Методические указания МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов" (утв. Первым заместителем Председателя Госкомсанэпиднадзора РФ - заместителем Главного государственного санитарного врача РФ 29 октября 1996 г.)

5.1.1. Молоко, сливки и другие жидкие продукты и компоненты

Отобранные пробы перед исследованием тщательно перемешивают.

5.1.2. Сгущенные продукты и компоненты

Отобранную пробу тщательно перемешивают стерильной ложкой, затем взвешивают стерильную сухую колбу и в нее помещают 10 г продукта.

5.1.3. Кисло-молочные продукты и напитки, закваски

Отобранные пробы перед исследованием перемешивают и нейтрализуют. Для этого на каждые 10 см3/г исследуемого продукта или его первого разведения для сухих кисло-молочных продуктов, напитка или закваски в стерильную посуду добавляют 1,0 см3 стерильного раствора двууглекислого натрия с массовой концентрацией 100 г/дм3, содержимое перемешивают.

5.1.4. Стерилизованные продукты детского питания

Отобранные пробы перед исследованием тщательно перемешивают. Перед вскрытием бутылок (пакетов) с продуктом крышку (поверхность пакета) протирают ватой, смоченной спиртом.

Открывают крышку фламбированным или стерильным консервным ножом. Края пакета вскрывают стерильным ножом, скальпелем или ножницами. После снятия крышки края бутылки вновь фламбируют.

5.1.5. Сыр, творог, творожные изделия и пастообразные продукты

Навеску сыра, творога, творожных изделий и пастообразных продуктов взвешивают на стерильном часовом стекле, чашке Петри, в бюксе, переносят в стерильную или фламбированную ступку, прикрытую крышкой от чашки Петри, и тщательно растирают, нейтрализуют по п.5.1.3.

5.1.6. Топленое масло или молочный жир

Перед исследованием пробу расплавляют на водяной бане при температуре от 40 до 45°С и перемешивают до получения однородной эмульсии.

5.1.7. Сухие продукты детского питания и компоненты

Отобранную среднюю пробу тщательно перемешивают, взвешивают навеску продукта на кусочке стерильного пергамента, на чашке Петри, в бюксе или на часовом стекле, затем взвешенную пробу переносят в стерильную колбу или другую посуду.

5.2.1. Перед посевом готовят десятикратные разведения продукта в стерильных растворах разбавленного фосфатного буфера, изотонического раствора натрия хлорида, пептонной воды или лимоннокислого натрия (для сыра).

Для приготовления разведения готовят все необходимые стерильные материалы и посуду в соответствии со спецификой анализа исследуемого продукта: пробирки с 9,0 см3 или колбы с 90,0 см3 одного из растворов, используемых для приготовления разведений.

5.2.2. Из проб молока, сливок, кисло-молочных продуктов и напитков, кукурузного масла, молочного жира и других жидких продуктов и компонентов отбирают стерильной пипеткой 10,0 см3 и вносят в 90,0 см3 одного из стерильных растворов, используемых для приготовления разведений, взбалтывают в течение (4+-1) мин круговыми движениями до возможно более полного растворения. При этом пипетку промывают до 10 раз раствором этого продукта до верхнего уровня имеющихся на ней делений.

Получают разведение 1:10 (первое разведение).

Топленое масло или молочный жир вносят в растворы, подогретые до температуры от 40 до 45°С.

5.2.3. Приготовленные навески по 10 г сухих молочных продуктов детского питания, сывороточных белковых концентратов, казецитов и других компонентов, сгущенных продуктов, сыра, творога, творожных изделий и других пастообразных продуктов переносят в колбу с 90,0 см3 одного из стерильных растворов, используемых для приготовления разведений, подогретых от 40 до 45°С и взбалтывают в течение (4+-1) мин круговыми движениями до возможно более полного эмульгирования.

Получают разведение 1:10.

При другом способе разведения к приготовленным навескам по 10 г вышеуказанных продуктов добавляют 90,0 см3 одного из стерильных растворов, подогретых от 40 до 45°С и далее поступают как указано и п.5.2.3.

5.2.4. Для получения однородной взвеси продукта допускается перемешивание на аппарате для встряхивания жидкостей в течение (6+-1) мин, избегая намокания пробок. Первое разведение продукта (1:10) можно гомогенизировать в стерильном стакане гомогенизатора или растереть в стерильной ступке.

5.2.5. Из первого разведения продукта стерильной пипеткой берут 1,0 см3 и переносят в пробирку, содержащую 9,0 см3 стерильного раствора, используемого для приготовления разведений, перемешивают осторожно, набирая и выдувая из пипетки 5-10 раз. Получают второе разведение продукта (1:100). Последующие разведения в зависимости от предполагаемого обсеменения продукта 1:1000, 1:10000 и т.д. готовят аналогично.

Для приготовления каждого разведения берут новую стерильную пипетку. Вводят пипетку в пробирку не более, чем на 2-3 см ниже поверхности взвеси.

Время от момента приготовления разведений до посева не должно превышать 20-30 мин. Перед посевом все разведения осторожно встряхивают. При посеве на чашки Петри или в пробирки посевной материал вносят от большего разведения к меньшему. В этом случае пользуются одной пипеткой.

5.2.6. Для приготовления разведений сухих молочных каш для детского питания используют надосадочную жидкость первого разведения продукта после отстаивания его в течение 2-3 мин.

5.3.1. Всю новую посуду, предназначенную для бактериологических работ, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты с объемной долей 1-2%) в течение (15+-5) мин и затем ополаскивают дистиллированной водой.

Посуду, бывшую в употреблении, моют 0,5%-ным щелочным раствором с помощью ершей и щеток и ополаскивают водопроводной водой. Сильно загрязненную посуду со следами жира, красок и иммерсионного масла опускают на 2 ч в хромовую смесь, подогретую от 40 до 45°С, затем тщательно промывают проточной водопроводной водой.

Посуда с питательными средами, после подсчета на них дрожжей, плесневых грибов, бактерий группы кишечных палочек, Е. coli, S. aureus, энтерококков, сальмонелл и других видов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, обеззараживается перед мойкой путем стерилизации в автоклаве при (121+-1)°С в течение (30+-1) мин или кипячением в течение 1 ч.

Вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре или горячим воздухом.

Предметные стекла после мойки и ополаскивания вытирают чистой салфеткой или помещают в склянку с притертой пробкой в смесь этилового спирта и наркозного эфира в соотношении 1:1.

5.3.2. Лабораторную посуду перед использованием обязательно стерилизуют. Стерилизацию осуществляют сухим жаром в сушильном шкафу при (160+-5)°С в течение 2 ч или паром в автоклаве при 1 атм (121+-1)°С в течение (30+-1) мин с последующим подсушиванием в сушильном шкафу.

Перевод давления, показываемого манометром автоклава, в температуру проводится следующим образом:

- 0,5 атм - 112°С;

- 0,7 атм - 116°С;

- 0,8 атм - 118°С;

- 1,0 атм - 121°С;

- 2,0 атм - 134°С

Чашки Петри, пипетки и т.п. стерилизуют завернутыми в плотную оберточную бумагу или в пеналах. В верхнюю часть пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты.

Пробирки, флаконы, бутылки, колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробки (кроме пробирок) надевают бумажный колпачок, который обвязывают вокруг горлышка ниткой или закрепляют резиновым колечком.

Каучуковые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют отдельно в автоклаве завернутыми в бумагу.

Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками. Срок хранения стерильной посуды - не более 30 суток при ненарушенной завертке или невскрытых пеналах.

6.1.1. Концентрированный фосфатный буферный раствор

Взвешивают 34 г однозамещенного фосфорнокислого калия и растворяют в 500,0 см3 дистиллированной воды в мерной колбе, вместимостью 1000 см3. Устанавливают активную кислотность раствора (7,2+-0,1) ед рН 1н раствором гидроокиси натрия и доводят дистиллированной водой до 1000,0 см3. Хранят в емкости, укупоренной резиновой пробкой, в условиях холодильника не более 30 суток.

6.1.2. Разбавленный фосфатный буферный раствор

Вносят пипеткой, вместимостью 2 см3, 1,25 см3 концентрированного фосфатного буферного раствора в мерную колбу, вместимостью 1000 см3, и доводят объем дистиллированной водой до метки, проверяют активную кислотность (7,1+-0,1) ед рН.

Разливают разбавленный фосфатный буферный раствор по 10,0 см3 в пробирки, по 100,0 см3 в колбы, вместимостью 200 см3, и по 900,0 см3 в колбы, вместимостью 1600 см3, закрывают ватными пробками. Стерилизуют в автоклаве при (121+-1)°С в течение (20+-1) мин.

6.1.3. 0,1%-ный водный раствор пептона (пептонная вода)

К 1,0 дм3 дистиллированной воды добавляют 1 г пептона. После размешивания среду кипятят, фильтруют и разливают в пробирки и флаконы в необходимых количествах. Стерилизуют при (121+-1)°С в течение (30+-1) мин.

6.1.4. Изотонический 0,85%-ный раствор хлористого натрия

Для приготовления изотонического раствора, активной кислотностью (7,0+-0,1) ед рН, используют дистиллированную воду, рН которой проверяют индикатором бромтимолблау. При его добавлении цвет воды должен быть бутылочно-зеленым. В иных случаях воду не используют.

В 1,0 дм3 воды растворяют 8,5 г хлористого натрия, разливают раствор в чистые пробирки, диаметром 18-20 мм, по 10,0 см3, а в колбы - по 93,0 см3 и стерилизуют в течение (15+-1) мин при (121+-1)°С.

6.1.5. Приготовление раствора лимоннокислого натрия
для приготовления разведений сыра

В 1000,0 см3 дистиллированной воды растворяют 20 г трехзамещенного лимоннокислого натрия, разливают в пробирки по 10,0 см3 и колбы по 93,0 см3 и стерилизуют при (121+-1)°С в течение (20+-1) мин.

6.1.6. Стерильная дистиллированная вода

Дистиллированную воду разливают в колбы или пробирки в необходимых количествах и стерилизуют в течение (20+-1) мин при (121+-1)°С.

6.1.7. Раствор двууглекислого натрия для нейтрализации проб
кисло-молочных продуктов и закваски

10 г двууглекислого натрия помещают в мерную колбу, вместимостью 100 см3, растворяют дистиллированной водой, доводят объем раствора до метки. Раствор разливают в пробирки и стерилизуют при (121+-1)°С в течение (30+-1) мин.

6.1.8. Реактивы для окраски по Граму (модификация Г.П.Калины)

Реактив 1.

К 100,0 см3 этилового спирта добавляют 0,5 г кристаллического фиолетового.

Реактив 2.

К 96,0 см3 0,5%-ного спиртового раствора йодистого калия добавляют 2,0 см3 5%-ного спиртового раствора основного фуксина и 2,0 см3 5%-ного спиртового раствора йода.

Примечание. Растворение йодистого калия в спирте рекомендуется проводить в водяной бане при температуре от 45 до 50°С при постоянном помешивании.

6.1.9. Приготовление реактивов из метиленового голубого

Приготовление основного спиртового раствора метиленового голубого.

10 г метиленового голубого смешивают со 100,0 см3 96%-ного этилового спирта. Раствор ставят в термостат при температуре (37+-1)°С на (24+-1) ч, а затем фильтруют в термостате при той же температуре. Срок хранения основного раствора метиленового голубого в термостате при температуре (37+-1)°С не более 3-х месяцев при условии герметичной укупорки.

Приготовление рабочего раствора метиленового голубого.

Основной раствор помещают в водяную баню при температуре (45+-1)°С на (8+-2) мин, перемешивают до полного растворения кристаллов. Затем быстро охлаждают до температуры (20+-1)°С и 5,0 см3 этого раствора прибавляют к 195,0 см3 дистиллированной кипяченой воды. Смесь хорошо перемешивают. Срок хранения рабочего раствора метиленового голубого - не более 7 суток при температуре от 8 до 10°С.

Приготовление раствора метиленового голубого для окраски препаратов.

К 30,0 см3 основного спиртового раствора метиленового голубого прибавляют 100,0 см3 дистиллированной воды и 1,0 см3 раствора гидроокиси калия с массовой концентрацией 10 г/дм3.

6.1.10. Приготовление карболового раствора кристаллического
фиолетового для окраски препаратов

1 г красителя кристаллического фиолетового растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты до кашицы, прибавляют небольшими порциями 10,0 см3 96%-ного этилового спирта. Доводят объем до 100 см3 дистиллированной водой. Таким образом получают основной раствор для приготовления рабочего раствора.

К 10,0 см3 основного карболового раствора кристаллического фиолетового добавляют 90,0 см3 дистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

Растворы хранят в темном флаконе под притертой пробкой.

6.1.11. Мясо-пептонный бульон

Говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю, смешивают с двойным количеством водопроводной воды и оставляют на (18+-6) ч при температуре (5+-1)°С. Для ускорения процесса выделения питательных веществ из мяса содержимое кастрюли подогревают при температуре (50+-5)°С в течение (1+-0,1) ч и затем кипятят (35+-5) мин. После кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный фильтр. Фильтрат доводят питьевой водой до первоначального объема, добавляют к нему (1,0+-0,1)%-ного пептона и (0,5+-0,1)%-ного хлористого натрия. Устанавливают с помощью 1 н раствора гидроокиси натрия активную кислотность (7,3+-0,1) ед рН. Приготовленный бульон разливают в колбы и стерилизуют при (121+-1)°С в течение (20+-1) мин.

6.1.12. Мясо-пептонный агар

К 1,0 дм3 мясо-пептонного бульона или перевара Хоттингера, с концентрацией аминного азота не менее 100 мг/л добавляют 15 г мелко нарезанного агара в волокнах или порошке. После 10-15-минутного набухания агар-агара смесь кипятят при постоянном помешивании до полного его растворения. Полученную среду после установления активной кислотности (7,3+-0,1) ед рН фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и пробирки и стерилизуют при (121+-1)°С в течение 20 мин.

6.2.1. Среды для определения общего количества мезофильных аэробных
и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Сухой питательный агар промышленного про-

изводства (на основе килечного гидролизата)           - 35 г

Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД)                       - 2,5 г

Глюкоза                                               - 1,0 г

Вода дистиллированная                                 - до 1000,0 см3

рН                                                    - 7,0

     Стерилизация в автоклаве при (121+-1)°С в течение (20+-1) мин.

6.2.2. Среды и реактивы для обнаружения бактерий группы кишечных
палочек и эшерхий коли

6.2.3. Среды и реактивы для обнаружения бактерий рода Salmonella

     Среду готовят из трех растворов *(1).

