 1:2000. Разведения выполняют в ФСБ с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА-ФСБ). Планшеты инкубируют 120 мин при 20°С со встряхиванием, после чего 5-кратно отмывают Твин-ФСБ и вносят по 100 кроличьих антител к IgG крысы, конъюгированных с пероксидазой, в разведении 1:4000 в БСА-ФСБ (примечание: рабочее разведение конъюгированных антител может быть указано на ампуле с сухим препаратом). Инкубацию и отмывку повторяют, после чего проводят реакцию со 100 субстрата 0,04% о-фенилендиамина и 0,04% в 0,1 М Na-цитрат-фосфатном буфере рН в течение 15 мин при 37°С. Реакцию останавливают добавлением 100 1н . Оптическую плотность измеряют при двух длинах волн: основной 492 нм и опорной (620 нм) на автоматическом планшетном фотометре.

Концентрации IgG антител в сыворотках крыс определяют по стандартной кривой путем линейной интерполяции в полулогарифмических координатах.

5.2.5. Статистическая обработка результатов

Оценку воздействия наночастиц/наноматериалов на показатель ответа антител проводят на основании результатов статистической обработки результатов исследований в соответствии со следующими критериями:

а) критерий однородности распределения показателя в шести группах животных, параметрический тест на остаточную дисперсию ANOVA в целях контроля специфичности применяемого теста определения антител;

б) факторный анализ с использованием параметрического теста на остаточную дисперсию ANOVA по фактору воздействия наночастиц в группах 2, 5, 6 и парное сравнение животных 2-ой группы с животными 5-ой и 6-ой групп с использованием критериев непараметрической статистики (тесты Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова) в целях выявления эффектов наноматериала, в том числе дозозависимых.

При проведении статистической обработки рекомендуется использовать профессиональные пакеты статистических программ.

Воздействие наночастиц/наноматериалов на показатели ответа антител считаются выявленным при достоверности различия на уровне значимости P = 0,05 и менее.

5.3. Методы оценки клеточного звена иммунитета у иммунизированных и не иммунизированных крыс

5.3.1. Метод оценки экспрессии клеточных маркеров

Экспрессию антигенов CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD16a на лимфоцитах периферической крови определяют методом прямого иммунофлуоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, коньюгированных с флуоресцентными красителями: FITC, PC7, APC (IO Test, "Beckman Coulter", США, или другой с аналогичными параметрами) и лизирующего/фиксирующего набора реагентов: VersaLyse Lysing Solution ("Beckman Coulter", США, PN IM3648, или другой с аналогичными параметрами), IOTest 3 Fixative Solution ("Beckman Coulter", США, PN IM3515, или другой с аналогичными параметрами). В работе используют следующие антитела: CD45RA (клон ОХ-33) - экспрессируется на В-лимфоцитах, моноцитах, наивных Т-клетках; CD3 (клон 1F4) - экспрессируется на Т-лимфоцитах; CD4 (клон ОХ-38) - экспрессируется на Т-лимфоцитах-хелперах;, CD8 (клон ОХ-38) экспрессируется на цитотоксических Т-лимфоцитах; CD161а (клон 10/78) экспрессируется на NK-клетках.

Ход определения. В пробирку для проточного цитометра ("Beckman Coulter", США, или другой с аналогичными параметрами) вносят 25 антител IOTest Anti-Rat CD3-FITC/CD4-PC7/CD8-APC PN A32909 ("Beckman Coulter", США, или другой с аналогичными параметрами) и 25 цельной крови, взятой от животных (крыс) в пробирки с с трикалиевой солью ЭДТА (1,6 мг К3ЭДТА на 1 крови). Перемешивают (1 с) на вортексе и инкубируют при комнатной температуре (18-25°С) в течение 20 мин в темноте. После инкубации добавляют 1 лизирующего/фиксирующего раствора, приготовленного путем смешивания 1 VersaLyse с 25 IOTest 3 Fixative Solution, перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.

