Глава 5. Методы исследований безопасности

Глава 5.
Методы исследований безопасности

I. Методы определения микотоксинов

Для обнаружения, идентификации и количественного определения микотоксинов используют следующие методы:

- двумерную и одномерную ТСХ (для серийных определений);

- ВЭЖХ с УФ-фотометрическим и флуориметрическим детектированием (для серийных и арбитражных анализов).

Специфическое оборудование и материалы

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Ротационный испаритель с ловушкой, модель ИР-2М (завод "Химлабприбор"), или аналогичный.

Мельница лабораторная электрическая ЭМ-ЗА, ТУ 46-22-236-79, или аналогичная.

Облучатель настольный ультрафиолетовый, снабженный светофильтром с максимумом пропускания при длине волны 365 нм.

Жидкостный хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5 см3/мин; колонка и предколонка с силикагелем или с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель-С18), или с силикагелем, химически связанным с алкилнитрилом, с размером частиц 5 мкм; длина колонок - 25 см, предколонок - 4,5 см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см; ультрафиолетовый детектор с переменной длиной волны; флуориметрический детектор; регистрирующий потенциометр (самописец) или интегратор.

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный, позволяющий проводить измерения при длине волны 275-360 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%.

Кюветы кварцевые с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Шкаф сушильный, обеспечивающий нагрев до 150°C.

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая скорость вращения 4 000 об/мин, стаканы центрифужные стеклянные вместимостью 200 см3.

Насос водоструйный лабораторный, ГОСТ 25336.

Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками, например стеклянный четырехугольный сосуд размером 195 х 195 х 200 мм завода "Дружная горка".

Пластинки для ТСХ "Силуфол" размером 15x15 или 20 х 20 см (Чехия) или подобные.

Распылитель стеклянный с грушей.

Воронки делительные ВД 2-250 или ВД 2-500, ГОСТ 25336.

Колонки стеклянные хроматографические 230 х 15 и 300 х 22 мм.

Силикагель L для колоночной хроматографии с размером частиц 100-160 мкм, "Lachema" (Чехия).

Флоризил, 60-100 меш, "Merk" (Германия).

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-71.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3543-74.

Бензол, ч.д.а., ГОСТ 5955-75.

Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-73.

1,4-Диоксан, ч.д.а., ГОСТ 10455.

Изопропиловый спирт (пропанол-2), ч.д.а., ТУ 6-09-402-76.

Метанол, ч., ГОСТ 6995-77.

Спирт этиловый ректификат, ТУ 6-09-1710-77.

Толуол, ч., ГОСТ 5789-78.

Хлороформ медицинский, ГОСТ 3160-51, или технический, ГОСТ 20015.

Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), ч., ГОСТ 22300-76.

Эфир диэтиловый медицинский, ГОСТ 6265-52.

Кислота азотная, ч. д. а., ГОСТ 4461-67.

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 4461-67 постановлением Госстандарта СССР от 22 декабря 1977 г. N 2995 введен в действие с 1 января 1979 г. ГОСТ 4461-77

Кислота лимонная, 1-водная, ч.д.а., ГОСТ 3652-29.

Кислота муравьиная, ч. д. а., ГОСТ 5848-73.

Кислота серная, ч., ГОСТ 4204-77.

Кислота соляная, х. ч., ГОСТ 3118.

Кислота уксусная, ч. д. а., ГОСТ 61-75.

Алюминия оксид нейтральный по Брокману 11 для колоночной хроматографии, "Reanal" (Венгрия), номер по каталогу 01125 или алюминия оксид для хроматографии, ТУ 6-09-3916-75.

Алюминий хлористый, 6-водный, х.ч., ГОСТ 3759-75.

Бензидин, ч. д. а., раствор в муравьиной кислоте концентрацией 5 г/дм3.

Йод, ч., ГОСТ 4159, раствор в этиловом эфире концентрацией 250 г/дм3.

Калий хлористый, х. ч., ГОСТ 4234-77.

Калий железосинеродистый 3-водный, х. ч., ГОСТ 4207, водный раствор концентрацией 150 г/дм3 (раствор Карреза 1).

Цинк уксуснокислый, 2-водный, х. ч., ГОСТ 5823, водный раствор концентрацией 300 г/дм3 (раствор Карреза 2).

Калий марганцовокислый, х. ч., ГОСТ 20490, водный раствор концентрацией 15 г/дм3.

Натрия сульфат безводный, х. ч., ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, х. ч., ГОСТ 4233-66.

Натрий углекислый кислый (гидрокарбонат), х. ч., ГОСТ 4201-79, водный раствор концентрацией 50 г/дм3.

Прочный синий В-соль (диазоль синий С) для гистологии ("Chemapol", Чехия), водный раствор концентрацией 10 г/дм3.

Свинец уксуснокислый, х. ч., ГОСТ 1027-67, водный раствор концентрацией 150 г/дм3.

Серебро азотнокислое, ч., ГОСТ 1277, водный раствор концентрацией 250 г/дм3.

Уголь активированный Р.72.270.3.

Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.

Приготовление и хранение стандартных растворов микотоксинов

Чистоту и аутентичность стандартных препаратов микотоксинов определяют с помощью УФ-спектрофотометрии (табл. 47) и хроматографических методов (ТСХ, ВЭЖХ).

Расчет концентрации стандартных растворов проводят по данным УФ-спектрофотометрии. Данные о коэффициентах молярной экстинкции микотоксинов в максимумах поглощения в УФ-спектре приведены в табл. 47.

Приготовление и расчет концентрации стандартных растворов микотоксинов

Для приготовления стандартных растворов микотоксинов рекомендуется использовать растворители, очищенные перегонкой. Данные о растворителях и концентрациях стандартных и рабочих растворов микотоксинов приведены в табл. 48.

В мерную колбу вместимостью 100 или 250 см3 помещают навеску микотоксина (1-10 мг), взятую с точностью до 0,01 мг, приливают нужное количество ацетонитрила согласно таблице 33 или 20-30 см3 бензола, тщательно перемешивают до полного растворения вещества, доводят бензолом до метки и измеряют оптическую плотность по данным УФ-спектрофотометрии против соответствующего растворителя.

При необходимости измерения концентрации стандартного раствора в метаноле 3 см3 бензольного или бензол-ацетонитрильного раствора переносят в чистую пробирку, растворитель упаривают в токе азота досуха, к остатку добавляют 3 см3 метанола и измеряют оптическую плотность полученного метанольного раствора.

Таблица 47

Коэффициенты молярной экстинции микотоксинов

Микотоксины	Молекулярная масса	Длина волны максимума поглощения, нм	Коэффициент молярной экстинкции Е, см2/моль
			Растворитель
			метанол	бензол-ацетонитрил
1	2	3	4	5
Афлатоксины:
В1	312,3	223	22100
		265	12400
		362*	21800	19800**
В2	314,3	223	18600
		265	12100
		362*	24000	20900**
G1	328,3	242	9600
		265	9600
		362*	17700	17100**
G2	330,3	242	10500
		265	9000
		362*	19300	18200**
M1	328,3	226	23100
		265	11600
		357*	19000	18815**
Стеригматоцистин	324,1	326*	15310	15200**
	-	277	3040
		246	32870
Дезоксиниваленол	296,0	218*	4500**
Зеараленон	318,1	236	28850
		274*	12710**
		316	5840
Охратоксин А	403,1	214	37200
		333*	6400	5550***
Патулин	154,0	276*	14500**

______________________________

* Длины волн, используемые для определения концентрации стандартных растворов.

** Растворитель, используемый для определения концентрации стандартного раствора.

*** Для охратоксина А используется смесь бензол - уксусная кислота (99:1).

Рассчитывают концентрацию микотоксина в стандартных растворах по формуле:

                              D х М х 1000

                         С = -------------- , где

                                 L x E

     С - концентрация исследуемого раствора, мкг/см3 или нг/мкл;

     D - оптическая плотность раствора;

     М - молекулярная масса микотоксина (табл. 47);

     Е - коэффициент молярной экстинкции (табл. 47);

     L - толщина слоя раствора, см.

Рабочие растворы стандартов готовят путем разбавления соответствующих стандартных растворов, для чего необходимую аликвоту рабочего раствора микотоксина доводят до соответствующего объема бензолом или смесью бензол-ацетонитрил согласно табл. 48. Например, для приготовления рабочего раствора смеси афлатоксинов В_1, В_2, G_1 и G_2 с концентрациями 1,0, 0,5, 0,4 и 0,2 мкг/см3 соответственно в мерную колбу 50 см3 помещают 5,0 см3 стандартного раствора афлатоксина B_1, 2,5 см3 раствора В_2, 2,0 см3 раствора G_1 и 1,0 см3 раствора G_2, затем доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил (98:2). Для приготовления стандартного раствора афлатоксина M_1 с концентрацией 0,2 мкг/см3 в мерную колбу на 50 см3 помещают 1 см3 стандартного раствора афлатоксина M_1 и доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил (9:1).

Таблица 48

Стандартные и рабочие растворы микотоксинов

Микотоксины	Растворители для приготовления стандартного раствора	Концентрации микотоксинов в растворах, мкг/см3
Микотоксины	Растворители для приготовления стандартного раствора	стандартном	рабочем
Афлатоксины:
B_1	Бензол-ацетонитрил (98:2)	10	1,0
B_2		10	0,5
G_1		10	0,4
G_2		10	0,2
M_1	Бензол-ацетонитрил (9:1)	10	0,2
Стеригматоцистин	Бензол	10	10,0
Дезоксиниваленол	Бензол-ацетонитрил (5:1)	25	10,0
Зеараленон	Бензол	100	10,0
Охратоксин А	Бензол-уксусная кислота (99:1)	50	5,0
Патулин	Бензол-ацетонитрил (9:1)	10	10,0

Если используют расфасованные во флаконы кристаллические стандарты микотоксинов, полученные от фирм-поставщиков, поступают следующим образом: во флакон с веществом добавляют, согласно табл. 48, необходимое количество растворителя и тщательно перемешивают до полного растворения микотоксинов, содержимое флакона количественно переносят в мерную колбу с объемом, необходимым для получения концентрации стандартного раствора микотоксина, указанной в соответствующей колонке табл. 48. Флакон тщательно промывают несколькими порциями растворителя, каждый раз перенося содержимое флакона в мерную колбу, затем доводят объем до метки растворителем. Измеряют концентрацию полученного раствора по данным УФ-спектрофотометра, как описано выше.

Хранение стандартных растворов микотоксинов

Стандартные растворы микотоксинов следует хранить в стеклянной посуде с притертыми пробками в темном прохладном месте (при температуре около 0°C) до одного года и использовать для приготовления рабочих стандартных растворов.

Перед употреблением в работе стандартные растворы следует довести до комнатной температуры и только после этого открывать пробки.

В процессе хранения стандартных растворов вследствие испарения растворителей могут происходить некоторые изменения их концентраций. По этой причине следует проводить их систематический контроль (1-2 раза в квартал) как описано выше.

1. Метод обнаружения, идентификации и определения содержания афлатоксинов в БАД на зерновой и зернобобовой основе с помощью тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии

Экстракция

Отобранную пробу измельчают в течение 1-2 мин в кофемолке или лабораторной мельнице. Навеску 25 г измельченного БАД помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см3, тщательно перемешивают с 25 см3 10% раствора хлорида натрия. Добавляют 0,0125 см3 стандартного раствора афлатоксина В_2 (внутренний стандарт), что соответствует загрязнению пробы афлатоксином на уровне 1 ПДК, перемешивают. Добавляют 100 см3 ацетона и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбирают 50 см3 фильтрата.