     1 раствор:

     пептон                                   - 4,2 г

     натрий хлористый                         - 7,15 г

     дрожжевой диализат или дрожжевой экстракт

     (ЭКД)                                    - 20 см3

                                                или 2 г

     калий фосфорнокислый однозамещенный      - 1,42 г

     вода дистиллированная                    - 890,0 см3

     2 раствор:

     магний хлористый кристаллический

     (MgCl2 x 6H20)                           - 35,7 г

     вода дистиллированная                    - 90,0 см3

     3 раствор:

     0,5%-ный водный раствор бриллиантового

     зеленого                                 - 0,9 см3

     6.2.3.5.1. Селенитовая среда накопления Лейфсона *(2).

     Натрий кислый селенистокислый                 - 4 г

     Пептон импортный                              - 5 г

     Натрий фосфорнокислый двузамещенный           - 7 г

     Натрий фосфорнокислый однозамещенный          - 3 г

     Лактоза                                       - 4 г

     Дистиллированная вода                         - 1000,0 см3

     Дистиллированная вода                         - 100,0 см3

     Сухой питательный агар                        - 2,5 г

     Лактоза                                       - 1,0 г

     Сахароза                                      - 1,0 г

     Глюкоза                                       - 0,1 г

     Мочевина                                      - 1,0 г

     Железо сернокислое (FeSO4-7H2O)               - 0,02 г

     Натрий серноватистокислый

     (Na2S2O3 x 5H2O)                              - 0,03 г

     0,04%-ный водный раствор фенолового

     красного                                      - 0,04 см3

6.2.4. Среды и реактивы для обнаружения стафилококков

6.2.5. Среды и реактивы для обнаружения В. cereus

6.2.6. Среды и реактивы для обнаружения плесневых грибов и дрожжей

6.2.7. Среды и реактивы для определения бифидобактерий

6.2.8. Среды для определения молочно-кислых бактерий

6.2.9. Среды и реактивы для обнаружения энтерококков

6.2.10. Контроль питательных сред

7.1.1. Сущность метода

Метод основан на количественном подсчете колоний микроорганизмов, вырастающих на плотном питательном агаре при температуре (30+-1)°С в течение 72 ч.

Аппаратура, материалы и реактивы согласно п.4.

7.1.2. Подготовка к анализу

Подготовку проб и приготовление разведений осуществляют как указано в п.5.1 и 5.2. Посуду, материалы и реактивы стерилизуют как указано в п.5.3.

7.1.3. Проведение анализа

Для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 15 и не более 300 колоний. При посеве продуктов, не требующих разведения, учитывают все выросшие на чашках колонии (т.е. и менее 15).

Посев на чашки.

Перед посевом чашки маркируют. На дне чашки карандашом по стеклу ставят номер исследуемого образца продукта, разведение и дату.

По 1 см3 цельного продукта или каждого соответствующего его разведения вносят в 2 чашки Петри (параллельное определение). Пипетку с посевным материалом держат под углом 45°, касаясь концом пипетки дна чашки, не выдувая последнюю каплю из пипетки. Затем наливают в каждую чашку по 15-20 см3 питательной среды, расплавленной на водяной бане и остуженной до 45°С (приготовление питательных сред для определения общего количества бактерий указано в п.п. 6.1.9, 6.1.10, 6.2.1.1, 6.2.1.2). Если ожидают ползучий рост микроорганизмов, посевы заливают вторым слоем питательной среды или (4+-1) см3 водного раствора агара (п.6.2.8.5).

Края колб с питательной средой перед каждой заливкой фламбируют в пламени газовой горелки или спиртовки. Сразу после заливки агара содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала.

7.1.4. Инкубация

После застывания среды чашки Петри переворачивают крышками вниз и помещают в таком виде в термостат при (30+-1)°С на 72 ч (допускается предварительный учет через (48+-1) ч с последующим окончательным учетом еще через (24+-1)ч.

Чашки Петри с посевами распределяют в термостате таким образом, чтобы каждая их группа отделялась от соседних чашек, от верха и стенок термостата не менее, чем на 3 см.

7.1.5. Учет и обработка результатов

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением от 4 до 10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами. При подсчете колоний рекомендуется пользоваться специальным прибором.

При большом числе колоний и равномерном их распределении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых сектора, подсчитывают число колоний на двух-трех секторах (но не менее, чем на 1/3 поверхности чашки), находят среднее арифметическое число колоний и умножают на общее количество колоний, выросших на одной чашке.

Если инкубированные чашки с разведением 1:10 не содержат колоний, то результат выражают так: меньше, чем 1х10(1) или менее 10 бактерий на 1,0 см3 (г) продукта. Если на каждой из 2-х параллельных чашек с разведением 1:10 содержится меньше, чем 15 колоний, то результат выражают так: количество микроорганизмов менее Мх10, где М - число выросших колоний.

Если количество колоний более 15, подсчитывают колонии на обеих чашках с одним и тем же разведением и вычисляют среднюю величину, умножают ее на соответствующее разведение и получают число микроорганизмов в 1,0 см3 (г) продукта.

Полученный результат округляют в соответствии с ГОСТом 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов":

- до числа, кратного 5, если среднее арифметическое число микроорганизмов менее 100;

- до числа, кратного 20, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и оканчивается цифрой 5;

- до числа, кратного 10, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и не оканчивается цифрой 5.

Среднее арифметические от подсчитанного количества колоний, выросших на чашках, является общим количеством мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г (см3) исследуемого продукта.

Ответ выражают и виде числа КОЕ/г с указанием соответствия или несоответствия продукта микробиологическому нормативу на этот показатель.

Пример: посеяно разведение 1:10; чашка 1 - 185 колоний, чашка 2 - 203 колонии;

расчет:

185+203=388:2=194 - округляем до 200;

результат 200х 10=2000=2,0х10(3) КОЕ/г (см3).

7.2.1. Сущность метода

В соответствии с принятой международной номенклатурой в настоящих Методических указаниях к бактериям группы кишечных палочек (БГКП) отнесены грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре (37+-1)°С в течение 24-48 ч, в основном являющиеся представителями родов Esherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia (т.e. учитываются как цитратотрицательные, так и цитратположительные варианты БГКП).

Сухие продукты типа "Детолакт", "Новолакт ММ", "Алеся" и др., предназначенные для детей с первого дня жизни и употребляемые после восстановления при (37+-1)°С и (70+-1)°С, перед посевом должны подвергаться предварительной инкубации в неселективной жидкой среде для восстановления физиологических свойств бактерий, поврежденных в процессе технологической обработки продукта. В качестве неселективной среды обогащения используют фосфатный буферный раствор (п.6.1.2).

Без предварительной инкубации исследуют сухие продукты, подвергающиеся различным способам термической обработки перед употреблением (разведение кипяченой водой (85+-1)°С и выше, доведение до кипения, пастеризация восстановленной смеси и т.д.), биологически активные добавки, стерилизованные, кисло-молочные (сухие и жидкие) и пастообразные продукты детского питания, а также составляющие их компоненты.

7.2.2. Подготовка к анализу

Посуду, материалы и реактивы подготавливают как указано в п.5.3.

7.2.3. Приготовление разведений

Подготовку проб и приготовление разведений осуществляют как указано в п.5.1 и 5.2.

