Межгосударственный стандарт ГОСТ 29185-2014 (ISO 15213:2003) "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы выявления и подсчета сульфитредуцирующих бактерий, растущих в анаэробных условиях" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 23 сентября 2014 г. N 1174-ст)

Microbiology of food and animal feeding stuffs. Methods for detection and enumeration of sulfite-reducing bacteria growing under anaerobic conditions

Дата введения - 1 января 2016 г.

Взамен ГОСТ 29185-91

ГАРАНТ:

Курсив в тексте не приводится

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и корма для животных и устанавливает метод выявления сульфитредуцирующих бактерий, растущих в анаэробных условиях, и метод определения их количества путем посева продукта в плотные питательные среды.

Метод посева в плотные питательные среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта не менее 150 или в 1  жидкого продукта не менее 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) сульфитредуцирующих бактерий.

Методы также применимы для испытания проб окружающей среды, отобранных из зон производства и переработки пищевых продуктов.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ ISO 11133-1-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории

ГОСТ ISO 11133-2-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети "Интернет" или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 сульфитредуцирующие бактерии, растущие в анаэробных условиях: Бактерии, образующие типичные колонии, выращиваемые в условиях, установленных в настоящем стандарте.

3.2 сульфитредуцирующие бактерии рода Clostridium: Сульфитредуцирующие бактерии, принадлежность которых к роду Clostridium подтверждена в соответствии с настоящим стандартом.

3.3 выявление сульфитредуцирующих бактерий или сульфитредуцирующих бактерий рода Clostridium: Установление факта присутствия или отсутствия сульфитредуцирующих бактерий или сульфитредуцирующих бактерий рода Clostridium в определенной навеске продукта в соответствии с методом, указанным в настоящем стандарте.

3.4 определение количества сульфитредуцирующих бактерий или сульфитредуцирующих бактерий рода Clostridium: Подсчет числа колониеобразующих единиц (КОЕ) сульфитредуцирующих бактерий или сульфитредуцирующих бактерий рода Clostridium, содержащихся в или г продукта, в соответствии с методом, установленным в настоящем стандарте.

4 Сущность методов

Методы выявления и определения количества сульфитредуцирующих бактерий основаны на высеве определенного количества продукта и (или) его разведений в плотные питательные среды, культивировании посевов в оптимальных для роста условиях и при необходимости, подсчета их количества и определения морфологических и биохимических свойств для подтверждения принадлежности сульфитредуцирующих бактерий к роду Clostridium.

5 Растворы для разведений, питательные среды, растворы реактивов

5.1 Растворы для разведений

Растворы для разведений готовят по [1] - [4], ГОСТ 26669 или по конкретному стандарту на исследуемый продукт.

5.2 Питательные среды, растворы реактивов

Для приготовления питательных сред и растворов используют дистиллированную воду по ГОСТ 6709.

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред и растворов, должны быть аналитического качества.

Обеспечение качества приготовляемых питательных сред и проведение их эксплуатационных испытаний по ГОСТ ISO 11133-1 и ГОСТ ISO 11133-2.

5.3 Среда для выявления и подсчета сульфитредуцирующих бактерий:

железосульфитный агар

5.3.1 Состав:

ферментативный перевар казеина - 15 г;

панкреатический перевар сои - 5 г;

дрожжевой экстракт - 5 г;

Натрия пиросульфит () - 1 г;

Железо (III) аммоний цитрат - 1 г;

Агар - 9 - 18 г*;

Вода - 1000 .

5.3.2 Приготовление

Растворяют ингредиенты в воде при нагревании. Если необходимо, устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,60,2 при температуре 25°С.

Разливают среду по 250  во флаконы или колбы вместимостью 500 . Если для посева используют пробирки (6.6), то среду разливают в пробирки высоким столбиком - 10 - 11 см. Среду стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при (1211)°С.

Непосредственно перед использованием среду деаэрируют.

Эксплуатационные испытания готовой среды аналогично испытаниям среды TS по ГОСТ ISO 11133-2.

5.4 Допускается использование готовых и дегидратированных питательных сред, в т.ч. хромогенных, и их компонентов, по качеству не уступающих вышеуказанным.

Приготовление и применение питательных сред - в соответствии с нормативными документами стран, принявших стандарт.

6 Оборудование и лабораторная посуда

Приемлемой альтернативой посуды многоразового применения является одноразовая посуда, если она отвечает соответствующим требованиям. Одноразовая посуда предпочтительнее многоразовой.

Применяют микробиологическое лабораторное оборудование по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ 10444.1.

6.1 Оборудование для сухой стерилизации (сушильный шкаф), обеспечивающий поддержание температуры в пределах от 160 до 180°С или стерилизации насыщенным паром (автоклавы).

6.2 Гомогенизатор, смеситель или миксер для подготовки проб не жидких продуктов (см. ГОСТ ISO 7218);

6.3 Баня водяная, обеспечивающая работу при температуре 44°С - 47°С с максимально допустимым отклонением температуры 0,5°С.

6.4 Анаэробный сосуд (анаэростат), с устройством для создания ан- аэробной атмосферы.