Очистка экстракта

К 50 см3 фильтрата добавляют 20 см3 15% раствора ацетата свинца и 30 см3 дистиллированной воды, перемешивают и оставляют на 10 мин в темноте. Отфильтровывают образовавшийся осадок через бумажный складчатый фильтр, отбирают 80 см3 фильтрата. Встряхивают в делительной воронке с гексаном (2 х 30 см3), каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой. Водно-ацетоновый слой экстрагируют хлороформом (1 раз 40 см3, 2 раза 30 см3 смеси хлороформ-ацетон 3:1). Объединенные хлороформные экстракты помещают в плоскодонную колбу на 250 см3, для удаления воды добавляют 5-7 г безводного сульфата натрия, встряхивают и оставляют на 30 мин в темноте. Высушенный раствор фильтруют через химическую воронку с комочком ваты в грушевидную колбу, сульфат натрия промывают 10 см3 хлороформа, добавляя смыв к фильтрату. Хлороформный экстракт упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток растворяют в 0,4 см3 смеси бензол-ацетонитрил (98:2) - раствор А и анализируют с помощью ТСХ.

Обнаружение афлатоксинов с помощью одномерной ТСХ

Пластинку для ТСХ ("Силуфол") размечают тонкими карандашными линиями в соответствии с рис. 28. На горизонтальной линии, проведенной в 1,5 см от нижнего края пластинки, наносят с помощью микрошприца в 2 см друг от друга по 0,002, 0,005 и 0,01 см3 рабочих растворов афлатоксина B_1 (2, 5, и 10 нг соответственно) и афлатоксина В_2 (1, 2,5 и 5 нг соответственно) или рабочего раствора смеси афлатоксинов B_1, B_2, G_1 и G_2. На расстоянии 1 см между пятнами стандартов наносят 0,01 и 0,02 см3 раствора А. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир-метанол-вода (94:4,5:1,5) и развивают пластинку до достижения фронтом растворителя линии, проведенной в 1 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают из камеры, сушат на воздухе 5 мин и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по хроматографической подвижности и цвету флуоресценции пятнам стандартов афлатоксинов, свидетельствует о возможном наличии афлатоксинов в БАД. Наличие пятна внутреннего стандарта свидетельствует о правильном извлечении афлатоксинов из пробы.

Тесты, подтверждающие наличие афлатоксинов в БАД

Тест первый

Для подтверждения наличия афлатоксинов ТСХ-пластинку опрыскивают раствором азотной кислоты в воде (1:2) и рассматривают ее в длинноволновом УФ-свете. Если цвет флуоресценции стандартов афлатоксинов изменился с синего (B_1, В_2) или сине-зеленого (G_1, G_2) на желтый, а цвет флуоресценции пятен экстракта на желтый не изменился, то афлатоксины в пробе отсутствуют. Если же цвет флуоресценции пятен экстракта также изменился на желтый, то это служит подтверждением возможного наличия афлатоксинов в БАД.

Тест второй

На стеклянную пластинку 20 х 20 см наносят 2-4 см3 5-10%-ного раствора йода в эфире, распределяют его по всей поверхности и дают испариться. Над ТСХ-пластинкой на расстоянии 0,5-1 см помещают пластинку с тонким слоем йода и подвергают ее воздействию паров йода в течение 1-2 мин. Затем пластинку рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Сохранение цвета и интенсивности флуоресценции пятен стандартов и соответствующих им пятен экстракта подтверждает возможное наличие афлатоксинов в БАД.

Подтверждение наличия афлатоксинов и количественное определение афлатоксина В_1 с помощью двумерной ТСХ

Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями согласно рис. 29. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев наносят 0,02 см3 раствора А, в правом верхнем углу наносят 0,005 см3 рабочего раствора смеси афлатоксинов или рабочих растворов афлатоксинов B_1 и В_2. В левом нижнем углу на расстоянии 1, 2 и 3 см от левого края и 1,5 см от нижнего края пластинки наносят 0,002, 0,004 и 0,006 см3 рабочего ратвора смеси афлатоксинов или рабочих растворов афлатоксинов B_1 и В_2. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир-метанол-вода (94:4,5:1,5) и развивают пластинку в первом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 мин, затем развитие пластинки проводят во втором направлении в системе хлороформ-ацетон-вода (90:10:1). После достижения фронтом растворителя карандашной линии ее извлекают, сушат на воздухе и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение афлатоксинов в растворе А производят аналогично описанному выше. В случае подтверждения наличия афлатоксинов сравнивают интенсивность флуоресценции пятна стандарта B_1 с пятном афлатоксина B_1 в растворе А и определяют количество вещества в пятне. Расчет содержания афлатоксина В_1 в образце производят по формуле:

                       V  x V  x V  x m

                        1    3    5

                 С = ---------------------------, где

                      10 x K x V  x V  x V  x M

                                2    4    6

     С  - концентрация афлатоксина B_1 в образце, мг/кг;

     V  - объем водно-ацетоновой смеси для экстракции, см3 (125 см3);

     V  - объем водно-ацетонового фильтрата, взятый для анализа, см3

      2   (50 см3);

     V  - объем водно-ацетонового фильтрата и раствора ацетата свинца, см3

      3   (100 см3);

     V  - объем   водно-ацетонового   фильтрата   после  очистки ацетатом

      4   свинца, см3 (80 см3);

     V  - объем экстракта перед ТСХ (раствор А), см3 (0,4 см3);

     V  - объем экстракта (раствор А), наносимый на пластинку, см3

      6   (0,02 см3);

     М  - навеска образца, взятая для анализа, г (25 г);

     m  - масса афлатоксина B_1 в V_6 см3 экстракта, оцененная по ТСХ, нг;

     К  - степень извлечения афлатоксина B_1 по табл. 50.

При приведенных в скобках объемах и навесках формула содержания афлатоксина B_1 выражается следующим образом:

                     С = 0,25 х ---, мг/кг

К

Если интенсивность флуоресценции афлатоксина B_1 в экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта, соответствующего 0,006 см3 рабочего раствора (6 нг афлатоксина B_1), на пластинку следует нанести либо меньшее количество экстракта (уменьшить объем V_6), либо разбавить раствор А смесью бензолацетонитрил (98:2) (увеличить объем V_5), внеся соответствующие коррективы в расчетную формулу.

По интенсивности флуоресценции внутреннего стандарта можно оценить степень извлечения афлатоксинов из пробы.

Очистка экстракта перед ВЭЖХ

В случае анализа экстракта на содержание афлатоксинов методом ВЭЖХ необходимо произвести его очистку с помощью колоночной хроматографии. На дно стеклянной колонки размером 230 х 5 мм помещают кусочек ваты, присыпают безводный сульфат натрия (толщина слоя 5 мм), заливают суспензию 2 г силикагеля в бензоле и, не давая бензолу стечь (колонка закрыта снизу), насыпают слой безводного сульфата натрия (20 мм). Дают бензолу стечь и на колонку наносят экстракт образца (раствор А). Грушевидную колбу из-под экстракта ополаскивают смесью бензол-ацетонитрил (98:2) 2 раза по 0,3 см3 и раствор наносят на колонку, бензольный элюат отбрасывают. Колонку элюируют 60 см3 смеси хлороформ-ацетон (9:1), элюат фильтруют через бумажный или капроновый фильтр, упаривают досуха на ротационном испарителе, остаток растворяют в 0,4 см3 смеси бензол-ацетонитрил (98:2) (очищенный раствор А) и анализируют с помощью ВЭЖХ.

Обнаружение и количественное определение афлатоксинов В_1, В_2, G_1 и G_2 с помощью ВЭЖХ

Условия и параметры хроматографического анализа приведены в табл. 49.

Таблица 49

Условия хроматографического анализа афлатоксинов

Сорбент	Подвижная фаза	Коэффициент емкости, К' для
Сорбент	Подвижная фаза	В_1	В_2	G_1	G_2	М_1
Силикагель	Эфир-метанол-вода, 95:4:1	1,1-1,5	1,8-2,1	2,2-2,5	3,3-3,6	2,6-2,9
Силикагель	Эфир-метанол-вода, 90:8:2	0,9-1,3	1,2-1,5	1,4-1,7	1,8-2,1	1,4-1,7
Силикагель	Толуол-этилацетат-85% муравьиная кислота, 80:40:9,5	1,2-1,5	1,8-2,1	2,0-2,3	3,1-3,4	3,0-3,3

Время удерживания токсина на колонке при конкретных условиях анализа целесообразно выражать через коэффициент ее емкости, средние значения которого приведены в данной табл. 49. Коэффициент емкости характеризует удерживание анализируемого компонента (афлатоксина) в единицах мертвого объема колонки и определяется по формуле:

                                T  - T

                                 1    0

                          K' = ---------, где

     К' - коэффициент емкости данной колонки;

     Т  - мертвый     объем    системы,  соответствующий  времени  выхода

      0    растворителя;

     T  - время удерживания афлатоксина.

Рекомендуется использовать перегнанные метанол, толуол, этилацетат и дистиллированную воду. Эфир перед использованием пропускают через колонку с оксидом алюминия. Все растворители необходимо предварительно отфильтровать.

Для достижения необходимого предела обнаружения при ВЭЖХ афлатоксинов групп В, G и М с использованием подвижной фазы эфир-метанол-вода необходимо заполнить кювету флуориметрического детектора силикагелем типа "Силасорб 600" с размером частиц 5-8 мкм.

Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 360 нм (или устанавливают соответствующий фильтр на линии возбуждения при работе с флуориметрическим детектором без монохроматора), на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания от 400 или 420 нм. Входное напряжение самописца - 10 мВ, чувствительность детектора устанавливают таким образом, чтобы 1-2 нг афлатоксина B_1 соответствовало отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы.

Для калибровки прибора по флуориметрическому детектору в инжектор с помощью микрошприца вводят 0,001 см3 рабочего раствора смеси стандартов для ВЭЖХ или по 0,001 см3 рабочих растворов афлатоксинов B_1 и В_2 (соответствует 1,0 нг афлатоксина В_1, 0,5 нг В_2, 0,4 нг G_1 и 0,2 нг G_2) и затем 0,002 см3 рабочего раствора (2,0 нг В_1, 1,0 нг В_2, 0,8 нг G_1 и 0,4 нг G_2). Для каждого количества афлатоксинов определяют высоту пика. Рассчитывают калибровочные коэффициенты для афлатоксинов по следующей формуле:

                               C x h

                          K = --------, где

                               C  x h

     К  - калибровочный коэффициент для афлатоксинов B_1, G_1 или G_2;

     С  - концентрация афлатоксинов B_1, G_1 или G_2 в рабочих растворах,

          мкг/см3;

     С  - концентрация афлатоксина В_2 (внутренний  стандарт)  в  рабочем

      1   растворе, мкг/см3;

     h  - высота пика афлатоксина В_2 (внутренний стандарт), мм;

     h  - высота пика афлатоксина В_1, G_1 или G_2, мм.

При высоких уровнях загрязнения БАД афлатоксинами (свыше 0,1 мг/кг по афлатоксину B_1) возможно использование также ВЭЖХ с УФ-детектором. Калибровку прибора по УФ-детектору проводят так же, как в случае флуориметрического детектора, вводя в петлю инжектора 0,010, 0,015 и 0,020 см3 рабочего раствора (соответствует 10, 15 и 20 нг афлатоксина B_1; 5, 7,5 и 10 нг афлатоксина В_2; 4,6 и 8 нг G_1; 2, 3 и 4 нг G_2).

В инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 0,02 см3 раствора А (20 мкл). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с афлатоксином B_1 (В_2, G_1, G_2); определяют его высоту (h).

Расчет концентрации афлатоксинов проводят по формуле:

                              C   x h х V

                               ст

                       C = K -------------, где

                                h  x m

     С   - концентрация афлатоксина в БАД, мг/кг;

     К   - калибровочный коэффициент для афлатоксинов B_1 (или G_1, G_2);

     h   - высота пика афлатоксинов В_1 (или G_1, G_2);

     h   - высота пика афлатоксина В_2 (внутренний стандарт), внесенный в

      1    пробу, см3;

     С   - концентрация    афлатоксина    В_2   (внутренний  стандарт)  в

      ст   стандартном растворе, мкг/см3, (см. табл. 48);

     V   - объем стандартного раствора афлатоксина В_2 (внутренний

           стандарт), внесенный в пробу, см3;

     m   - навеска образца, взятая для анализа, г.