7.2.4. Посев с предварительной инкубацией детских
сухих молочных продуктов

Асептически взвешивают 1 г сухого продукта, вносят в колбочку или пробирку с 9,0 см3 разбавленного фосфатного буфера для предварительного обогащения. Взвесь тщательно перемешивают, проверяют значение рН при помощи индикаторной бумаги (стерильной стеклянной палочкой наносят каплю испытуемой взвеси на полоску универсальной индикаторной бумаги и полученную окраску немедленно сравнивают со шкалой). При необходимости доводят активную кислотность до 7,0 ед рН, используя стерильные растворы 1 Н гидроокиси натрия или 1 Н соляной кислоты.

Колбочки помещают в термостат при температуре (37+-1)°C и выдерживают 24 часа. На следующий день засевают 1,0 см3 проинкубированной в буферном растворе взвеси продукта в пробирку с 10,0 см3 среды Кесслер с лактозой и проводят анализ в соответствии с п.7.2.5.

7.2.5. Прямой посев

Для посева используют то количество продукта, в котором предусматривается отсутствие БГКП (колиформных бактерий) соответствующими пунктами таблиц 1-9. Посев производится в среду Кесслер с лактозой (с поплавками), с соблюдением соотношения продукта и среды 1:10. Применение среды Кода не допускается.

В производственных лабораториях возможно производить посев сухих продуктов из первого разведения в объеме 10,0 см3 (при необходимости засева 1 г).

Прямые посевы продуктов или посевы после преинкубации помещают в термостат при температуре (37+-1)°С на (24+-1) ч. При отсутствии признаков роста - газообразования или помутнения среды, дают заключение об отсутствии БГКП (колиформных бактерий) и соответствии исследуемого продукта нормативу на БГКП (колиформные бактерии). При наличии признаков роста - газообразования, помутнения среды Кесслер с лактозой, для окончательного заключения о наличии в продукте БГКП (колиформных бактерий), из подозрительных колб или пробирок производят высев на чашки со средой Эндо или Левина (п.6.2.2.3). Посев производят петлей из каждой пробирки так, чтобы получить рост изолированных колоний - на отдельный сектор, лучше - на отдельную чашку. Чашки с посевами помещают в термостат при температуре (37+-1)°С от 18 до 24 ч.

Учет результатов.

При отсутствии на среде Эндо или Левина колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) (на среде Эндо - красных с металлическим блеском или без него, розовых и бледно-розовых; на среде Левина - черных с металлическим блеском, темных с черным центром, сиреневых с темным центром) засеянная навеска продукта считается незагрязненной ими, т.е. исследуемый продукт соответствует нормативу на БГКП (колиформные бактерии).

При наличии на среде Эндо или Левина типичных или подозрительных для кишечных палочек (колиформных бактерий) колоний - их продолжают изучать. Из изолированных колоний, характерных или подозрительных на БГКП, делают препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют.

Обнаружение грамотрицательных не содержащих спор палочек указывает на наличие БГКП (колиформных бактерий) в анализируемой массе продукта и несоответствие продукта микробиологическому нормативу.

Примечание.

Обнаружение на среде Эндо колоний с желтым или желто-коричневым оттенком при анализе сухих молочных каш, содержащих в качестве компонента муку рисовую и гречневую, толокно овсяное, крупу манную, указывает на возможную принадлежность выделенных бактерий к роду Erwinia.

Бактерии рода Enwinia - грамотрицательные, необразующие спор палочки, способные утилизировать лактозу с образованием кислоты и газа, по комплексу других биохимических признаков отличающиеся от бактерий группы кишечных палочек. Бактерии рода Enwinia являются типичными представителями эпифитной микрофлоры зерновых культур и не обладают патогенностью для человека и животных. Для определения принадлежности к роду Erwinia выросших на среде Эндо нетипичных для БГКП колоний последние пересевают на питательный агар с 5% сахарозы (п.6.2.2.17), на котором они дают выраженный мукоидный рост, не свойственный бактериям группы кишечных палочек. При подтверждении принадлежности подозрительных колоний роду Erwinia и отсутствии других микроорганизмов, типичных для БГКП, исследуемый продукт считается соответствующим нормативу на БГКП (колиформные бактерии).

7.3.1. Сущность метода

Метод основан на способности Е. coli ферментировать лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 44,0°С от 24 до 48 часов. Идентификацию Е. coli проводят по признакам: образование индола, положительная реакция с метиловым красным, отрицательная реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) и отсутствие способности утилизировать цитраты.

7.3.2. Аппаратура, материалы и реактивы

При проведении анализов используют аппаратуру, материалы и реактивы, перечисленные в п.4.

7.3.3. Подготовка к анализу

Подготовку проб и приготовление разведений осуществляют как указано в п.5.1 и 5.2.

Посуду и материалы стерилизуют как указано в п.5.3.

7.3.4. Проведение анализа с предварительной инкубацией

7.3.4.1. Асептически взвешивают 10 г сухого продукта типа "Детолакт" (табл.1), растворяют в колбе 90,0 см3 разбавленного фосфатного буфера.

Для доведения активной кислотности до 7,0 ед рН используют простерилизованный 1 Н раствор гидроокиси натрия или 1 Н раствор соляной кислоты, проверяя рН индикаторной бумагой.

Колбу помещают в термостат и выдерживают при температуре (37+-1)°С в течение (24+-1) ч.

7.3.4.2. На следующий день засевают из этих колб 1,0 см3 в пробирку или колбу с 9,0 см3 среды Кесслер с лактозой (п.п. 6.2.2.1, 6.2.2.2) (с поплавками), помещают в термостат и выдерживают при температуре (44+-1)°С в течение (24+-1) ч. При отсутствии газа, помутнения, изменения цвета среды в посевах продуктов, подвергшихся предварительной инкубации, результат анализа считают отрицательным и дают заключение об отсутствии Е. coli и соответствии нормативу по этому показателю,

7.3.5. Проведение анализа без предварительной инкубации

7.3.5.1. Навеску продукта 10 г (см3) помещают в колбу с 90,0 см3 среды Кесслер с лактозой (с поплавками). Помещают в термостат при (44+-1)°С на (24+-1) ч. На следующий день колбы просматривают, при отсутствии признаков роста посевы оставляют в термостате еще на (24+-1) ч.

7.3.5.2. Пробирки и колбы с посевами просматривают на присутствие газа. При отсутствии газа и других признаков роста (помутнения и т.д.) в посевах дают заключение об отсутствии в продукте Е. coli и соответствии нормативу по этому показателю.

Пробирки (колбы), в которых обнаружен газ или другие признаки роста (помутнение среды), подвергают дальнейшим исследованиям. Из этих пробирок производят посев штрихом или рассевом на поверхность чашки Петри с подсушенной средой Эндо или Левина так, чтобы получить изолированные колонии. Посевы выдерживают в термостате (37+-1)°С в течение (24+-1) ч.

Эшерихии на среде Эндо образуют колонии красные с металлическим блеском или без него, розовые, на агаре Левина - черные, темно-коричневые колонии с темным центром, с металлическим блеском или без него. Если при окрашивании по Граму и просмотре под микроскопом подтверждается наличие грамотрицательных бесспоровых палочек, то все типичные колонии подвергают идентификации по ИМАЦ-тестам (реакция на индол, реакция с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра, утилизация цитрата).

7.3.6. Оценка результатов идентификации

Таблица 11

Классификация колиформных бактерий по ИМАЦ-тестам

При выделении из продукта грамотрицательных неспорообразующих палочек, продуцирующих газ из лактозы при (44+-1)°С, образующих и не образующих индол, дающих положительную реакцию с метиловым красным, отрицательную Фогес-Проскауэра и не растущих на среде Симмонса (Козера) считают, что в 10 г продукта содержатся эшерихии коли. Продукт в данном случае бракуется.