6.5 Инкубатор (термостат), поддерживающий температуру (371)°С и, если необходимо, (501)°С.

6.6 Пробирки размером 16 мм 160 мм и колбы или флаконы вместимостью 500 .

6.7 рН-метр, обеспечивающий измерение с точностью 0,05 единиц рН, с разрешением 0,01 единицы рН;

6.8 Чашки Петри, стеклянные или пластмассовые диаметром от 90 до 100 мм или, если необходимо, 140 мм;

6.9 Пипетки, градуированные для бактериологического применения, номинальной вместимостью 10 , 2 и 1 , с ценой деления 0,5 и 0,1 , и с выходным отверстием с номинальным диаметром от 2 до 3 мм.

6.10 Бактериологическая петля из платиноиридиевого или никель-хромового сплава диаметром около 3 мм.

6.11 Микроскоп оптический, обеспечивающий увеличение 1000х при просмотре в проходящем свете, оснащенный устройством для фазово-контрастной микроскопии.

7 Отбор проб

Отбор проб - по нормативным документам стран, принявших стандарт.

Важно, чтобы в лабораторию поступала представительная проба, которая не была повреждена или изменена при транспортировке или хранении.

Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. В случае отсутствия конкретного стандарта на отбор проб продукта рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны достигли согласия по процедуре отбора проб.

8 Приготовление пробы для испытания

Пробы для испытания приготавливают в соответствии с [1] - [4], ГОСТ 26669 или стандартом на конкретный продукт. При отсутствии соответствующего стандарта рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны достигли согласия по данному вопросу.

9 Метод проведения испытания

9.1 Общие требования

Схема проведения испытания приведена в приложении А.

9.2 Проба для анализа, исходная суспензия и разведения

См. [1] или конкретный стандарт на исследуемый продукт.

Если необходимо, для обеспечения гибели вегетативных форм и/или неспорообразующих форм бактерий применяют тепловую обработку исходной суспензии или жидкого продукта. Температура и время тепловой обработки варьируют от умеренного теплового пастеризационного эффекта (например 75°С в течение 20 мин) до кипения в течение нескольких минут. В этом случае результат подсчета выражают как число спор сульфитредуцирующих бактерий, растущих в анаэробных условиях.

9.3 Инокуляция

Берут две стерильные чашки Петри. Переносят в каждую чашку с помощью стерильной пипетки 1  испытуемой пробы, если она жидкая, или 1  исходной суспензии в случае испытания других продуктов.

Берут две другие стерильные чашки Петри. Переносят в каждую чашку с помощью другой стерильной пипетки 1  первого десятикратного разведения () испытуемой пробы, если продукт жидкий, или 1  первого десятикратного разведения исходной суспензии () при испытании других продуктов.

Повторяют описанную процедуру с последующими разведениями, используя для каждого очередного разведения новую стерильную пипетку.

При выявлении сульфитредуцирующих бактерий в определенной пробе для анализа ее высевают в чашку Петри или пробирку.

Помещают в каждую чашку Петри приблизительно 15  железосульфитного агара (5.3), который находится при температуре 44°С - 47°С в водяной бане (6.3). Время между инокуляцией чашек Петри и заливкой их питательной средой не должно превышать 15 мин. Тщательно перемешивают инокулят со средой и в горизонтальном положении дают среде застыть.

После того как среда застынет, вносят от 5 до 10  той же среды для образования второго слоя.

В случае использования для посева пробирок со средой инокулируют 1  жидкого продукта или разведением две пробирки со средой, находящейся при температуре 44°С - 47°С. Перемешивают осторожно содержимое пробирок, не допуская образования пузырьков воздуха в толще среды, и помещают посевы в пробирках для застывания в холодную водяную баню.

После того как среда застынет, вносят от 2 до 3  той же среды в каждую пробирку для образования второго слоя.

9.4 Посевы в чашках Петри инкубируют в анаэростате (6.4) при температуре (371)°С в течение 24 - 48 ч.

Если выявляют термофильные бактерии, готовят другие посевы (см. 9.3) и инкубируют их при температуре (501)°С.

В случае посева в пробирки инкубирование в анаэростате необязательно.

9.5 Подсчет колоний

После 24 - 48 ч термостатирования посевов подсчитывают количество колоний разной степени черной окраски. При выявлении сульфитредуцирующих бактерий в определенной массе или объеме пробы продукта для анализа подсчет количества выросших типичных колоний не проводят. Черные колонии, окруженные черной зоной, относят к сульфитредуцирующим бактериям.

Примечание - Расплывчатое неспецифическое почернение среды может наблюдаться в тех случаях, когда посев проводят в пробирки, а не в чашки Петри. Рост анаэробных бактерий, которые продуцируют водород (а не ), может также уменьшить содержание сульфитов в питательной среде и привести к общему почернению среды.

Подсчитывают колонии сульфитредуцирующих бактерий в каждой чашке Петри, где их количество менее 150, а количество всех выросших колоний не превышает 300.

Когда число выросших колоний в пробирках большое, их трудно подсчитать. В этом случае для подсчета могут быть использованы только те пробирки, в которых присутствуют отдельные колонии.