Если пик афлатоксина выходит за пределы шкалы самописца, анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно, уменьшая объем вводимого в инжектор раствора экстракта или разбавляя раствор очищенного экстракта смесью бензол-ацетонитрил (98:2). При необходимости дополнительного подтверждения проводят совместную ВЭЖХ экстракта со стандартом афлатоксинов.

Таблица 50

Относительные допустимые внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения результатов определения, величина предела определения и степень извлечения для методов определения микотоксинов B_1

Загрязнитель	Уровень загрязнения, г/кг	Метод	Rs_r, %	RS_R, %	Rr, %	RR, %	Предел определения, мг/кг	Степень извлечения, %
	0,02	ТСХ	26	50	73	140	0,001	80
		ВЭЖХ	7	14	20	40	0,00015	70
	0,003	ТСХ	38	59	106	166	0,001	75
		ВЭЖХ	13	23	36	64	0,00015	80

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), а также предел определения по данным авторов методов анализа микотоксинов В_1 и М_1 приведены в табл. 50, в которой приведены также относительные внутрилабораторные (Rs_r) и межлабораторные (RS_R) среднеквадратичные отклонения и средняя степень извлечения микотоксинов.

2. Метод обнаружения, идентификации и определения содержания охратоксина А

Экстракция

Навеску 25 г отобранной измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см3, добавляют 12,5 см3 1% раствора уксусной кислоты в воде и 125 см3 хлороформа. Встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр вместимостью 100 см3, отбирают 50 см3 фильтрата.

Очистка экстракта

В делительную воронку переносят 50 см3 фильтрата, добавляют 35 см3 3% раствора гидрокарбоната натрия в смеси метанол-вода (1:4). Встряхивают, после разделения слоев верхний водный слой отделяют. Нижний хлороформный слой экстрагируют (2 раза по 35 см3) водно-метанольным раствором гидрокарбоната натрия. Объединенные водные экстракты встряхивают в делительной воронке с хлороформом (2 х 25 см3), каждый раз после разделения слоев отбрасывая нижний хлороформный слой. Водный экстракт подкисляют раствором серной кислоты в воде с концентрацией 2 моль/дм3 до pH 2-3 по универсальной индикаторной бумаге (примерно 9,5-10 см3 раствора серной кислоты). Подкисленный водный раствор немедленно экстрагируют в делительной воронке хлороформом (1 раз по 50 см3 и 2 раза по 25 см3). Объединенные хлороформные экстракты сушат безводным сульфатом натрия (10-12 г) в течение 0,5 ч. Раствор порциями фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в грушевидную колбу, осушитель промывают 15 см3 хлороформа, который также фильтруют в ту же колбу, и раствор упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40-45°C. Остаток растворяют в 0,4 см3 смеси бензолуксусная кислота (99:1) для проведения ТСХ анализа или в 0,4 см3 метанола для проведения анализа с помощью ВЭЖХ (раствор А).

Обнаружение и количественное определение охратоксина А с помощью двумерной ТСХ

Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слой силикагеля, согласно рис. 29. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 0,02 см3 раствора А, в правом верхнем углу наносят 0,002 и 0,004 см3 рабочего раствора охратоксина А (10 и 20 нг соответственно). В левом нижнем углу пластинки наносят 0,001; 0,003 и 0,005 см3 рабочего раствора охратоксина А (5; 15 и 25 нг охратоксина А соответственно).

Пластинку помещают в хроматографическую камеру для ТСХ со смесью эфиргексан-хлороформ-муравьиная кислота (30:30:30:1) и элюируют в первом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки.

Пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе 5 мин. Затем проводят элюирование во втором направлении в системе толуол-этилацетат-муравьиная кислота (55:35:10). После достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 3,5 см от верхнего края пластинки, ее извлекают из камеры и сушат на воздухе.

Затем пластинку рассматривают в длинноволновом УФ-свете. В этих условиях пятна охратоксина А флуоресцируют зелено-синим цветом. Пластинку опрыскивают насыщенным раствором карбоната натрия в воде и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Цвет флуоресценции охратоксина А должен измениться на синий. Обнаружение на пластинке пятна, соответствующего по цветам флуоресценции и хроматографической подвижности в двух системах растворителей пятнам стандарта охратоксина А, свидетельствует о наличии охратоксина А в образце. Сравнивая интенсивность флуоресценции разных количеств стандарта охратоксина А с интенсивностью флуоресценции пятна охратоксина А в образце, оценивают количество нг охратоксина А в нанесенном на пластинку объеме раствора А.

Концентрацию охратоксина А в образце рассчитывают по формуле:

                                 V  x V  x m

                                  1    3

                    C = C = ----------------------- , где

                            10 x K x V  x V  x M

                                      2    4

     С  - концентрация охратоксина А в образце, мг/кг;

     V  - объем хлороформа для экстракции образца, см3 (125 см3);

     V  - объем     хлороформного  фильтрата,  взятый  для  анализа,  см3

      2   (50 см3);

     V  - объем экстракта для ТСХ (раствор А), см3 (0,4 см3);

     V  - объем экстракта (раствора А),   нанесенный  на  пластинку,  см3

      4   (0.02 см3);

     m  - количество охратоксина А в пятне, оцененное по ТСХ, нг;

     М  - навеска образца, взятая для анализа, г (25 г);

     К  - степень извлечения охратоксина А по табл. 51.

При приведенных в скобках объемах и навесках формула концентрации охратоксина А в образце выражается следующим образом:

                       С = 0,2 х ---, мг/кг.

К

Если интенсивность флуоресценции пятна охратоксина А в экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта, соответствующего 0,005 см3 стандартного раствора (25 нг охратоксина А), то на пластинку следует нанести либо меньшее количество экстракта (уменьшить объем V_4), либо разбавить раствор А смесью бензолуксусная кислота 99:1 (увеличить объем V_3), повторно провести ТСХ и внести соответствующие коррективы в расчетную формулу.

Обнаружение и количественное определение охратоксина А с помощью ВЭЖХ

Приготовление стандартного раствора охратоксина А для ВЭЖХ

0,2 см3 стандартного раствора охратоксина А концентрацией 50 мкг/см3 помещают в мерную колбу на 10 см3, растворитель удаляют в токе азота, остаток растворяют в метаноле и доводят метанолом до метки. Получают стандартный раствор охратоксина А для ВЭЖХ концентрацией 1 мкг/см3 (1 нг/мкл).

Количественное определение охратоксина А с помощью обращеннофазной ВЭЖХ

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза метанол-вода-уксусная кислота (75:25:1,5), расход подвижной фазы - 1 см3/мин. Рекомендуется использовать перегнанный метанол и бидистиллированную воду, фильтруя их через бумажный складчатый фильтр перед использованием. Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 330-333 нм (или устанавливают соответствующий фильтр на линии возбуждения при работе с флуориметрическим детектором без монохроматора), на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с границей пропускания от 415-420 нм. Входное напряжение самописца 10 мВ, чувствительность детектора устанавливают таким образом, чтобы 5 нг охратоксина А соответствовало отклонение пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы.

Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят 0,002; 0,003 и 0,005 см3 (2; 3 и 5 нг) рабочего раствора охратоксина А для ВЭЖХ. Для каждого количества введенного охратоксина А определяют высоту пика. При описанных выше условиях коэффициент емкости (К') для охратоксина А составляет примерно 1,9-2,5. В инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 0,02 см3 раствора охратоксина А в метаноле. При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, определяют его высоту (h).

Расчет концентрации охратоксина А в образце производят по формуле:

                                V  x V  x m x h

                                 1    3

                    C = C ----------------------------,    где

                           10 x K x V  x V  x M x h

                                     2    4        ст.

     С   - концентрация охратоксина А в образце, мг/кг;

     V   - объем хлороформа для экстракции образца, см3 (125 см3);

     V   - объем    хлороформного  фильтрата,  взятый  для  анализа,  см3

      2    (50 см3);

     V   - объем экстракта (раствор А) перед ВЭЖХ, см3 (0,4 см3);

     V   - объем экстракта  (раствор  А),  введенный  в  хроматограф, см3

      4    (0,02 см3);

     m   - масса стандарта охратоксина А, введенного в хроматограф, нг;

     h   - высота пика, соответствующая данной массе стандарта, мм;

      ст

     h   - высота пика охратоксина из образца, мм;

     М   - навеска образца для анализа, г (25 г);

     К   - степень извлечения охратоксина А по табл. 51.

Если пик охратоксина А в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно после разбавления экстракта (раствор А) метанолом (после увеличения объема V_3).

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), а также предел определения по данным авторов методов анализа охратоксина А приведены в табл. 51, в которой приведены также относительные внутрилабораторные (Rs_r) и межлабораторные (RS_R) среднеквадратичные отклонения и средняя степень извлечения микотоксинов.

Таблица 51

Уровень загрязнения, мг/кг	Метод	Rs_r, %	RS_R, %	Rr, %	RR, %	Предел определения, мг/кг	Степень извлечения, %
0,1	ТСХ	26	43	73	120	0,015	90
	ВЭЖХ	9	19	25	53	0,0013	90
0,03	ТСХ	34	50	95	140	0,015	90
	ВЭЖХ	19	24	53	67	0,0013	90

3. Метод обнаружения, идентификации и определения содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) и зеараленона в БАД на зерновой основе

Экстракция

Навеску 25 г измельченной отобранной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см3, добавляют 125 см3 смеси ацетонитрил-вода (84:16). Встряхивают на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр. Отбирают 25 см3 фильтрата для анализа на дезоксиниваленол и 50 см3 фильтрата для анализа на зеараленон.

Обнаружение, идентификация и определение содержания дезоксиниваленола в экстракте

Очистка экстракта

В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек ваты, насыпают 0,75 г порошка активированного угля и сверху - слой 0,75 г оксида алюминия.

Над слоем оксида алюминия помещают кусочек ваты. Осторожно наливают в колонку 25 см3 экстракта, соответствующие 5 г исходного образца. Отбирают элюат и, не давая колонке просохнуть, добавляют 10 см3 смеси ацетонитрил-вода (84:16).

Объединенные элюаты фильтруют через бумажный складчатый фильтр в грушевидную колбу на 50 см3, бумажный фильтр промывают 5-10 см3 изопропилового спирта в ту же колбу и фильтрат упаривают на ротационном испарителе до объема 5-7 см3. Добавляют около 20 см3 изопропилового спирта и повторно упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток в колбе после упаривания не должен содержать капель воды. Остаток растворяют в 0,2 см3 смеси бензол-ацетонитрил (5:1) и плотно закрывают стеклянной пробкой (раствор А). Для обращеннофазной ВЭЖХ остаток растворяют в 0,2 см3 ацетонитрила (раствор A_1).

Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола с помощью одномерной ТСХ

Пластинку "Силуфол" размечают в соответствии с рис. 28. На линию, проведенную в 1,5 см от нижнего края пластинки, с помощью микрошприца наносят 0,002; 0,005; 0,01 и 0,02 см3 раствора А. Между пятнами экстракта на расстоянии 1 см от них на ту же линию наносят 0,002; 0,004; 0,006 см3 стандартного раствора дезоксиниваленола (50; 100 и 150 нг дезоксиниваленола). Пластинку помещают в камеру для ТСХ и элюируют в системе гексан-ацетон (3:2) на расстояние 15 см. Пластинку извлекают из камеры, сушат на воздухе 3-4 мин и опрыскивают 10% раствором хлористого алюминия в этаноле. Пластинку нагревают в сушильном шкафу в течение 5-7 мин. при 105°C, затем рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Дезоксиниваленол проявляется в виде пятен с синей флуоресценцией с R_f 0,25-0,30. Наличие в экстракте пятен, соответствующих по цвету флуоресценции и хроматографической подвижности стандарту дезоксиниваленола, свидетельствует о возможном наличии этого токсина в образце. Для количественного определения сравнивают интенсивность флуоресценции разных количеств стандартов дезоксиниваленола с интенсивностью флуоресценции их пятен в образце, визуально оценивая количество нг токсинов в нанесенных на пластинку объемах раствора А. Концентрацию дезоксиниваленола в образце рассчитывают по формуле:

                             V  x m

                 C = C ----------------- , мг/кг, где

                        10 x K x V  x M

     V  - объем раствора А, см3 (0,2 см3);

     V  - объем раствора А, нанесенный на пластинку, см3;

     m  - масса  дезоксиниваленола    в  V_2  см3  раствора  А, оцененная

          визуальным сравнением со стандартом на ТСХ-пластинке, нг;

     М  - аликвотная навеска образца, соответствующая раствору А (5 г для

          пшеницы, 3 г для кукурузы);

     К  - степень извлечения дезоксиниваленола по табл. 54.

Если интенсивность флуоресценции пятна дезоксиниваленола в экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна дезоксиниваленола соответствующего 0,006 см3 стандартного раствора, то следует разбавить раствор А смесью бензол-ацетонитрил (5:1), т.е. увеличить объем V_1, внеся соответствующие коррективы в расчетную формулу. Окончательное заключение о наличии и уровне загрязнения образца дезоксиниваленолом принимается только на основе данных двумерной ТСХ.

Подтверждение наличия и количественное определение дезоксиниваленола с помощью двумерной ТСХ

Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слоя силикагеля, согласно рис. 30. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 0,02 см3 раствора А. В левом нижнем углу пластинки наносят 0,002; 0,004 и 0,006 см3 стандартного раствора дезоксиниваленола, 0,002 и 0,005 см3 раствора А. В верхнем правом углу пластинки наносят 0,002; 0,004 и 0,006 см3 стандартного раствора дезоксиниваленола, 0,01 и 0,02 см3 раствора А. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан-ацетон (3:2) и элюируют ее в первом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 5,5 см от верхнего края, пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе. Затем проводят элюирование пластинки во втором направлении смесью хлороформ-ацетон-изопропиловый спирт (78:12:10). Для элюирования пластинки во втором направлении можно также использовать смесь: эфир-гексанизопропиловый спирт-вода (77:18:4,5:0,5). После достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 5,5 см от верхнею края пластинки, ее извлекают из камеры и сушат на воздухе.

Обнаружение и количественное определение проводят аналогично описанному выше.

Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола с помощью ВЭЖХ

Условия и параметры анализа дезоксиниваленола с помощью ВЭЖХ приведены в табл. 52.

Расход подвижной фазы 1,0 см3/мин. Рекомендуется использовать перегнанные растворители, фильтруя их через бумажный складчатый фильтр перед использованием. УФ-детектор устанавливают на длину волны 220-224 нм, шкала чувствительности 0,01 или 0,005 е. о. п. Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят по 0,002 и 0,004 см3 стандартных растворов, что соответствует 50 и 100 нг дезоксиниваленола (при обращеннофазной ВЭЖХ 1 см3 стандартного раствора дезоксиниваленола в смеси бензол-ацетонитрил (5:1), упаривают досуха в токе азота и растворяют в 1 см3 ацетонитрила).

Таблица 52

Условия анализа дезоксиниваленола

Вариант ВЭЖХ	Сорбент	Подвижная фаза	Примерный коэффициент емкости К'
Нормально-фазный	Силикагель	Гексан-изопропиловый спирт-вода (75:25:1.5)	1,3-2,0
Обращенно-фазный	ОДС-силикагель С18	Метанол-вода (25:75)	1,0-1,5
Обращенно-фазный	ОДС-силикагель С18	Ацетонитрил-вода (10:90)	1,5-2,0

Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на хроматограмме. В инжектор хроматографа вводят 10 мкл раствора А (или A_1). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания со стандартом дезоксиниваленола, определяют его высоту (h). Расчет концентрации дезоксиниваленола в образце проводят по формуле:

                             V  x m х h

                    С = -----------------------, где

                         10 x K x V  x M x h

                                   2        ст.

     С    - концентрация дезоксиниваленола в образце, мг/кг;

     V    - объем раствора А, см3 (0,2 см3);

     V    - объем раствора А, внесенный в хроматограф, см3 (0,01 см3);

     m    - масса  стандарта  дезоксиниваленола, введенная в хроматограф,

            нг;

     М    - аликвотная навеска образца, соответствующая раствору А (5 г);

     h    - высота пика, соответствующая данной массе стандарта, мм;

      ст.

     h    - высота пика дезоксиниваленола из образца, мм;

     К    - степень извлечения дезоксиниваленола - по табл. 54.

Если пик дезоксиниваленола в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ проводят повторно после разбавления раствора A (A_1) смесью бензол-ацетонитрил (при нормальнофазной ВЭЖХ) или ацетонитрилом (при обращеннофазной ВЭЖХ), т.е. после увеличения объема V_1.

Обнаружение, идентификация и определение содержания зеараленона

Очистка экстракта

В делительную воронку на 500 см3 помещают 50 см3 фильтрата (раздел "Экстракция"), добавляют 50 см3 гексана (или гептана), насыщенного ацетонитрилом. Встряхивают, после разделения слоев отбрасывают верхний гексановый слой. Нижний ацетонитрильный слой дважды встряхивают с 30 см3 гексана, насыщенного ацетонитрилом, каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой. К обезжиренному ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 150 см3 дистиллированной воды и 60 см3 бензола. Встряхивают и после разделения слоев отделяют верхний бензольный слой. Если полного расслоения жидкостей не происходит, добавляют 10 см3 насыщенного раствора хлорида натрия и смесь еще раз слегка встряхивают. Водный слой экстрагируют еще дважды 30 см3 бензола, бензольные слои объединяют и сушат безводным сульфатом натрия.

После фильтрования упаривают в грушевидной колбе на 100 см3 на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 45°C. Сульфат натрия промывают 10 см3 бензола в ту же грушевидную колбу и упаривают раствор досуха. Остаток растворяют в 0,5 см3 бензола - раствор В.

Обнаружение и идентификация зеараленона с помощью одномерной ТСХ

Пластинку "Силуфол" размечают в соответствии с рис. 28. На линию, проведенную в 1,5 см3 от нижнего края пластинки, с помощью микрошприца, наносят 0,005 и 0,01 см3 раствора В. Между пятнами экстракта на расстоянии 1 см от них на ту же линию наносят 0,005; 0,01 и 0,02 см3 рабочего раствора зеараленона (50; 100 и 200 нг зеараленона, соответственно). Аналогично готовят вторую пластинку "Силуфол". Обе пластинки помещают в камеру для ТСХ и элюируют в системе гексан-ацетон (7:3). Пластинки извлекают, сушат на воздухе 3-4 мин. Для обнаружения пятен зеараленона на первой пластинке используют опрыскивание 10% раствором хлорида алюминия в этиловом спирте с последующим нагреванием в сушильном шкафу при температуре 100-105°C в течение 10 мин. Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по цвету флуоресценции (синий) и хроматографической подвижности пятнам стандартов зеараленона, свидетельствует о возможном наличии зеараленона в образце.

Для подтверждения наличия зеараленона вторую ТСХ-пластинку опрыскивают 1% раствором прочной синей В-соли или прочной фиолетовой В-соли в дистиллированной воде, затем пластинку немедленно опрыскивают 5%-ным раствором углекислого натрия до появления красно-бордовой окраски пятен стандарта зеараленона. Обнаружение на пластинке пятна, соответствующего по цвету и хроматографической подвижности стандартам зеараленона, подтверждает наличие зеараленона в образце.

Количественное определение зеараленона с помощью двумерной ТСХ

Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слоя силикагеля, согласно рис. 30. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 0,02 см3 раствора В. В правом верхнем углу наносят 0,003 и 0,007 см3 рабочего раствора зеараленона, 0,01 и 0,02 см3 раствора В; в левом нижнем углу наносят 0,005 и 0,01 см3 рабочего раствора зеараленона, 0,002 и 0,005 см3 раствора В. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан-ацетон (7:3) и элюируют в первом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 5,5 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 мин. Затем проводят хроматографию во втором направлении в системе толуол-этилацетат-хлороформ - 85%-ная муравьиная кислота (45:25:25:5) до достижения карандашной линии, проведенной в 5,5 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают из камеры, сушат и обнаруживают пятна по флуоресценции после обработки раствором хлорида алюминия, как описано выше. Сравнивая интенсивность флуоресценции разных количеств стандарта зеараленона с интенсивностью флуоресценции пятна зеараленона в экстракте (раствор В), определяют количество нг зеараленона в экстракте.

Содержание зеараленона в образце рассчитывают по формуле:

                             V  x V  x m

                              1    3

                    С = -------------------------, где

                         10 x K x V  x V x M

                                   2    4

     С  - концентрация зеараленона в образце, мг/кг;

     V  - объем   водно-ацетонитрильной      смеси  для  экстракции,  см3

      1   (125 см3);

     V  - объем водно-ацетонитрильного  фильтрата,  взятый  для  анализа,

      2   см3 (50 см3);

     V  - объем   очищенного   экстракта  перед ТСХ (раствор В), см3 (0,5

      3   см3);

     V  - объем очищенного экстракта (раствор В), наносимый на пластинку,

      4   см3 (0,02 см3);

     М  - навеска образца, взятая для анализа, г (25 г);

     m  - масса зеараленона в V_4 см3 очищенного экстракта,  оцененная по

          ТСХ, нг;

     К  - степень извлечения зеараленона по табл. 54.

При приведенных в скобках объемах и навесках формула содержания зеараленона выражается следующим образом:

                              С = 0,25 х ---, мг/кг.

Если интенсивность флуоресценции пятна зеараленона в экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта, соответствующего 0,02 см3 стандартного раствора (200 нг зеараленона), то на пластинку следует нанести либо меньшее количество экстракта (уменьшить объем V_1) либо разбавить раствор В бензолом (увеличить объем У_3), внеся соответствующие коррективы в расчетную формулу.

Обнаружение и количественное определение зеараленона с помощью ВЭЖХ

Условия и параметры анализа зеараленона с помощью ВЭЖХ приведены в табл. 53.

Таблица 53

Условия анализа зеараленона

Вариант ВЭЖХ	Сорбент	Подвижная фаза	Расход подвижной фазы, см3/мин	Примерный коэффициент емкости
Нормально-фазный	Силикагель	Гексан-эфир-уксусная кислота (65:35:1)	1,5	2,0-2,5
Нормальнофазный	Силикагель	Петролейный эфир-эфир-уксусная кислота (50:50:1)	2	2,0-2,5
Обращенно-фазный	ОДС-силикагель С18	Метанол-вода-ацетонитрил (61:35:4)	1	1,0-1,3

Рекомендуется использовать перегнанные гексан и метанол или петролейный эфир и эфир, профильтрованный через слой оксида алюминия (5 см). УФ-детектор устанавливают на длину волны 283 нм, шкала чувствительности 0,005 е. о. п. Шкала самописца 10 мВ. Если используют флуориметрический детектор, то длину волны на линии возбуждения устанавливают около 283 нм, а на линии эмиссии - фильтр от 420 нм (или 440 нм в случае монохроматора на линии эмиссии).

Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят 0,002 и 0,005 см3 рабочего раствора зеараленона, что соответствует 20 и 50 нг зеараленона. Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на хроматограмме.

В инжектор хроматографа вводят 0,01 см3 раствора В. При наличии пика, совпадающего по времени удерживания со стандартом, определяют его высоту (h).