При обнаружении в 10 г продукта бактерий родов Enterobacter и Citrobacter, но при отсутствии колиформных бактерий (БГКП) в 1 г, продукт браковке не подлежит. Однако микробиолог предприятия должен усилить контроль за соблюдением санитарно-гигиенических правил на предприятии и обратить внимание на необходимость дополнительного контроля технологических режимов при изготовлении продукта.

7.4.1. Сущность метода

Метод основан на использовании сред обогащения для увеличения роста сальмонелл, их выделения на специальных агаровых средах, с последующим проведением серологической реакции.

7.4.2. Аппаратура, материалы, реактивы

Аппаратура, материалы, реактивы - согласно п.4.

7.4.3. Подготовка к анализу

7.4.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений осуществляют как указано в п.5.1 и 5.2. Посуду и материалы стерилизуют, как указано в п.5.3.

7.4.4. Проведение анализа

Для посева используют то количество продукта, в котором регламентируется отсутствие бактерий рода сальмонелла соответствующими пунктами таблиц 1-9.

Посев продуктов производится с предварительной инкубацией в фосфатном буферном растворе.

Компоненты детских сухих молочных продуктов засевают без предварительной инкубации непосредственно в колбы со средой для селективного обогащения. В случае выявления бактерий рода сальмонелла в готовых сухих молочных продуктах, компоненты, входящие в их состав, повторно исследуются на наличие сальмонелл с предварительной инкубацией продукта по п.7.4.4.1.

7.4.4.1. Посев с предварительной инкубацией.

Взвешивают в стерильных условиях в стакане продукт в количествах, предусмотренных в табл. NN 1-9, и затем для предварительного обогащения навеску асептически переносят в колбу с разбавленным фосфатным буфером (п.6.1.2). Соблюдают соотношение массы продукта и буферного раствора 1:10. Проверяют рН с помощью индикаторной бумаги и доводят активную кислотность смеси до (7,0+-0,2) ед рН, 1Н раствором гидроокиси натрия.

Все тщательно перемешивают. При плохом растворении продукта пробы подвергают механическому встряхиванию на аппарате для встряхивания жидкости (шуттель-аппарат). К приготовленной взвеси продукта добавляют 0,1%-ный водный раствор бриллиантового зеленого (п.6.2.2.9) в количестве 2% к объему (т.е. 20 см3 раствора красителя к 1000 см3 взвеси продукта), перемешивают и выдерживают и термостате при при температуре (37+-1)°С и от 18 до 24 ч.

На следующий день переносят 1,0 см3 выдержанной в термостате смеси в пробирки с 10,0 см3 магниевой среды (п.6.2.3.1) или среды Мюллера (п.6.2.3.3). Пробирки помещают в термостат с температурой (37+-1)°С от 18 до 24 ч.

7.4.5. Обработка результатов

7.5.1. Сущность метода

Метод основан на способности микроорганизмов из рода Staphylococcus расти на питательных средах с повышенным содержанием поваренной соли. Наибольшее санитарно-гигиеническое значение имеет Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), принадлежность к которому, в основном, определяется по способности коагулировать цитратную плазму крови человека или кролика.

7.5.2. Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы - согласно п.4.

7.5.3. Подготовка к анализу

7.5.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений осуществляют как указано в п.п. 5.1; 5.2.

Посуду и материалы стерилизуют как указано в п.5.3.

7.5.4. Проведение анализа

При исследовании продуктов, употребляемых без предварительной термической обработки после восстановления (см. табл.1) навеска продукта должна составлять 10 г; для продуктов, употребляемых с предварительной термической обработкой и компонентов - 1 г (см. табл.1-9). Сухие молочные продукты типа "Детолакт", "Новолакт ММ", "Новолакт-1" и т.п., восстанавливаемые перед употреблением при (37+-1)°С и (70+-1)°С, подвергаются предварительной инкубации в фосфатном буферном растворе перед посевом.

Остальные продукты и компоненты, предусмотренные в табл.1-9, засевают без предварительной инкубации непосредственно в питательную среду.

В случае выявления S. aureus в готовых сухих молочных продуктах, компоненты, входящие в их состав, исследуются на наличие S. aureus с предварительной инкубацией.

7.5.4.1. Взвешивают в стерильных условиях 10, или 1 г продукта и помещают в колбы с 90,0 см3 или 9,0 см3 разбавленного фосфатного буфера. Хорошо размешивают. Смесь выдерживают в термостате при температуре (37+-1)°С от 18 до 24 ч. На следующий день пипеткой переносят 1,0 см3 смеси в пробирку с солевым бульоном (п.6.2.4.1) и помещают в термостат при температуре (37+-1)°С на (24+-1) ч.

Жидкие и пастообразные продукты, подготовленные согласно п.5.1.5 и другие продукты, не подвергающиеся предварительной инкубации, в количестве 1, или 10 г (см3) засевают в пробирки или колбы с солевым бульоном при соотношении продукта и среды 1:10 и помещают в термостат при температуре (37+-1)°С.

7.5.4.2. Через (24+-1) ч производят пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркер (п.6.2.4.3) или ЖСА (желточно-солевой агар) (п.6.2.4.4). Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37+-1)°С от 18 до 48 ч.

S. aureus на среде Байрд-Паркера растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний в диаметре 1-1,5 мм, окруженных зоной просветления среды, шириной 1-3 мм. Около 90% S. aureus, выделенных из пищевых продуктов, и штаммы, образующие энтеротоксин, на агаре типа Байрд-Паркер дают зоны просветления через (24+-1) ч инкубации при (37+-1)°С. Эти колонии не требуют подтверждения в принадлежности к S. aureus и подлежат учету через (24+-1) ч инкубации.

На ЖСА колонии стафилококков имеют форму выпуклых дисков диаметром 2-4 мм, белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды.

Из характерных колоний, подозрительных на стафилококки, готовят мазки-препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. Колонии грамположительных мелких кокков, расположенных в мазке гроздьевидно,отсеивают на сектора чашки Петри или в пробирки со скошенным мясо-пептонным агаром (п.6.1.12), посевы выдерживают в термостате при (37+-1)°С от 18 до 24 ч. Из культур, выросших на МПА, после предварительной проверки мазка на чистоту под микроскопом, ставят реакцию плазмокоагуляции.

7.5.4.3. Постановка реакции плазмокоагуляции.

В пробирку с 0,5 см3 разведенной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, а в другую засевают заведомо коагулазоположительный стафилококк в качестве контроля. Пробирки помещают в термостат при температуре (37+-1)°С. Учитывают результаты через 2-4 часа и оставляют до утра при комнатной температуре для окончательного учета. Ускорение реакции производят за счет использования 3-х и 4-х часовых бульонных культур стафилококков, добавляя их по 0,1 см3 в 0,5 см3 разведенной цитратной плазмы.

Пробирки на свертывание плазмы следует просматривать осторожно, чтобы не разрушить начало образования сгустка.

При учете реакции плазмокоагуляции могут наблюдаться три степени активности фермента коагулазы:

++++ - сгусток плотный;

+++ - сгусток, имеющий небольшой отсек;

++ - сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительным результатом.

7.5.5. Обработка результатов

7.5.5.1. Положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствует о присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта (в 10, или в 1 г (см3).