Анализ окрашенных клеток осуществляют на проточном цитофлуориметре ("FC-500" производства "Beckman Coulter", США или другой с аналогичными параметрами) по программе Cytomics CXP Software. Детекцию флуоресценции выполняют при следующих длинах волн: нм, нм, нм. Популяцию лимфоцитов выделяют при помощи гейтирования по параметрам малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния (рисунок 1). Затем производят гейтирование популяции лимфоцитов по каналу флуоресценции FL1 и SS Lin: гейт В - Т-лимфоциты (CD3+) (рисунок 2). Результаты регистрируют на двухпараметрической гистограмме распределения CD3+ лимфоцитов (из гейта В) с использованием моноклональных антител против CD4 и CD8, меченных РС7 и АРС, детектируемых на каналах флуоресценции FL5 и FL4 (рисунок 3).

Экспрессию CD45RA и CD161a на лимфоцитах периферической крови определяют в отдельном тесте аналогичным способом с использованием набора антител IOTest Anti-Rat CD3-FITC/CD45RA-PC7/CD161a-APC PN A32910 ("Beckman Coulter", США или другой с аналогичными параметрами). Результаты исследования регистрируют на двухпараметрической гистограмме распределения CD3- лимфоцитов (из гейта С, см. рисунок 2) с использованием моноклональных антител против CD45RA и CD161a, меченных РС7 и АРС, детектируемых на каналах флуоресценции FL5 и FL4 (рисунок 4).

5.3.2. Метод оценки фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов периферической крови крыс

Выделение лейкоцитов из цельной периферической крови проводят по стандартной методике согласно МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов" (пункт 4.7.1). Фагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов определяют с помощью набора реагентов Phagocytosis Assay Kit (IgG FITC), производства "Cayman Chemical Company", США или другой с аналогичными параметрами, согласно прилагаемой инструкции. Объектом фагоцитоза служат частицы латекса, опсонизированные IgG FITC. Клеточную суспензию с добавлением латекса инкубируют в течение 30 мин в двух пробирках: в термостате при температуре 37°С (положительная проба) и при температуре 4°С (отрицательный контроль). Анализ проб производят на проточном цитофлуориметре по программе Cytomics CXP Software. Популяцию нейтрофильных лейкоцитов выделяют при помощи гейтирования по параметрам малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния (рисунок 5). Результаты регистрируют на канале флуоресценции Fl1 (процент клеток, поглотивших частицы латекса) (рисунок 6).

Для оценки бактерицидного потенциала нейтрофильных лейкоцитов и обусловленной этим эффективности киллинга фагоцитированных микробных клеток используют набор FagoFlowEx Kit ("EXBIO Praha", Чешская Республика, или аналогичные), позволяющий идентифицировать кислородный взрыв после стимуляции E.coli (ED7035-1) в образцах гепаринизированной цельной крови методом проточной цитофлуориметрии. После поглощения бактерии в фагоците активируется НАДФН-оксидаза, которая опосредует продукцию реакционноспособных форм кислорода (РСК). РСК внутри фагоцита окисляют дигидрородамин 123 и превращают его в флуоресцентный родамин 123, который детектируется на проточном цитофлуориметре. В качестве положительного контроля используется образец, стимулированный ФМА (форбол-12-миристат-13-ацетат), который инициирует кислородный взрыв без адгезии и поглощения патогена. Популяцию нейтрофильных лейкоцитов выделяют при помощи гейтирования по параметрам малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния аналогично тому, как показано на рисунке 5 (пример). Результаты регистрируют на канале флуоресценции Fl1 (рисунок 7).

Вычисляют процентное соотношение позитивных и негативных объектов и среднюю интенсивность флуоресценции. Результаты представляют как индекс стимуляции (ИС) - отношение средней интенсивности флуоресценции активированных нейтрофилов стимулированных образцов и отрицательных контролей.