Расчет концентрации зеараленона в образце проводят по формуле:

                             V  x V  x m х h

                              1    3

                    С = ---------------------------, где

                         10 x K x V  x V x M x h

                                   2    4       ст.

     С   - концентрация зеараленона в образце, мг/кг;

     V   - объем     водно-ацетонитрильной    смеси  для  экстракции, см3

      1    (125 см3);

     V   - объем водно-ацетонитрильного фильтрата, взятый для анализа, см3

      2    (50 см3);

     V   - объем очищенного экстракта перед ВЭЖХ (раствор В), см3

      3    (0,5 см3);

     V   - объем    очищенного  экстракта     (раствор  В),  внесенный  в

      4    хроматограф, см3 (.02 см3);

     М   - навеска образца, взятая для анализа, г (25 г);

     m   - масса стандарта зеараленона, введенная в хроматограф, нг;

     h   - высота пика, соответствующая данной массе стандарта, мм;

      ст

     h   - высота пика зеараленона из образца, мм;

     К   - степень извлечения зеараленона по табл. 54.

Если пик зеараленона в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ проводят повторно после разбавления раствора В бензолом, т.е. после увеличения объема V_3.

При ВЭЖХ зеараленона чувствительность УФ- и флуориметрического детекторов примерно одинакова. Преимуществом флуориметрического детектора является его селективность (меньшее количество посторонних пиков на хроматограмме).

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), а также предел определения по данным авторов методов анализа дезоксиниваленола и зеараленона приведены в табл. 54, в которой указаны также относительные внутрилабораторные (Rs_r) и межлабораторные (RS_R) среднеквадратичные отклонения и средняя степень извлечения дезоксиниваленола (вомитоксина) и зеараленона.

Таблица 54

Наименование загрязнителя	Уровень загрязнения, мг/кг	Метод	Rs_r, %	RS_R, %	Rr, %	RR, %	Предел определения, мг/кг	Степень извлечения, %
Дезоксиниваленол	2,0	ТСХ	29	46	81	129	0,150	80
	2,0	ВЭЖХ	11	20	31	56	0,060	80
	0,4	ТСХ	41	58	115	162	0,150	80
	0,4	ВЭЖХ	19	27	53	76	0,060	80
Зеараленон	1,0	ТСХ	26	48	73	134	0,060	85
Зеараленон	1,0	ВЭЖХ-флуор.	12	20	34	56	0,004	85
Зеараленон	0,1	ВЭЖХ-УФ	12	20	34	56	0,010	85
		ТСХ	44	54	132	152	0,060	85
		ВЭЖХ-флуор.	17	26	48	73	0,004	85
		ВЭЖХ-УФ	17	26	48	73	0,010	85

4. Метод обнаружения, идентификации и количественного определения патулина в БАД на плодоовощной основе

Подготовка проб

Навеску жидких БАД массой 50 г или фруктового порошка массой 25 г помещают в стеклянный стакан, смешивают с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3. В мерную колбу вносят 15 см3 раствора Карреза I и 15 см3 раствора Карреза II. Содержимое колбы доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют в мерный цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Отбирают 50 см3 фильтрата.

Экстракция

Фильтрат из цилиндра переносят в делительную воронку, добавляют 50 см3 этилацетата и смесь интенсивно встряхивают. После разделения слоев отделяют верхний этилацетатный слой и переносят его в сухую плоскодонную колбу. Затем экстракцию проводят еще раз со свежей порцией этилацетата. Если полного расслоения жидкостей не происходит, в делительную воронку добавляют 10-12 г хлорида натрия и смесь слегка встряхивают. Этилацетатные экстракты объединяют, сушат безводным сульфатом натрия и фильтруют через кусочек ваты в грушевидную колбу. Сульфат натрия промывают 10 см3 этилацетата и фильтруют в ту же колбу. Экстракт упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток растворяют в 1 см3 этилацетата.

Очистка экстракта

В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек ваты и 5 см3 бензола, насыпают слой безводного сульфата натрия (5 мм) и наливают суспензию 2 г (3,6 см3) силикагеля в 15 см3 бензола. Не давая колонке просохнуть (колонка закрыта снизу), насыпают слой безводного сульфата натрия (10 мм). Бензолу дают стечь, на верхний слой сорбента наносят экстракт, дают впитаться в фильтрующий слой. Отгонную колбу ополаскивают 5 см3 этилацетата, переносят раствор на колонку и дают этилацетату полностью впитаться в фильтрующий слой. Колонку промывают 25 см3 бензола. Патулин элюируют 75 см3 смеси этилацетат-бензол (25:75). Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе. Остаток растворяют в 0,2 см3 смеси бензол-ацетонитрил (9:1) для анализа методом ТСХ или в 0,2 см3 метанола для анализа методом ВЭЖХ (раствор А).

Обнаружение и количественное определение патулина с помощью двумерной ТСХ

Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями согласно рис. 29. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 0,02 см3 раствора А. В левом нижнем углу пластинки наносят 0,002 и 0,004 см3 стандартного раствора патулина, что соответствует 20 и 40 нг стандарта. В верхнем правом углу пластинки наносят 0,006 и 0,008 см3 стандартного раствора патулина, что соответствует 60 и 80 нг стандарта. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью хлороформ-ацетон (4:1) и элюируют в первом направлении до достижения фронтом растворителя верхней карандашной линии. Пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе. Затем проводят элюирование пластинки во втором направлении смесью толуол-этилацетат-муравьиная кислота (5:4:1). После достижения фронтом растворителя карандашной линии ее извлекают из камеры и сушат на воздухе до исчезновения запаха растворителя. На дно эксикатора помещают стеклянный стакан вместимостью 150 см3 с 25 см3 раствора марганцовокислого калия, осторожно приливают 25 см3 соляной кислоты, быстро устанавливают вставку эксикатора и на нее хроматографическую пластинку, плотно закрывают эксикатор. Через 15 мин пластинку извлекают из эксикатора и оставляют выветриваться в вытяжном шкафу еще на 15-20 мин до полного исчезновения запаха хлора. (Работу с хлором следует проводить в вытяжном шкафу лаборатории с использованием индивидуальных средств защиты). Затем пластинку опрыскивают раствором бензидина, выдерживают 20-30 мин и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Патулин обнаруживается в виде желтых флуоресцирующих пятен. Наличие на пластинке пятна, соответствующего по цвету флуоресценции и хроматографической подвижности пятнам стандарта патулина, свидетельствует о его наличии в анализируемом продукте. Сравнивая интенсивность флуоресценции пятна патулина в пробе (в растворе А) с интенсивностью флуоресценции стандартов, оценивают количество. Содержание патулина в анализируемом продукте определяют по формуле:

                                V  x V  x m

                                 1    3

                       С = ---------------------, где

                            10 x K x V  x V x M

                                      2    4

     С   - содержание патулина в продукте, мг/кг;

     V   - объем раствора, до которого доведена исходная навеска продукта,

      1    см3 (250 см3);

     V   - объем фильтрата, отобранный на анализ, см3 (50 см3);

     V   - объем  очищенного  хлороформного  экстракта  перед  ТСХ,   см3

      3   (0,2 см3);

     V   - объем хлороформного экстракта,  нанесенный  на  пластинку, см3

      4   (0,02 см3);

     m   - количество патулина, обнаруженное в пятне, нг;

     М   - масса образца, взятая на анализ, г;

     К   - степень извлечения патулина по табл. 55.

Если интенсивность флуоресценции пятна патулина в экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта, соответствующего 0,008 см3 стандартного раствора (80 нг патулина), то на пластинку следует либо нанести меньшее количество экстракта (уменьшить объем V_4), либо разбавить раствор А хлороформом (увеличить объем М_3), внеся соответствующие коррективы в расчетную формулу.

Обнаружение и количественное определение патулина с помощью ВЭЖХ

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза изопропанол-гексан (1:4); расход подвижной фазы 1,0 см3/мин. Рекомендуется использовать перегнанные растворители. УФ-детектор устанавливают на длину волны 276 нм, шкала чувствительности 0,005 е. о. п. Шкала самописца 10 мВ.

Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят 0,002; 0,005 и 0,015 см3 рабочего раствора патулина, что соответствует 4; 10 и 30 нг патулина. Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на хроматограмме. При описанных условиях ВЭЖХ коэффициент емкости (К') для патулина составляет 2,3-2,7.

В инжектор хроматографа вводят 0,01 см3 раствора А. При наличии пика, совпадающего по времени удерживания со стандартом, определяют его высоту (h_обр). Расчет концентрации патулина в образце проводят по формуле:

                             V  x V  x m x h

                              1    3        обр.

                    С = ---------------------------, где

                         10 x K x V  x V x M х h

                                   2    4       ст.

     С    - концентрация патулина в образце, мг/кг;

     V    - объем, до которого доведена навеска при экстракции водой, см3

      1     (250 см3);

     V    - объем фильтрата, взятый для анализа, см3 (50 см3);

     V    - объем очищенного  экстракта    перед  ВЭЖХ  (раствор  А), см3

      3     (0,2 см3);

     V    - объем    очищенного    экстракта  (раствор  А),  внесенный  в

      4     хроматограф, см3 (0,02 см3);

     М    - навеска образца, взятая для анализа, г (50 или 25 г);

     m    - масса стандарта патулина, введенная в хроматограф, нг;

     h    - высота пика, соответствующая данной массе стандарта, мм;

      ст.

     h    - высота пика патулина из образца, мм;

      обр

     К    - степень извлечения патулина по табл. 55.

Если пик патулина в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ проводят повторно после разбавления раствора А метанолом, т.е. после увеличения объема V_3.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), а также предел определения по данным авторов методов анализа патулина приведены в табл. 55, в которой приведены также относительные внутрилабораторные (Rs_r) и межлабораторные (RS_R) среднеквадратичные отклонения и средняя степень извлечения патулина.

Таблица 55

Уровень загрязнения, мг/кг

Метод

Rs_R,

RS_r,

Rr,

RR,

Предел определения, мг/кг

Степень извлечения, %

0,1

ТСХ

118

182

0,012

ВЭЖХ

0,005

5. Метод обнаружения, идентификации и определения содержания трихотеценовых микотоксинов группы А в пищевых продуктах и БАД на зерновой основе с помощью газо-жидкостной хроматографии (арбитражный метод)

В основу положен метод групповой индикации трихотеценовых микотоксинов группы А, в т. ч. наиболее токсичного среди них Т-2 токсина, с помощью газожидкостной хроматографии по внутреннего стандарту - 3-О-метил-Т-2-тетраолу.

5.1. Экстракция

Навеску измельченной пробы зерна массой 20 г помещают в плоскодонную коническую колбу вместимостью 250 см3, добавляют 10 см3 4%-ного раствора хлорида калия и 90 см3 ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для встряхивания 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр, отбирают 70 см3 фильтрата (соответствует 14 г исходного образца).

5.2. Очистка экстракта

В делительную воронку на 250 см3 помещают 70 см3 фильтрата, добавляют 50 см3 гексана, после встряхивания и разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Нижний ацетонитрильный слой еще дважды встряхивают с 40 см3 гексана, каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой. Если слои плохо разделяются, добавляют сульфат аммония. К ацетонитрильному слою добавляют 2-3 см3 бензола и сульфат аммония на кончике шпателя, встряхивают и отбрасывают нижний водный слой. Ацетонитрильный слой помещают в круглодонную колбу и упаривают досуха с добавлением изопропанола до объема 1 см3.

5.3. Омыление пробы

К пробе добавляют 1 см3 4%-ного раствора едкого натра в 30%-ном изопропиловом слирте. Смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре.