7.5.5.2. Отрицательная реакция плазмокоагуляции свидетельствует об отсутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта (в 10, или 1 г (см3).

Примечание.

При обнаружении значительного роста коагулазоотрицательных стафилококков в готовых детских сухих молочных смесях, микробиолог должен обратить внимание на санитарно-гигиеническое содержание предприятия, т.к. у детей грудного возраста некоторые варианты коагулазоотрицательных стафилококков (S. epidermidis) также способны вызывать острые стафилококковые энтериты.

7.6.1. Сущность метода

Метод основан на количественном подсчете колоний энтерококков, вырастающих на плотных питательных средах, в состав которых входят ингибиторы (кристаллический фиолетовый, трифенилтетразолий хлористый, антибиотики: пенициллин, стрептомицин, полимиксин), подавляющие развитие других бактерий.

7.6.2. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда и реактивы

Аппаратура, материалы, лабораторная посуда и реактивы - согласно п.4.

7.6.3. Подготовка к анализу

Подготовку проб и приготовление разведений проводят, как указано в п.5.1 и 5.2.

Посуду и материалы стерилизуют, как указано в п.5.3.

7.6.4. Проведение анализа

7.6.4.1. Посев.

Берут по 0,1 см3 жидких продуктов или из первого разведения сухих и пастообразных продуктов и высевают на подсушенную поверхность молочной среды с полимиксином (п.5.2.5.1) в 2-х чашках Петри. Посевной материал тщательно втирают шпателем в поверхность среды. Посевы инкубируют при (37+-1)° С в течение (48+-1)ч.

7.6.4.2. Обработка результатов.

Посевы просматривают. Типичные колонии энтерококков имеют округлую форму, ровные края, блестящую поверхность, диаметр 1,5-2 мм и красную окраску с зоной протеолиза на светло-голубом фоне среды. Подсчитывают все типичные колонии на обеих чашках и среднеарифметическое их число умножают на 10 или 100, соответственно, получая количество энтерококков в 1 г или 1,0 см3 продукта.

Идентификация культур.

Три-пять колоний отсеивают на скошенный мясо-пептонный агар для дальнейшей идентификации. На скошенном агаре посевы культивируют при (37+-1)°С в течение (24+-1) ч.

Из колоний, выросших на скошенном агаре, готовят мазки и окрашивают по Граму. Определяют каталазную активность культуры: на чистое обезжиренное стекло наносят каплю 1%-ного водного раствора перекиси водорода (п.6.2.9.2) и в ней растирают петлю культуры. Если пузырьки газа не выделяются, значит реакция отрицательная. Кроме того, изучаемые культуры засевают в бульоны, содержащие 40% желчи (п.6.2.9.3) и имеющие активную кислотность 9,6 ед рН (п.6.2.9.4). Инкубируют посевы при (37+-1)°С от 18 до 24 ч. Рост изучаемых культур в указанных бульонных средах подтверждают микроскопией мазка, окрашенного но Граму.

Энтерококки - грамположительные кокки, в мазках из жидких сред располагаются в виде коротких или длинных цепочек, с плотных - в виде диплококков или скоплений кокков; растут в бульонах с 40% желчи и при активной кислотности (9,9+-0,3) ед рН, не разлагают перекись водорода, так как не вырабатывают фермент каталазу.

Обнаружение значительного роста энтерококков при посеве исследуемого материала свидетельствует о необходимости контроля за термическим режимом технологического процесса или проведения санитарной обработки оборудования и технологических линий.

7.7.1. Сущность метода

Метод основан на количественном подсчете B.cereus, относящихся к спорообразующим аэробным бациллам, при росте их на плотных питательных средах с антибиотиком и яичным желтком.

7.7.2. Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы - согласно п.4.

7.7.3. Проведение анализа

7.7.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений проводят, как указано в п.5.1 и 5.2.

Посуду, материалы и реактивы стерилизуют, как указано в п.5.3.

7.7.3.2. Посев.

Производят посев по 0,1 см3 разведения сухих молочных продуктов 1:10 (0,01 г продукта), по 0,2 см3 БАДов из разведения 1:10 (0,02 г продукта) на поверхность хорошо подсушенной питательной среды в 2-х чашках Петри. Посевной материал тщательно растирают шпателем. Для посева используют питательные среды по п.6.2.5.1 (среда Донована) или п.6.2.5.3 (солевой полимиксиновый агар).

Посевы инкубируют в термостате при температуре (37+-1)°С от 24 до 96 ч.

7.7.3.3. Обработка результатов.

При отсутствии роста на обеих чашках дают заключение о соответствии детской сухой молочной смеси нормативу за этот показатель. При обнаружении роста изучают морфологию колоний: штаммы В. cereus на солевом полимиксиновом агаре с 2,3,5-трифенилтетраводном хлористым образуют ярко-рубиновые колонии на фоне широкой зоны глубокого равномерного коагулята, колонии в первые часы округлые, выпуклые; в дальнейшем (через 24-48 ч) - распластанные по поверхности агара с изрезанными краями. На среде Донована штаммы B.cereus образуют крупные белые распластанные колонии со слегка изрезанными краями, окруженные широкой зоной глубокого белого равномерного матового коагулята или двойной зоной - коагулята и просветления (лецитиназная активность).

Из типичных колоний готовят мазки и окрашивают но Граму.

В. cereus - грамположительные споровые палочки, в некоторых культурах - грамотрицательные.

7.7.3.4. Идентификация культур.

Пересеивают 3-5 колоний на скошенный агар с последующей инкубацией при температуре (30+-1)°С от 18 до 24 ч.

Проводят микроскопию висячей и раздавленной капли для установления подвижности и посев на среду с маннитом (п.6.2.5.5) и на кровяной агар (п.6.2.5.4). Инкубацию посевов проводят при (30+-1)°С от 24 до 48 ч. Культуру также пересевают в пробирки со средой Кларка (п.6.2.2.5), которую инкубируют при температуре (30+-1)°С в течение (48+-1) ч, для последующей постановки реакции Фогес-Проскауэра.

Постановка реакции Фогес-Проскауэра описана в п.7.3.5.4.

Характерными признаками для В. cereus являются образование зон просветления на кровяном агаре (гемолитическая активность), положительные реакции на лецитиназу и Фогес-Проскауэра, подвижность и отсутствие способности сбраживать маннит.

7.7.3.5. При обнаружении роста, для определения количества В. cereus в исследуемом продукте, количество выросших типичных колоний на чашках умножают на соответствующее разведение и выражают в пересчете на 1 г или 1,0 см3 исследуемого продукта.

7.7.3.6. В продуктах, выработанных с соблюдением технологических правил, при посеве 0,01 г рост В. cereus должен отсутствовать, что соответствует показателю на этот микроорганизм - "менее 100 клеток/г".

При обнаружении роста, микробиолог в заключении указывает подсчитанное количество В. cereus в 1 г продукта.

При несоответствии нормативу только по B.cereus в сухих молочных продуктах типа "Детолакт" (в отдельных случаях от 100 до 200 КОЕ/г), партия однократно не задерживается для реализации. В таких случаях микробиолог проводит исследования на наличие B.cereus в компонентах растительного и животного происхождения и в случае обнаружения в них значительных количеств В. cercus дает рекомендации о возможности и путях использования их в производстве.

Аналогично поступают при обнаружении от 200 до 400 КОЕ/г В. cereus в сухих молочных продуктах типа "Малыш", подвергающихся термической обработке перед употреблением.