Примечание - Методы, приведенные в стандарте, могут быть использованы для выявления сульфитредуцирующих бактерий рода Clostridium. При этом после выявления типичных колоний берут 5 колоний с каждой чашки и подтверждают принадлежность к роду Clostridium путем проведения дополнительных тестов.

9.6. Подтверждение принадлежности выделенных сульфитредуцирующих бактерий к роду Clostridium

9.6.1 Микроскопирование

Из культур, выросших, как указано в 9.5, готовят два препарата и окрашивают по ГОСТ 30425: первый - по Граму, второй - для выявления бактериальных спор.

Сульфитредуцируюшие бактерии рода Clostridium представляют собой грампопожительные или грамвариабельные палочки, располагающиеся в одиночку, попарно, в виде цепочек или скоплений параллельных клеток. При спорообразовании споры сульфитредуцирующих бактерий рода Clostridium овальные или сферические, субтерминальные или терминальные.

Допускается окраску по Граму заменять тестом Грегорсена. Для этого на предметном стекле в капле 3%-ного водного раствора гидроокиси калия эмульгируют культуру микроорганизмов, взятую из колонии с плотной среды. Если через несколько секунд взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, то это указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательным бактериям. У грамположительных бактерий слизистых нитей не образуется.

9.6.2 Определение отсутствия каталазы

Отсутствие каталазы в культурах, выросших, как указано в п. 9.5, определяют по ГОСТ 30425.

Сульфитредуцирующие бактерии рода Clostridium каталазу не образуют.

9.6.3 Подтверждение анаэробного роста

Подтверждение анаэробного роста проводят посевом по ГОСТ 30425 культур, выросших, как указано в п. 9.5, в чашки Петри под стекло или в трубки Вейона, или инкубируют посевы в анаэробных условиях. Для посева используют плотную питательную среду (5.1). Посевы инкубируют по 9.4. Для сульфитредуцирующих бактерий рода Clostridium характерен анаэробный рост.

Допускается вместо подтверждения анаэробного роста проводить определение отсутствия роста в аэробных условиях. При этом культуры высевают в чашки Петри на поверхность плотной среды.

Посевы инкубируют в аэробных условиях при температуре (371)°С в течение 18 - 72 ч, а для выявления термофильных бактерий - при температуре (501)°С.

10. Обработка результатов

10.1 Результаты испытания оценивают по каждой пробе отдельно.

10.2 Если при изучении культуральных, морфологических и биохимических свойств обнаружены сульфитредуцирующие грампопожительные или грамвариабельные, каталазоотрицательные, способные расти в анаэробных условиях микроорганизмы, то дают заключение о том, что эти микроорганизмы относятся к сульфитредуцируюшим бактериям рода Clostridium (мезофильным или термофильным).

Если дополнительные подтверждающие тесты не проводились (9.6), то при наличии роста типичных колоний дают заключение о том, что эти микроорганизмы относятся к сульфитредуцирующим бактериям.

10.3 Если при подтверждении характерных колоний в 80% случаев, то есть не менее чем в 4 из 5 колоний подтвержден рост сульфитредуцирующих бактерий рода Clostridium, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашке Петри или пробирке (см. п. 9.5), принадлежат к этому роду. В остальных случаях количество сульфитредуцирующих бактерий рода Clostridium определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

10.4 Пересчет количества сульфитредуцирующих бактерий или сульфитредуцирующих бактерий рода Clostridium на 1 г или 1  продукта проводят по ГОСТ 26670.

10.5 Результаты определения количества сульфитредуцирующих бактерий или сульфитредуцирующих бактерий рода Clostridium записывают по ГОСТ 26670.

10.6 Результаты выявления присутствия (отсутствия) сульфитредуцирующих бактерий или сульфитредуцирующих бактерий рода Clostridium с указанием количества пробы для анализа записывают следующим образом: "супьфитредуцирующие бактерии или сульфитредуцирующие бактерии рода Clostridium обнаружены (или не обнаружены) в X г или X продукта".

11 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен включать:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b) использованный метод отбора проб, если он известен;

c) использованный метод испытания, включая температуру инкубации и температурный прогрев для гибели вегетативных клеток (если он применялся);

d) все детали, не установленные в настоящем стандарте или считающиеся необязательными, наряду с подробным описанием всех обстоятельств, которые могли повлиять на результаты;

e) полученные результаты испытания.

Протокол испытаний может также содержать информацию о результатах проведения дополнительных тестов.

12 Требования безопасности

Общие требования к проведению микробиологического испытания и требования к персоналу - по ГОСТ ISO 7218.

___________

* В зависимости от желирующих свойств агара.

Библиография

[1]	ISO 6887-1:1999 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила приготовления исходной суспензии и десятичных разведений
[2]	ISO 6887-2:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 2.Специальные правила для приготовления мяса и мясных продуктов
[3]	ISO 6887-3:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 3. Специальные правила для приготовления рыбы и рыбных продуктов
[4]	ISO 6887-4:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 4. Специальные правила для приготовления продуктов, кроме молока и молочных продуктов, мяса и мясных продуктов, рыбы и рыбных продуктов