5.4. Экстракция продуктов омыления

Щелочь нейтрализуют добавлением 2%-ого раствора уксусной кислоты (около 2 см3) до pH среды 5-7 (контроль по универсальной индикаторной бумаге). Смесь помещают в делительную воронку или в пробирку вместимостью 10 см3, добавляют 3,5 см3 смеси ацетонитрил-бензол (3:0,5), на кончике шпателя сульфат аммония, встряхивают и отделяют в чистую сухую колбу верхний ацетонитрильный слой (при использовании пробирки экстракт отделяют с помощью пипетки). Экстракцию повторяют дважды. Объединенные экстракты высушивают добавлением 1 г безводного сульфата натрия, фильтруют через ватный тампон в грушевидную колбу, куда предварительно помещают около 200 мг силикагеля для колоночной хроматографии, и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 40-45°C (до получения сыпучего силикагеля).

5.5. Очистка продуктов омыления

Очистку продуктов омыления проводят с помощью колоночной хроматографии. Для хроматографии используют растворители, очищенные путем дистилляции. Безводный сернокислый натрий и силикагель промывают последовательно бензолом и ацетоном, затем высушивают на воздухе и прокаливают в сушильном шкафу при 100°C в течение часа.

На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, 3-5 см3 бензола, безводный сульфат натрия (толщина слоя 5 мм, очищенный как указано выше), заливают суспензию 2 г (3,6 см3) силикагеля в бензоле, не давая бензолу стечь (колонка закрыта снизу), высыпают омыленную пробу на силикагеле по п. 5.4. и после оседания твердых частиц насыпают безводного сульфата натрия (10 мм). Дают бензолу стечь и колонку промывают последовательно 25 см3 смеси бензол-ацетон (95:5) (элюат отбрасывают) и 70 см3 смеси бензол-ацетон (1:1). Элюат собирают в круглодонную колбу, упаривают на ротационном испарителе до объема 1 см3. Остаток переносят в вайл (емкость вместимостью 4-6 см3 с герметично завинчивающейся крышкой) или в пробирку вместимостью 5 см3 с НШ 14,5, упаривают досуха в токе азота и остаток растворяют в 0,02 см3 бензола, очищенного дистилляцией над металлическим натрием (раствор А).

5.6. Получение ТФА-производных

5.6.1. Получение стандартного раствора 3-О-метил-Т-2-тетраола

5.6.1.1. Метелирование Т-2 токсина

1 г Т-2 токсина помещают в круглодонную колбу вместимостью 250 см3, добавляют 3 см3 очищенного перегонкой йодистого метила, 300 мг оксида серебра (катализатор) и кипятят на глицериновой бане (температура бани 60°C) с обратным холодильником в течение 2-4 ч (контроль продуктов реакции по ТСХ на пластинках "Силуфол" в системе бензол-ацетон (5:1), эталон - исходный Т-2 токсин). После окончания реакции содержимое реакционной колбы охлаждают до комнатной температуры и упаривают досуха (от избытка йодистого метила) на ротационном испарителе. Остаток растворяют в 3 см3 бензола.

5.6.1.2. Очистка 3-О-Ме-Т-2-токсина от исходного Т-2 токсина

Продукт реакции 3-О-Ме-Т-2-токсин необходимо очистить от исходного Т-2-токсина с помощью колоночной хроматографии. Для этого на дно стеклянной колонки размером 300 х 22 мм помещают кусочек ваты, приливают 5-10 см3 бензола (колонка закрыта снизу), присыпают безводный сульфат натрия (толщина слоя 5 мм), заливают суспензию 20 г силикагеля в бензоле и насыпают слой безводного сульфата натрия (20 мм). Дают бензолу стечь и на колонку наносят раствор продуктов реакции в бензоле по п. 5.6.1.1. (3 см3). Реакционную колбу ополаскивают бензолом (0,5 см3) и раствор также наносят на колонку. Колонку последовательно промывают:

- бензолом - 100 см3,

- 2%-ным раствором ацетона в бензоле - 200 см3,

- 4%-ным раствором ацетона в бензоле - 100 см3,

- 5%-ным раствором ацетона в бензоле - 600 см3,

- 10%-ным раствором ацетона в бензоле - 300 см3,

- 15%-ным раствором ацетона в бензоле - 200 см3.

Отбирают фракции, содержащие чистый 3-О-Ме-Т-2-токсин (5%-ная смесь ацетона в бензоле) и Т-2 токсин (10-15%-ная смесь ацетона в бензоле). Контроль реакции проводят с помощью ТСХ на пластинках "Силуфол" в системе бензол-ацетон (5:1). Выход 3-О-Ме-Т-2-токсина после упаривания растворителя досуха на ротационном испарителе и высушивания остатка в вакууме составляет порядка 0,5 г (50%). Возврат Т-2-токсина - 50%.

5.6.1.3. Омыление Ме-Т-2-токсина

К высушенному остатку 3-О-Ме-Т-2-токсину добавляют 10 см3 метанола, 2 см3 воды и 3 см3 раствора 3H К2СО3. Смесь нагревают 2 ч при 40°C при перемешивании на магнитной мешалке. Контроль продуктов реакции проводят с помощью ТСХ на пластинках "Силуфол" в системе бензол-ацетон (1:1). По окончании реакции смесь охлаждают, разбавляют 70 см3 воды и нейтрализуют добавлением 0,4 см3 ледяной уксусной кислоты до слабо кислой среды (контроль по универсальной индикаторной бумажке).

5.6.1.4. Очистка 3-О-Ме-Т-2-тетраола на патроне Supelclean LC-18.

Полученный раствор по п. 5.6.1.3. пропускают через концентрирующий патрон Supelclean LC-18 (толщина слоя 1 см), элюат отбрасывают. Патрон промывают 50 см3 метанола. Элюат содержит неполярные примеси и следовые количества продукта и его отбрасывают. 3-О-Ме-Т-2-тетраол смывают 10 см3 смеси метанол-вода (5:1) и экстрагируют этилацетатом (5 см3 х 3 раза). При плохом расслоении жидкостей в элюат добавляют хлорид натрия или центрифугируют. Этилацетатные экстракты объединяют, упаривают досуха и 3-О-Ме-Т-2-тетраол кристаллизуют из бензола с добавлением петролейного эфира до помутнения. Выход 3-О-Ме-Т-2-тетраол составляет порядка 70%.

5.6.1.5. Приготовление стандартного рабочего раствора 3-О-Метил-Т-2-тетраола.

625 мг 3-О-Ме-Т-2-тетраола помещают в мерную колбу вместимостью 25 см3, содержащую до половины бензол, перемешивают до полного растворения вещества и доводят бензолом до метки, тщательно перемешивают. Концентрация 3-О-Ме-Т-2-тетраола в полученном растворе 25 мг/см3.

5.6.2 Получение трифторацетильных производных стандартной смеси Т-2-тетраола и 3-О-Метил-Т-2-тетраола

В вайл (емкость вместимостью 4-6 см3 с герметично завинчивающейся крышкой) или пробирку вместимостью 5 см3 с НШ 14,5 помещают 0,02 см3 рабочего раствора Т-2 тетраола (1 мкг) и 0,04 см3 рабочего раствора 3-О-метил-Т-2-тетраола (1 мкг) в бензоле, добавляют 0,1 см3 бензола, предварительно очищенного дистилляцией над металлическим натрием, 30-50 мг свежепрокаленного углекислого натрия и 0,05 см3 трифторуксусного ангидрида. Пробирку плотно закрывают стеклянной притертой пробкой и нагревают при 60°C в течение 0,5 часа при периодическом встряхивании. Содержимое пробирки разбавляют бензолом до 1 см3 и фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в другую пробирку вместимостью 5 см3 с НШ 14,5. Углекислый натрий на фильтре промывают 0,5 см3 бензола. Объединенные бензольные фильтраты упаривают досуха в токе азота (при отсутствии баллона с азотом можно упарить досуха на ротационном испарителе). Остаток растворяют в 0,02 см3 бензола и анализируют с помощью ГЖХ.

5.6.3. Получение ТФА-производных продуктов омыления.

К 0,02см3 раствора продуктов омыления экстракта по п. 5.5. (раствор А) добавляют 0,04 см3 стандартного раствора 3-О-метил-Т-2-тетраола (1 мкг, внутренний стандарт) в бензоле, 30-50 мг свежепрокаленного углекислого натрия и 0,05 см3 трифторуксусного ангидрида. Пробирку плотно закрывают стеклянной притертой пробкой и проводят получение ТФА-производных согласно п. 5.6.2 при периодическом встряхивании.

5.7. ГЖХ анализ ТФА производных

Условия ГЖХ анализа: колонка капиллярная, длина колонки 25 м, жидкая фаза SE-54, температура колонки - 210°C, температура термостата детектора - 240°C, температура инжектора - 300°C, скорость газа-носителя 2 см3/мин, скорость продувочного газа - 6 см3/мин, шкала чувствительности - 2 х 10(-12) А (на блоке ИМТ).

В инжектор газового хроматографа с помощью микрошприца вместимостью 1 или 10 мкл последовательно вводят две аликвоты (около 0,2-0,5 мкл) стандартной смеси ТФА-производных Т-2-тетраола и 3-О-метил-Т-2-тетраола по п. 5.6.2. При использовании метода внутреннего стандарта нет необходимости вводить в хроматограф точные количества проб. В каждом случае регистрируют время выхода растворителя бензола и время выхода ТФА-Т-2 тетраола и ТФА-3-О-метил-Т-2-тетраола. Определяют относительное приведенное время удерживания токсина (наиболее воспроизводимая величина для идентификации) и площади пиков токсинов (S_ст. и S_вн.ст.). Относительные приведенные времена удерживания определяют по следующей формуле:

                           t    - t

                            ст.    0

                    t' = ---------------, где

                          t       - t

                           вн.ст.    0

     t'      - относительное приведенное время удерживания, мин.,

     t       - время удерживания растворителя, мин.,

     t       - время удерживания Т-2 тетраола, мин.,

      ст.

     t       - время удерживания 3-О-метил-Т-2-тетраола, мин.

      вн.ст.

Площадь пиков определяют по показанию интегратора или умножением высоты пика на ширину пика на половине его высоты. Затем в газовый хроматограф вводят 0,2-0,5 мкл раствора ТФА производного продуктов омыления экстракта по п. 5.6.3. При наличии пика, соответствующего относительному приведенному времени удерживания ТФА-производному Т-2 тетраола, определяют его площадь (S_oбp).

Относительное приведенное время удерживания Т-2 тетраола в зависимости от условий хроматографии может меняться в пределах 0,59-0,62.

5.8. Обработка результатов анализа

Расчет содержания Т-2 тетраола в анализируемой смеси проводят по формуле:

                            К х m       x S

                                 вн.ст.

                       М = ------------------, где

                                 вн.ст.

     М       - масса анализируемого вещества (Т-2 тетраола), мкг,

     m       - масса    введенного  внутреннего  стандарта  (3-О-метил-Т-

      вн.ст.   2тетраола), мкг,

     S       - площадь пика анализируемого вещества (Т-2 тетраола), мм,

     S       - площадь  пика      внутреннего  стандарта  (3-О-метил-Т-2-

      вн.ст.   тетраола), мм2,

     К       - поправочный   коэффициент   вещества    (Т-2  тетраола) по

               внутреннему стандарту (3-О-метил-Т-2-тетраолу).

Поправочный коэффициент определяют в соответствии с параметрами калибровочной смеси по следующей формуле:

                            m x S

                                  вн.ст.

                       К = --------------, где

                            m       x S

                             вн.ст.

     m        - масса Т-2 тетраола, нг,

     m        - масса 3-О-метил-Т-2 тетраола, нг,

       вн.ст.

     S        - площадь 3-О-метил-Т-2 тетраола, мм2,

      вн.ст.

     S        - площадь Т-2 тетраола, мм2.

Пересчет количества Т-2 тетраола на кг исследуемого образца проводят следующим образом:

                          М х 1000

                    М  = ----------, где

                     1        m

     M  - содержание суммы трихотеценовых   микотоксинов  группы  А  (Т-2

      1   токсин, НТ-2 токсин, Т-2 тетраол и др.), мкг/кг,

     М  - масса анализируемого вещества (Т-2 тетраола),   определенная во

          вколе, мкг,

     m  - масса анализируемой пробы,  соответствующая  70  см3  фильтрата

          (14 г) по п. 5.1., г.