7.8.1. Сущность метода

Метод основан на количественном подсчете числа колоний дрожжей и плесневых грибов, вырастающих на плотных питательных средах с антибиотиками при температуре (24+-1)°С в течение 5 суток при посеве исследуемых продуктов.

7.8.2. Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы - согласно п.4.

7.8.3. Проведение анализа

7.8.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений для посева проводят согласно п.5.1 и 5.2.

Посуду, материалы и реактивы стерилизуют, как указано в п.5.3.

7.8.3.2. Посев.

Для определения количества дрожжей и плесневых грибов из каждой пробы делают посев по 1,0 см3 нативного продукта или по 1,0 см3 разведений 1:10 и 1:100 на две чашки Петри. В каждую чашку Петри, с заранее промаркированной крышкой, добавляют не позднее, чем через 15-20 мин 14,0 см3 одной из агаризованных сред: (п.п. 6.2.6.2; 6.2.6.3; 6.2.6.4; 6.2.6.5; 6.2.6.6), охлажденной до 45°С *(7). Среду немедленно тщательно перемешивают и оставляют для застывания.

Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (24+-1)°С в течение 120 ч (5 суток) с предварительным учетом через 3 суток.

Контроль стерильности питательных сред и воздуха проводят, как указано в п.6.2.10.2.

Количество колоний дрожжей и плесневых грибов подсчитывают раздельно на каждой чашке. Колонии дрожжей в указанных средах имеют беловато-желтый цвет, сметанообразную консистенцию, по мере роста и увеличения размеров приобретают перламутровый оттенок и куполообразное возвышение.

Если в посевах на агаризованных средах присутствуют мукоровые, очень быстро растущие грибы, то снятие предварительных результатов необходимо проводить очень осторожно, не допуская того, чтобы споры этих грибов осыпались и дали рост вторичных колоний. Через 5 суток проводят окончательный учет результатов термостатирования посевов. Колонии дрожжей и плесневых грибов разделяют визуально.

Типичные колонии плесневых грибов с поверхности покрыты пушистым мицелием, часто напоминающим вату. Окраска варьирует.

Рост дрожжей на агаризованных средах сопровождается образованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем.

Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

При необходимости для разделения колоний дрожжей и плесневых грибов проводят микроскопические исследования. Для этого из отдельных колоний готовят препараты методом раздавленной капли. На предметное стекло наносят каплю стерильной водопроводной воды. Затем в эту каплю прокаленной иглой вносится часть колонии. Полученная суспензия покрывается покровным стеклом.

Результаты микроскопирования оценивают пользуясь характеристикой дрожжей и плесневых грибов, указанной в табл.12.

Таблица 12

Характеристика дрожжей и плесневых грибов

7.8.3.3. Обработки результатов.

Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен рост дрожжей и плесневых грибов и их присутствие подтверждено микроскопированием, то дают заключение о присутствии этих микроорганизмов в продукте.

Результаты обрабатывают и пересчитывают отдельно для дрожжей и плесневых грибов.

Количество дрожжей и плесневых грибов в 1,0 см3 или в 1 г продукта - (х) в КОЕ вычисляют по формуле:

х=n х 10 (m), где

n - количество колоний, подсчитанных на чашке Петри;

m - число десятикратных разведений.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

7.8.3.4. При обнаружении в 1 г исследуемого продукта количеств дрожжевых и плесневых грибов, превышающих установленные нормативы по этим показателям, партия готового продукта к реализации задерживается для повторного расширенного микробиологического контроля. Отбирают удвоенное количество образцов готовых детских сухих молочных смесей с проведением посева на все микробиологические показатели, указанные в табл.1 Методических указаний. Одновременно производят внеочередной контроль (на содержание дрожжевых и плесневых грибов) по ходу технологического процесса.

7.9.1. Сущность метода

Определение содержания ацидофильных бактерий в продукте проводят методом предельных разведений.

Метод основан на способности молочно-кислых палочек расти в молоке при температуре 37-38°С и образовывать сгусток.

7.9.2. Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы - согласно п.4.

7.9.3. Подготовка к анализу

7.9.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений проводят, как указано в п.5.1 и 5.2.

Подготовку посуды и материалов производят, как указано в п.5.3.

7.9.4. Проведение исследований

7.9.4.1. Из первого разведения исследуемого продукта, приготовленного по п.4.2, готовят последующие - 1:100, 1:1000 и т.д., примерно до 10-го разведения с таким расчетом, чтобы последние из них не содержали ацидофильных палочек.

Из приготовленных разведений исследуемого продукта делают посевы по 1 см3 в стерильное обезжиренное молоко, приготовленное по п.6.2.8.1 (по две пробирки для каждого разведения).

7.9.5. Инкубация

Посевы выдерживают в термостате при температуре (38+-1)°С 3-5 дней. В течение этого времени во всех пробирках, в которых содержатся ацидофильные бактерии, молоко должно свернуться. Из трех последних разведений со свернувшимся обезжиренным молоком готовят микроскопические препараты.

Если при микроскопировании видны палочки, то делается вывод, что образование сгустка произошло за счет ацидофильных палочек, после чего учитывается результат.

7.9.6. Обработка результатов

Для подсчета количества ацидофильных бактерий пользуются табл.13.

Таблица 13

/-----------------------------------------------------------------------\

|Числовая      |Наиболее вероятное  |Числовая       |Наиболее вероятное |

|характеристика|число микробов при  |характеристика |число микробов при |

|              |заражении 2-х па-   |               |заражении 2-х па-  |

|              |раллельных пробирок |               |раллельных пробирок|

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    1         |       2            |     3         |        4          |

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    001       |      0,5           |    120        |       2,0         |

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    002       |       -            |    121        |       3,0         |

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    010       |      0,5           |    122        |        -          |

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    011       |      0,9           |    200        |       2,5         |

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    012       |       -            |    201        |       5,0         |

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    020       |      0,9           |    202        |        -          |

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    021       |       -            |    210        |       6,0         |

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    022       |       -            |    211        |       13,0        |

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    101       |      1,2           |    212        |       20,0        |

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    102       |       -            |    220        |       25,0        |

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    110       |      1,3           |    221        |       70,0        |

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    111       |      2,0           |    222        |       110,0       |

|--------------+--------------------+---------------+-------------------|

|    112       |       -            |               |                   |

\------------------------------------------------------------------------

Составляют числовую характеристику, состоящую из трех цифр, указывающих число пробирок со свернувшимся молоком в трех последних разведениях. Первая цифра числовой характеристики соответствует тому разведению, при котором во всех пробирках молоко свернулось. Следующие две цифры обозначают число пробирок со свернувшимся молоком из двух последующих разведений.

По числовой характеристике находят в таблице наиболее вероятное число микробов, которое умножают на то разведение, с которого начиналась первая цифра числовой характеристики.

За окончательный результат анализа принимают число, которое соответствует количеству клеток ацидофильных бактерий в 1 см3 или 1 г продукта.

Пример. При свертывании молока в двух параллельных пробирках разведения 1:10000, в одной пробирке разведения 1:100000 и отсутствии свертывания в пробирках с последующими разведениями, числовая характеристика будет 210. Она соответствует числу 6 по таблице. Это число необходимо умножить на то разведение, с которого начиналась первая цифра числовой характеристики, т.е. 1х10(4).

Таким образом, количество ацидофильных палочек в 1 см3 или 1 г исследуемого продукта составит 6х10(4).