5.3.3. Исследование апоптоза лимфоцитов периферической крови крыс

Принцип метода изучения степени апоптоза лимфоцитов основан на свойстве аннексина V связываться с фосфатидилсерином клеточной мембраны и способности 7-AAD (7-аминоактиномицин) встраиваться между цитозином и гуанином двухцепочечной ДНК клеток с нарушенной целостностью мембраны. На ранних стадиях апоптоза целостность клеточной мембраны сохраняется, но происходит конверсия мембранных фосфолипидов и появление фосфатидилсерина на поверхности клетки. Аннексин V с высокой аффинностью связывается с фосфатидилсерином и идентифицирует "ранний" апоптоз. Поздняя фаза апоптоза сопровождается не только утратой асимметрии фосфолипидов мембраны, но и нарушением целостности мембраны, фрагментацией ДНК и резким возрастанием мембранной проницаемости для катионных красителей. Комбинированная окраска аннексин V-FITC и 7- ААD позволяет идентифицировать неапоптозные - живые клетки (при сочетании аннексин V-негативные/7- ААD-негативные), ранние проапоптотические изменения (при сочетании аннексин V-позитивные/7- ААD-негативные), поздние варианты клеточной гибели (при сочетании аннексин V-позитивные /7- ААD-позитивные клетки) и мертвые клетки (аннексин V-негативные /7- ААD-позитивные клетки).

Выделение лимфоцитов из цельной периферической крови проводят по стандартной методике (МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов", пункт 4.7.1.). Клеточную суспензию дважды отмывают холодным, забуференным 0,01 М фосфатами 0,15М раствором хлорида натрия, рН 7,2-7,4 путем центрифугирования при 300g 5 мин и готовят пробу с концентрацией клеток в аннексиновом буфере (Annexin V Binding Buffer, кат.N 731728, производства "Beckman Coulter", США, или другой с аналогичными параметрами). Окрашивание лимфоцитов производят коньюгированным с флуорохромом (FITC) аннексином V (AnV-FITC) и витальным красителем 7-AAD (Annexin V-FITC/7-AAD Kit, кат. N IM3614, производства "IMMUNOTECH", Франция, или аналогичные). В пробирку для проточного цитометра вносят: 100 пробы, 10 аннексина V и 20 7-AAD, перемешивают на вортексе 1 с и инкубируют 15 мин в темноте на льду. После инкубации в пробирку добавляют 400 аннексинового буфера. Анализ окрашенных клеток осуществляют на проточном цитофлуориметре по программе Cytomics CXP Software. Детекцию флуоресценции выполняют при следующих длинах волн: нм, нм. Популяцию лимфоцитов выделяют при помощи гейтирования по параметрам малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния (рисунок 8). Результаты представляют в виде процентного соотношения живых клеток и лимфоцитов, находящихся на разных стадиях апоптоза, на 10000 просчитанных объектов в каждом образце (рисунок 9).

5.3.4. Оценка гематологических показателей

Гематологические показатели, определяемые в цельной крови иммунизированных и не иммунизированных животных, включают: определение общего гемоглобина, показателя гематокрита, содержания эритроцитов, среднего содержания гемоглобина в эритроците, среднего объёма эритроцита, средней концентрации гемоглобина в эритроците, содержания лейкоцитов, нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, лимфоцитов, моноцитов, содержания тромбоцитов, среднего объёма тромбоцита, относительного объёма тромбоцита в цельной крови.

При определении гематологических показателей используют стандартные методики, применяемые при клиническом анализе крови*. При анализе возможно использование автоматических гематологических анализаторов, например "Coulter AC TTM 5 diff OV", производства "Beckman Coulter", США, или другой с аналогичными параметрами. В этом случае подготовку и обработку биологического материала для анализа проводят в соответствии с инструкцией к применяемому оборудованию.

5.3.5. Методы определения продукции цитокинов у крыс

При определении цитокин-продуцирующей способности иммунокомпетентных клеток у иммунизированных и не иммунизированных крыс рекомендуется использовать метод оценки экспрессии генов цитокинов с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией согласно МР 1.2.2566-09 "Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo", пункты 7.1-7.3; 7.8-7.11. Субстратом для анализа являются клетки селезенки (спленоциты) или лейкоциты периферической крови, выделенные по стандартным методикам (МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов"; МР 1.2.2566-09 "Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo").