5.9. Метрологические характеристики метода

Предел обнаружения Т-2 тетраола во вколе при ГЖХ с использованием детектора электронного захвата (ДЭЗ) - 0,5-1 нг; общий предел обнаружения 20 мкг/кг (0,02 мг/кг); относительное стандартное отклонение 0,28-0,35 (при уровне загрязнения 0,1 мг/кг).

II. Метод определения нитратов и нитритов

Методы определения нитратов и нитритов распространяется на БАД на растительной основе, определение проводится либо методом фотометрии в соответствии с ГОСТ 8558.1-78, либо методом ионометрии по ГОСТ 29270-95 "Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения нитратов и нитритов".

РИС. 28 И 29 К РУКОВОДСТВУ Р 4.1.1672-03

III. Метод определения n-нитрозаминов

Для определения N-нитрозаминов используют ГЖХ-хемилюминесцентный метод. Метод идентификации и количественного определения НА состоит в выделении летучих НА путем перегонки с паром или в вакууме, экстракции хлористым метиленом НА из водного дистиллята, концентрировании экстракта, разделении смеси методом газожидкостной хроматографии и количественном определении немодифицированных НА с помощью высокоселективного и высокочувствительного хемилюминесцентного (термоэнергетического) детектора ТЕА-502.

Идентификацию НА осуществляют по времени удерживания в сравнении с параметрами удерживания стандартных НА. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки с систематическим контролем калибровочного коэффициента.

1. Аппаратура, материалы, реактивы

Весы технические и весы аналитические

Шкаф сушильный, нагревательные приборы (электронагреватель, колбонагреватель или электроплитка).

Ротационный испаритель с ловушкой.

Насос водоструйный.

Контактные термометры.

Микрошприц МШ-10 на 10 мкл или калиброванные стеклянные капилляры.

Система для отгонки нитрозаминов с водяным паром, принципиальная схема которой представлена на рис. 23.

Газовый хроматограф любой марки.

Детектор хемилюминесцентный - анализатор термической энергии типа ТЕА-502 фирмы "Termo Electron Corporation" (США).

Самописец - любой марки.

Колонка газохроматографическая стеклянная длиной 3 м и диаметром 2 мм, заполненная 15% Carbowax-20M, нанесенном на Chromaton N-AW-DMCS (80-100 меш.).

Азот газообразный (ос.ч. или поверочный нулевой газ) или аргон газообразный, ос. ч.

Кислород газообразный, ос.ч.

Азот жидкий.

N-нитрозодиметиламин (НДМА).

N-нитрозодиэтиламин (НДЭА).

N-нитрозодипропиламин (НДПА).

N-нитрозодибутиламин (НДБА).

N-нитрозопиперидин (НПип).

N-нитрозопирролидин (НПир) фирмы "Fluka" (Швейцария).

Гексановый раствор НДПА (0,2 мкг/см3) - внутренний стандарт.

Гексановый раствор смеси стандартных НА (НДМА, НДЭА, НДБА, НПиП, НПир) по 0,2 мкг каждого НА в 1 см3 раствора.

Ацетонитрил, х. ч.

Бензол, х. ч.

Вода дистиллированная.

н-Гексан, х. ч.

Кальция хлорид прокаленный, ч.

Кислота соляная, х. ч., и ее водный раствор 0.1 н.

Кислота серная, х. ч., и ее водные растворы 1 н. и 5 н.

Кислота уксусная ледяная, х. ч.

Метилена хлорид, х. ч.

Натрия гидроокись, х. ч., и его водный раствор 0.1 н.

Натрий сернокислый прокаленный, х. ч.

Натрий углекислый кислый, х. ч.

Натрий хлористый, х. ч.

Спирт этиловый.

2. Требования техники безопасности при проведении испытаний

Помещение, в котором производят определение нитрозаминов, обязательно должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

Работу с нитрозаминами, стандартами, другими химическими соединениями и растворителями проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты (очки, перчатки и др.).

В лаборатории, где проводится работа с канцерогенными летучими НА, необходимо всегда иметь 2-3%-ный раствор газообразного НВг в уксусной кислоте для разрушения НА при попадании их на рабочие места и пол. В целях разрушения летучих НА в воздухе по окончании работы помещение необходимо обработать ультрафиолетовым светом.

Транспортировка и хранение НА осуществляются в стеклянных запаянных ампулах, обернутых в асбестовую ткань и упакованных в металлическую тару, которую также заплавляют парафином.

НА хранят в специальном холодильнике в отсутствие анализируемых проб.

1,0 см3 раствора НДПА из ампулы с концентрацией 0,2 мг/см3 переносят в мерную колбу на 100 см3 и доводят гексаном до метки. Полученный раствор с концентрацией 2 мкг/см3 используют при анализе в качестве внутреннего стандарта.

3. Выделение нитрозаминов

3.1. Выделение нитрозаминов путем перегонки с паром

Навеску 50-100 г измельченного в гомогенизаторе БАД помещают в круглодонную колбу на 500 см3, соединенную с паровиком и прямым холодильником (принципиальная схема установки представлена рис. 31). К образцу добавляют 10 г хлористого натрия, 10 г сульфата натрия или магния, 25-50 см3 дистиллированной воды (в зависимости от влажности образца), 5 см3 2% раствора сульфаминовой (или сульфаниловой) кислоты, 5-10 см3 1 н. раствора серной кислоты до pH < 3,0; 1 см3 гексанового раствора ДПНА и НА отгоняют с водяным паром, собирая 200-230 см3 дистиллята. Если перегонка с паром сопровождается вспениванием массы, добавляют 5-10 см3 насыщенного раствора апиезона в изопропиловом спирте, а в случае спекания образцов в процессе дистилляции - мелкие керамические крошки или кусочки стеклянных трубочек. Для наиболее полного выделения НА из БАД, содержащих спирт, необходимо разбавить образец водой до получения 20% концентрации в нем спирта. Дистиллят переносят в делительную воронку и нитрозамины экстрагируют свежеперегнанным хлористым метиленом 4-5 раз по 15 см3.

Объединенные хлорметиленовые экстракты высушивают прокаленным сульфатом магния, отфильтровывают, осушитель промывают небольшим объемом хлористого метилена, объединенные фильтраты помещают в круглодонную колбу на 100-150 см3, снабжают дефлегматором (или воздушным холодильником), помещают в водяную баню и упаривают хлористый метилен до 5-7 см3 выдерживанием при температуре бани 55-65°C. Целесообразно пропускание тока инертного газа через хлорметиленовый раствор. По достижении объема раствора 5-7 см3 дефлегматор смывают 2 см3 гексана и продолжают концентрировать пробу до 2 см3.

3.2. Выделение нитрозаминов перегонкой в вакууме

Пробу исследуемого образца массой 20-50 г, отвешенную с погрешностью 0,1 г, помещают в круглодонную колбу вместимостью 200 см3, добавляют 75-80 см3 дистиллированной воды, 1 см3 гексанового раствора НДПА, 4 см3 0,1 н. раствора гидроокиси натрия и 20 см3 парафинового или вазелинового масла для предотвращения перебрасывания массы во время дистилляции и присоединяют к вакуумной системе (принципиальная схема установки изображена на рис. 32).

Колбу с исследуемым образцом помещают на песочную баню, под которой устанавливают газовую горелку; приемную колбу охлаждают смесью сухого льда и гексана (ацетона) или жидким азотом. Установив в системе вакуум до 0,1 атм, проводят дистилляцию до получения 50 см3 дистиллята. Чтобы избежать потери НА, обязательно проводят дистилляцию в закрытой системе. Герметичность системы можно сохранить используя чистую вакуумную смазку или тефлоновые манжеты для шлифов. После окончания дистилляции снимают обогрев, охлаждение, отсоединяют шланг вакуумной системы. После оттаивания приемной колбы систему перегонки разбирают, насадку ополаскивают несколькими см3 дистиллированной воды, которые добавляют к дистилляту. В круглодонную колбу с дистиллятом добавляют 1-2 см3 этанола, 0,5 см3 5 н. серной кислоты и экстрагируют трижды по 7-10 см3 хлористым метиленом. Экстракт высушивают прокаленным сульфатом магния и концентрируют аналогично п. 3.1 до 2 см3.

4. Подготовка к испытанию и проведение анализа

Анализ НА осуществляют с помощью ГЖХ без дополнительной обработки хлорметиленового или гексанового раствора при следующих условиях: колонка стеклянная (длина 3 м с диаметром 2 мм), заполненная 15% Carbowax-20M, нанесенном на Chromaton N-AW-DMCS (80-100 меш.). (Может быть использована другая по размеру набивная колонка, например, с содержанием Carbowax 10%), газ-носитель - азот или аргон, скорость 20 см3/мин, температура колонки 125°C (изотермический режим); температура испарителя 220°C, температура каталитической печи 450°C, давление азота - 0,5 атм (или расход - 40 см3/мин), давление кислорода - 0,6 атм, температура охлаждающей ловушки 110-130°C, объем вводимой в хроматограф пробы 1-10 мкл.

Записывают хроматограмму эталонной смеси НА и раствора внутреннего стандарта в начале и в конце каждой серии анализов. Идентификацию НА в пробе осуществляют по времени удерживания стандартов. Количество НА в пробе оценивают сравнением величины аналитических сигналов, полученных при анализе образцов и стандартных растворов.

Оценивают также полноту извлечения НА из БАД по внутреннему стандарту (НДПА), вносимому в продукт перед выделением НА.

Содержание НА в пробе рассчитывают по формуле:

                        S  x V  x n x 100

                         1    2

                   C = --------------------, где

                         S  x V  x m x A

                          2    1

     С   - содержание исследуемого НА в образце, мкг/кг;

     S   - площадьw  под  интегральной  кривой,  полученной  при  анализе

      1    образца, мм2;

     S   - площадь под интегральной кривой соответствующего  стандартного

      2    НА, мм2;

     V   - объем пробы, введенной в хроматограф, мкл;

     V   - объем анализируемого экстракта, мкл;

     n   - количество стандартного НА, введенного в хроматограф, нг;

     m   - масса пробы, взятой на анализ, г;

     A   - степень извлечения внутреннего стандарта (70-95%).

5. Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), а также предел определения приведены в табл. 56.

Таблица 56

Относительные допустимые внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения результатов определения и величина предела определения

Метод

Предел определения, мкг/кг

Rr, %

RR,

Хемилюминесцентный

0,1

IV. Метод определения биогенных аминов

1. Колориметрический метод определения гистамина

Принцип метода

В основе колориметрического метода определения гистамина лежит измерение величины абсорбции окрашенного производного, при взаимодействии гистамина с диазореактивом. Предел обнаружения - 10 мг/кг, относительное стандартное отклонение при определении гистамина в интервале 20-75 мг/кг изменяется от 0,08 до 0,25, степень извлечения добавленного к образцу стандарта гистамина - 94-99%.

Специфические приборы, реактивы, материалы

Колориметр фотоэлектрический по ГОСТ 12083-78 со светофильтром = 490 + 10 нм, спектрофотометр СФ-26 или аналогичный.

Микроизмельчитель тканей РТ-2 по МРТУ 64.1-1505-63.

Гистамин или гидрорхлорид гистамина.

Кислота соляная по ГОСТ 3118-77, х. ч. раствор 3,75 г/л (0,1 н раствор).

Кислота трихлоруксусная по ТУ 6-09-1926-77, раствор 50 г/л ((5% раствор).

Натрий азотистокислый по ГОСТ 4197-77, раствор 50 г/л (5% раствор).

Натрий гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч. д. а., раствор 200 г/л (5% раствор).

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76, х. ч., прокаленный.