7.9.7. Определение количества ацидофильных палочек
на твердой питательной среде

7.9.7.1. Из 6, 7 и 8 разведений препарата по 1 см3 вносят в 3 стерильные чашки Петри и заливают предварительно расплавленным и охлажденным до температуры (45+-2)°С агаром с гидролизованным молоком, глюкозой и дрожжевым автолизатом (п.6.2.8.3). Смесь хорошо перемешивают легким вращательным движением чашки. После застывания агара, чашки Петри перевертывают, помещают в термостат с температурой (37,0+-1,0)°С и выдерживают в течение 2-3 суток.

7.9.7.2. На питательной среде колонии молочно-кислых палочек могут быть поверхностные и глубинные. При поверхностном росте колонии более крупные, локонообразные, светлые или зернистые с темным центром. Глубинные колонии - более темные, желтовато-бурые, в виде кусочков ваты ("паучки").

Из изолированных колоний, выросших в последнем разведении и характерных для молочно-кислых бактерий делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Приготовление, окрашивание и микроскопирование препарата проводят по п.7.11.

Клетки молочно-кислых бактерий имеют палочковидную форму, одиночные, часто с выраженными зернами внутри; молодые клетки могут быть темноокрашенные, одиночные или иметь вид цепочек.

7.9.7.3. Подсчет количества клеток ацидофильных палочек в 1,0 см3 или 1 г продукта производят путем умножения числа выросших колоний на соответствующее разведение, а за окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов, полученных в 2-х параллельных посевах.

7.10.1. Сущность метода

Метод основан на способности бифидобактерий расти в питательных средах, разлитых высоким столбиком в пробирках, при температуре (37+-1)°С и образовывать в них через 24-72 часа гвоздикообразные характерные колонии.

7.10.2. Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы - согласно п.4.

7.10.3. Подготовка к анализу

7.10.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений проводят, как указано в п.5.1 и 5.2 с условием обязательной предварительной регенерации (прогревание) буферного раствора, применяемого для разведения продукта, в кипящей водяной бане при 100°С в течение 20 минут с последующим охлаждением до температуры (45+-2)°С.

Подготовку посуды и материалов производят, как указано в п.5.3.

7.10.4. Проведение исследований

7.10.4.1. Из первого разведения исследуемого продукта, приготовленного по п.5.2, готовят последующие - 1:100, 1:1000 и т.д., примерно до 10-го разведения с таким расчетом, чтобы последние из них не содержали бифидобактерий.

Перемешивание продукта производят способом, исключающим попадание пузырьков воздуха. Перемешивание пипеткой путем вдувания и выдувания воздуха не допускается.

7.10.4.2. Перед употреблением кукурузно-лактозную или гидролизатно-молочную среды (п.п.6.2.7.3, 6.2.7.2) следует разогреть в кипящей водяной бане до полного расплавления агара и выдержать при этой температуре не менее 20 минут. Перед посевом среды тотчас следует остудить до температуры (45+-2)°С погружением в холодную воду.

При определении бифидобактерий в смешанных с молочно-кислыми бактериями культурах перед расплавлением в среду вносят стерильный раствор неомицина (п.6.2.7.5).

7.10.4.3. Из приготовленных разведений исследуемого продукта делают посевы по 1,0 см3 в два параллельных ряда пробирок с питательной средой (приготовленной по п.п. 6.2.7.2, 6.2.7.3 или 6.2.7.4 соответственно) и тщательно перемешивают способом, исключающим попадание пузырьков воздуха в питательную среду (например, круговыми движениями руки, имитирующими центрифугирование). Перемешивание пипеткой путем вдувания и выдувания воздуха не допускается. Для каждого посева берут новую пипетку.

7.10.5. Инкубация

Посевы выдерживают в термостате с температурой (38+-1)°С в течение (72+-1) ч. В случае определения бифидобактерий в смешанных с молочно-кислыми бактериями культурах - от 3 до 5 суток. Допускается предварительный учет через (48+-1) ч с последующим окончательным учетом через (72+-1) ч.

7.10.6. Обработка результатов

7.10.6.1. На питательных средах бифидобактерий в последних разведениях образуют изолированные светло-коричневые колонии в виде крупинок, гречишного зерна или дисков, иногда кометообразные, гвоздикообразные.

7.10.6.2. Из изолированных колоний, выросших в последнем разведении и характерных для бифидобактерий, делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Приготовление, окрашивание и микрокопирование препарата проводят по п.7.11.

Клетки бифидобактерий представляют собой грамположительные, слегка изогнутые палочки с раздвоением или утолщением на одном-двух концах, располагаются в мазке группами или поодиночке, в виде китайских иероглифов, могут образовывать короткие цепочки.

7.10.6.3. Подсчет количества клеток бифидобактерий в 1,0 см3 (1 г) продукта производят путем умножения числа выросших колоний на соответствующее разведение. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов, полученных в 2-х параллельных посевах.

Для определения истинного количества бифидобактерий в среде с неомицином результат следует удвоить.

7.11.1. Сущность метода

Метод основан на просмотре окрашенных препаратов, под микроскопом для ориентировочной характеристики микрофлоры молочных продуктов.

7.11.2. Проведение анализа

Для приготовления препарата на чистое предметное стекло наносят петлей небольшую каплю исследуемого материала и распределяют на площади около 1 см2. При исследовании творога детского и пастообразных продуктов, а также агаровой культуры на стекло наносят каплю стерильной воды, вносят в нее петлей продукт, тщательно перемешивают и растирают на площади 1 см2. Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют на пламени горелки и красят метиленовым голубым (п.6.1.9) или раствором карболового кристаллического фиолетового (п.6.1.10).

7.11.3. Ориентировочный состав микрофлоры

Ориентировочный состав микрофлоры исследуемых продуктов представлен в табл.14.

Таблица 14

7.12.1. Сущность метода

Метод основан на способности микроорганизмов, выдержавших стерилизацию, размножаться в стерилизованном молоке при оптимальных режимах термостатирования и вызывать в нем органолептические и физико-химические изменения.

7.12.2. Проведение анализа для питьевых
стерилизованных молока и сливок

Отобранные упаковки со стерилизованным молоком выдерживают при температуре (37+-1)°С в течение 3 суток, а сливками - в течение 5 суток.

Образцы молока, выработанного двухступенчатым способом, кроме того выдерживают при температуре (55+-1)°С в течение 5 суток.

По истечении срока термостатной выдержки образцы с продуктом подвергают внешнему осмотру. При наличии вздутия упаковки или изменении внешнего вида молока в бутылках (наличия сгустка, отстоя сыворотки, наличия хлопьев молока и др.) упаковки считают не отвечающими требованиям промышленной стерильности и отмечают в книге анализов.

Упаковки без внешних дефектов вскрывают, стерилизованное молоко или сливки анализируют органолептически. Продукт отвечает требованиям промышленной стерильности, если не установлено изменений консистенции и вкуса продукта.

Кроме того, определяют кислотность в термостатированных и нетермостатированных образцах, проводят микробиологические исследования путем микроскопирования и посева 1 см3 термостатированного образца для определения общего количества бактерий.

7.12.3. Обработка результатов

Продукт отвечает требованиям промышленной стерильности, если кислотность молока увеличилась не более чем на 2°Т, в микроскопическом препарате отсутствуют клетки бактерий, а общее количество бактерий в 1 см3 не превышает 10.