В качестве более простой и дешевой альтернативы данного метода рекомендуется использовать иммуноферментное определение уровней цитокинов в сыворотке крови. У сенсибилизированных и несенсибилизированных животных при этом рекомендуется проводить определение цитокинов , IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 и некоторых других в зависимости от задач исследования и ожидаемого характера действия тестируемого наноматериала. В качестве примера ниже приведена методика иммуноферментного определения крысиных IL-6, IL-10 и .

Определение IL-6, IL-10 и в сыворотке крови крыс проводят методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов ("Bioscience", производства "Bender MedSystems GmbH", Австрия, или другой с аналогичными параметрами). Принцип метода (двухвалентный твердофазный биотин-стрептавидиновый иммуноферментый тест) заключался в последовательном нанесении на планшет с иммобилизованными моноклональными антителами к определяемому цитокину 1) образцов и стандартов (IL-6, IL-10, ) и 2) конъюгата антител против крысиных IL-6, IL-10 или ) с биотином. После 2-х часовой инкубации и отмывки буфером, содержащем ФСБ c 1% Твин 20, сформировавшиеся на поверхности полистирола тройные иммунные комплексы антитело(1)-цитокин-антитело(2)-биотин выявляют внесением конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена (Streptavidin-HRP) на 1 час. Все перечисленные инкубации проводят при комнатной температуре (18-25°С). Затем повторяют процедуру отмывки с использованием буфера, содержащего ФСБ c 1% Твин 20 и вносят раствор субстрата (0,04% перекись водорода+0,04% тетраметилбензидин). Цветную реакцию останавливают с использованием 1М фосфорной кислоты, оптическую плотность измеряли при двух длинах волн: основной (450 нм) и опорной (620 нм) на автоматическом планшетном фотометре. Концентрацию цитокинов в сыворотке крови определяют по стандартной кривой с использованием метода линейной интерполяции (возможно использование программного обеспечения фотометра в режиме "кусочной аппроксимации").

5.4. Модель оценки функции иммунитета у мышей, иммунизированных корпускулярным (клеточным) антигеном

5.4.1. Принцип метода

Метод оценки гуморального звена иммунитета у мышей, иммунизированных корпускулярным антигеном, основан на образовании вокруг клеток, продуцирующих антитела с высокой гемолитической активностью (IgM-антитела), сферической зоны лизиса после добавления антигена и комплемента. Оценка показателей клеточного иммунитета при этом производится аналогично тестам на крысах (раздел 5.3).

5.4.2.Экспериментальная модель

Мышам вводят внутрибрюшинно (в/б) или внутривенно (в/в) суспензию трижды отмытых в стерильном апирогенном физиологическом растворе эритроцитов барана (ЭБ) в субоптимальной дозе, равной ЭБ/мышь. Введение наноматериалов животным проводится однократно или многократно в двух разных дозах (принцип установления которых приведён в пункте 5.1.5. настоящих методических рекомендаций) при различных путях воздействия (согласно МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов"), при этом пути введения антигена и наноматериалов должны отличаться. На 5 сутки после иммунизации при внутрибрюшинном введении (или на 4-е сутки после внутривенной иммунизации) определяют число антителобразующих клеток АОК в селезёнке. Дизайн эксперимента включает 6 групп животных численностью не менее 6 (предпочтительно 10) особей: 3 группы с введением ЭБ на фоне нулевой, низкой и высокой дозы наноматериала и три аналогичные группы без введения ЭБ, что позволяет выявить возможное спонтанное бляшкообразование у неиммунизированных животных, обусловленное неспецифическим эффектом наноматериала. Обнаружение поликлональной активации лимфоцитов у неиммунизированных животных будет свидетельствовать о риске развития аутоиммунного состояния под действием наноматериала.

5.4.3. Материалы и методы

Оборудование и материалы:

- водяная баня ( термостат) на температуру +37-(+50)°С;

- центрифуга лабораторная настольная с охлаждением;

- чашки Петри стеклянные или пластиковые одноразового применения;

- пробирки стеклянные со шлифом N 14 и пробкой, ГОСТ 25336-82

Реактивы:

- агароза (производства "Sigma", США, или другая с аналогичными параметрами);

- раствор Хэнкса без фенолового красного (производства "Sigma", США, или другой с аналогичными параметрами);

- стерильный физиологический раствор для инъекций по ГФ СССР, Х, 426;

- эритроциты барана (ЭБ) (получают из свежесобранной периферической венозной крови путём удаления фибрина осторожным встряхиванием при комнатной температуре 10-15 минут со стеклянными шариками (бусами) диаметром 3-5 мм с последующей трёхкратной отмывкой физиологическим раствором в настольной центрифуге с охлаждением (5 мин, 1500 об/мин); применение антикоагулянтов при взятии образца крови не рекомендуется);

- комплемент морской свинки (сухой лиофилизованный препарат, производства "Sigma", США, или другой с аналогичными параметрами; в качестве заменителя возможно использование цельной сыворотки крови интактных морских свинок).

Приготовление агарозной смеси.

Расплавленную в дистиллированной воде 2% агарозу добавляют к равному объему нагретого до 45-48°С однократного и двукратного (10-кратный концентрат, разведённый в 5 раз дистиллированной водой) раствора Хэнкса в соотношениях - 1:1:1.

Проведение анализа.

В агарозную смесь вносят суспензию ЭБ (концентрация ) из расчёта 70-80 млн. клеток на 1 агарозной смеси. По 2,75 полученной смеси разливают по пробиркам, предварительно помещённым в водяную баню с температурой 46-48°С. Далее в пробирки, содержащие агарозу с ЭБ, вносят 0,05-0,2 суспензии спленоцитов (получают, как указано в МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов", пункт 4.7.1) (концентрацию клеток определяют в предварительных опытах). Содержимое пробирок встряхивают и выливают на чашки Петри диаметром 100 мм. Осторожным покачиванием и вращением смесь равномерно распределяют по дну чашки. После застывания агарозы чашки помещают в термостат при 37°С на 1 час, после чего на поверхность агарозы выливают по 3 раствора сухого комплемента морской свинки (разведение в физиологическом растворе 1:5) и вновь инкубируют в термостате при 37°С в течение 45 мин. После инкубации комплемент сливают и проводят подсчёт образовавшихся бляшек (зон гемолиза). При относительно небольшом числе бляшек (примерно до 120 на чашку) их подсчитывают полностью. Если же бляшек было больше, то их подсчёт производят следующим образом. В листе плотной чёрной бумаги вырезают отверстие в форме квадрата со стороной 1 см (т.е. площадью 1 ). Подкладывая лист с вырезанным квадратом под донышко чашки, просчитывают выборочное число бляшек в 10 таких квадратах в разных участках чашки с последующим перерасчётом на всю поверхность агарозы в чашке (коэффициент перерасчёта для чашек диаметром 100 мм равен 6,88). Зная объём клеточной суспензии, наносимый на чашку, и общий объём селезёночной суспензии, вычисляют количество бляшек (АОК) на всю селезёнку.

Оценка результатов. При статистической обработке полученных данных определяли среднюю геометрическую числа АОК, и стандартную ошибку. Сравнивают число АОК у животных соответствующих групп, получавших и не получавших наноматериалы. При сравнении результатов применяют непараметрические критерии Манна-Уитни или Колмогорова-Смирнова. Достоверное различие (Р<0,05) свидетельствует о влиянии наноматериала на функциональную активность В-лимфоцитов.

VI. Порядок оценки воздействия искусственных наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета у не иммунизированных животных в тестах ex vivo

Тестирование воздействия наноматериалов на иммунную функцию у несенсибилизированных лабораторных животных (линейных и нелинейных мышей) проводится в две стадии. На первой стадии животным, получающим стандартный сбалансированный рацион, вводятся наноматериалы при различном пути их поступления (внутрижелудочно, ингаляционно, парентерально) однократно или в условиях подострого токсикологического тестирования (длительностью до 60 суток) в соответствии с МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов". По окончании введения у животных производится отбор биологических проб органов и тканей иммунной системы (кровь, альвеолярные или перитонеальные лейкоциты, селезенка).

На второй стадии полученные от жив