Натрий углекислый по ГОСТ 83-79, х. ч., раствор 40 г/л (4% раствор).

Пара-нитроанилин, ч. д. а.

Этилацетат по ГОСТ 22300-76, ч. д. а.

Подготовка к испытанию

Приготовление раствора пара-нитроанилина

Пара-нитроанилин очищают путем перекристаллизации в воде. Для этого его растворяют в горячей дистиллированной воде и охлаждают раствор до комнатной температуры. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и высушивают при 80°C в течение 10-15 мин. 0,1 г пара-нитроанилина растворяют в 100 см3 0,1 н соляной кислоты. Хранят раствор в холодильнике до момента употребления.

Приготовление диазореактива

Диазореактив получают непостредственно перед использованием путем смешивания 10 см3 раствора 1 г/дм3 пара-нитроанилина в 0,1 н соляной кислоте и 1 см3 раствора 50 г/дм азотистокислого натрия и охлаждают до 0°C.

Приготовление н-бутанола, насыщенного водой

Для приготовления н-бутанола, насыщенного водой, встряхивают 50 см3 н-бутанола и 20 см3 дистиллированной воды в делительной воронке. После разделения фаз отделяют верхний бутанольный слой.

Экстракция

Навеску 10 г (с точностью до 0,01 г) приготовленного образца помещают в сосуд микроизмельчителя тканей, добавляют 25 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают 5 мин. Полученную смесь переносят в плоскодонную коническую колбу на 100 см3, ополаскивают сосуд смесителя дважды 5-10 см3 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и растворы объединяют. Колбу снабжают воздушным холодильником и выдерживают на водяной бане при 60°C в течение 15 мин. Охлажденную смесь переносят количественно в цилиндр, доводят до 50 см3 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и фильтруют через складчатый фильтр (фильтрат 1).

Построение калибровочной кривой

Готовят стандартные растворы гистамина с концентрацией 5, 10, 20, и 40 мкг/см3 в 5%-ной трихлоруксусной кислоте. Для приготовления основного раствора гистамина с концентрацией 40 мкг/см3 - 4,0 мг гистамина помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в 5%-ной трихлоруксусной кислоте и доводят объем до метки. Рабочие растворы гистамина с концентрациями 20, 10 и 5 мкг/см3 получают путем разбавления 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты основного раствора в 2, 4 и 8 раз соответственно. Основной раствор гистамина хранят в холодильнике неделю, рабочие растворы готовят в день проведения анализа.

5 см3 каждого стандартного раствора помещают в пробирки с притертыми пробками, добавляют 1 см3 20%-ного раствора гидроксида натрия и вносят в раствор при перемешивании безводный углекислый натрий до получения насыщенного раствора. Добавляют 5 см3 н-бутанола, насыщенного водой. Энергично встряхивают пробирки в течение 30 сек. После разделения фаз отбирают пипеткой или шприцем 3 см3 верхнего бутанольного слоя и переносят в другую пробирку с притертой пробкой, содержащую 3 см3 0,1 н раствора соляной кислоты. Встряхивают содержимое пробирки в течение 30 сек. После разделения фаз отбирают 2 см3 нижнего водного слоя в другую пробирку. Добавляют 2 см3 4%-ного раствора углекислого натрия и выдерживают 5 мин при 0°C. Добавляют 4 см3 этилацетата и энергично встряхивают в течение 30 сек. После разделения фаз сухой пипеткой отбирают верхний слой и переносят в пробирку, содержащую безводный сульфат натрия (раствор окрашенного производного в этилацетате должен быть прозрачным). Измеряют величину абсорбции раствора при 495 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве раствора сравнения используют этилацетат.

На основании полученных данных строят калибровочную кривую зависимости абсорбции от концентрации гистамина в растворе.

Проведение испытаний

5 см3 фильтрата 1 помещают в пробирку и проводят процедуру, описанную выше, начиная с добавления раствора гидроокиси натрия.

Для определения концентрации гистамина в экстракте используют калибровочную кривую.

Обработка результатов

Содержание гистамина в образце (мг/кг) вычисляют по формуле:

                          c х 100

                     Г = --------- x Ф , где

     с - концентрация гистамина, найденная по калибровочной кривой,

         мкг/см3;

     V - объем экстракта, см3 (50 см3);

     m - навеска образца БАД, г (10 г);

     Ф - фактор разбавления:

                       V               + V

                        мл фильтрата 1    мл ТХУ кислоты

                 Ф = -----------------------------------.

                             мл фильтрата 1

Вычисления проводят до единиц. За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение результатов трех параллельных определений.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 20% по отношению к среденеарифметическому значению.

2. Определение содержания биогенных аминов с помощью ВЭЖХ

Принцип метода

Метод определения содержания биогенных аминов устанавливает хроматографическую методику выполнения измерений массовых концентраций биогенных аминов (тирамина, кадаверина, путресцина, спермидина, спермина, гистамина) в биологически активных добавках к пище и предназначены для проведения лабораторных исследований пищевой продукции и биологически активных добавок в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".

Специфические приборы, реактивы, материал

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 см3/мин., оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных Мультихром, версия 1,5 х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем с размером частиц 5 мкм; длина колонки - 25 см, предколонки - 4,5 см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см;

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Микроизмельчитель тканей РТ - 2 по МРТУ 64.1-1505-63.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью +-0,0001 г.

Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания до 200 г, с пределом допустимой погрешности +-0,0005 г по ГОСТ 2404-80.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2 по ГОСТ 1770.

Центрифуга лабораторная.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 по ГОСТ 29227.

Кислота трихлоруксусная по ТУ 6-09-1926-77, раствор 50 г/л (5%-ный раствор).

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х. ч., раствор 0,1Н.

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76, х. ч., прокаленный.

Натрий углекислый по ГОСТ 83-79, х. ч., насыщенный раствор.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, х. ч., насыщенный раствор.

Этилацетат по ГОСТ 22300-76, ч. д. а.

Гексан по ТУ 6-09-3375-73, ч.

Бензол для хроматографии, х. ч. по ТУ 6-09-779-76.

Ацетон по ГОСТ 2603-71, ч.д.а.

5-диметиламино-нафталинсульфонил хлорид (дансилхлорид), Serva, раствор 5 г/л в ацетоне.

Фильтры обеззольные ФО-ФС-15 "Синяя лента" по ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтр нейлоновый имп. на шприце в обойме 25 мм, размер пор 0,45 мкм.

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

Баллон с сжатым азотом, ос. ч. по ГОСТ 9293-74.

Тирамин, кадаверин, путресцин, спермидин, спермин, гистамин или их гидрохлориды.

Подготовка к испытанию

Приготовление основных стандартных растворов биогенных аминов (БА)

Навески по 0,25 г аминов или соответствующие навески аминов гидрохлоридов помещают в мерные колбы вместимостью 50 см3, растворяют в 0,1М растворе соляной кислоты, доводят этим же раствором до метки и тщательно перемешивают. Получают стандартный раствор аминов в 0,1 М HCI с массовыми долями каждого амина (тирамин, кадаверин, путресцин, спермидин, спермин, гистамин) 5 мг/см3;

Приготовление рабочих стандартных растворов биогенных аминов

Аликвоты в 1 см3 основного стандартного раствора каждого биогенного амина переносят в мерные колбы вместимостью 50 см3, доводям 0,1 М HCI до метки и тщательно перемешивают. Получают рабочие стандартные растворы биогенных аминов концентрацией 0,1 мкг/см.

Получение стандартных растворов ДНС-производных биогенных аминов

Для получения стандартных растворов ДНС-производных биогенных аминов отбирают по 0,05 см3 каждого рабочего стандартного раствора БА (5 мкг амина), помещают в вайл вместимостью 4-6 см3, добавляют 0,5 см3 насыщенного раствора бикарбоната натрия (рН 8,5-9) и 1 см3 ацетонового раствора ДНС-хлорида с концентрацией 5 г/л. Смесь перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 12-14 ч или 1 ч при 45-50°C.

В реакционную смесь добавляют 1 см3 дистиллированной воды и отдувают ацетон в токе азота. При этом можно вайл поместить в водяную баню, нагретую до 35-40°C. ДНС-амиды экстрагируют бензолом (3x1 см3), каждый раз стеклянной пипеткой отбирая верхний бензольный слой. Объединенные бензольные экстракты сушат безводным сульфатом натрия, декантируют в сухой вайл, осушитель промывают бензолом, также декантируют и упаривают досуха. Перед анализом стандартные растворы ДНС-производных биогенных аминов растворяют в 1 см3 бензола.

Подготовка проб к анализу

Экстракция

Навеску 20 г пищевого продукта, взятую с точностью до 0,01 г, размельченного в мясорубке или гомогенизаторе, или 20-40 таблеток или капсул БАД (в зависимости от веса таблетки), размельченных в ступке, помещают в коническую колбу вместимостью 250 см3 Добавляют, соответственно, 100 см3 и 50 см3 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, снабжают воздушным холодильником, перемешивают и выдерживают 15 мин при температуре 60°C на водяной бане, периодически встряхивая содержимое колбы. Полученную смесь охлаждают и фильтруют через складчатый фильтр.

Получение дансильных производных биогенных аминов из образца

Аликвоту экстракта 0,5 см3, соответствующую 0,1 г исходного образца, помещают в вайл вместимостью 4-6 см3, добавляют 0,5 см3 насыщенного раствора бикарбоната натрия (рН 8,5-9) и 1 см3 ацетонового раствора ДНС-хлорида с концентрацией 5 г/л. Смесь перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 12-14 ч или 1 ч при 45-50°C.

В реакционную смесь добавляют 1 см3 насыщенного раствора натрия хлорида и отдувают ацетон в токе азота. При этом можно вайл поместить в водяную баню, нагретую до 35-40°C. ДНС-амиды экстрагируют бензолом (3 х 1 см3), каждый раз стеклянной пипеткой отбирая верхний бензольный слой. Если расслоение жидкостей происходит трудно, смесь центрифугируют в лабораторной центрифуге. Объединенные бензольные экстракты сушат безводным сульфатом натрия, декантируют в сухой вайл, осушитель промывают бензолом, также декантируют и упаривают досуха. Перед анализом сухой остаток растворяют в 1 см3 бензола.

Проведение испытаний

Условия хроматографического анализа

Насос высокого давления с верхним пределом давления не менее 25 Мпа, диапазоном регулирования подачи растворителя не менее 0,1-5,0 см3/мин.

Петлевое устройство ввода проб с рабочим объемом петли 0,020 см3.

Флуориметрический детектор, длина волны возбуждающего излучения 335 нм, длина волны эмиссии 470 нм, проточная кварцевая кювета объемом 0,015-0,025 см3, с уровнем флуктуационных шумов не более 8 х 10(-5) ед. флуоресценции, относительной погрешностью измерения интенсивности флуоресценции не более 2%.

Подвижная фаза гексан-этилацетат 55:45.

Скорость потока 1,0 мл/мин.

Выполнение измерений

В инжектор хроматографа микрошприцем вводят 0,005 см3 каждого стандартного раствора ДНС-производного биогенных аминов и определяют времена удерживания и площади пиков на хроматограмме. Градуировку проводят через каждые 6 часов работы прибора.

В инжектор хроматографа микрошприцем вводят 0,005 см3 экстракта пищевого продукта или БАД. На хроматограмме определяют площади пиков, соответствующие по временам удерживанию стандартным ДНС-производным биогенных аминов. Если пик на хроматограмме экстракта выходит за пределы шкалы, анализ проводят повторно после разбавления исходного раствора.

Вычисление результатов анализа

Содержание каждого биогенного амина в анализируемой пробе рассчитывают по формуле:

                         m x S    x V    x V

                              обр    общ    обр

                    М = ------------------------, где

                            S   x V  x V  х Р

                             ст    э    a

     М     - массовая концентрация БА, мг/кг или ррm,

     m     - массовая  доля  внешнего стандарта ДНС-амида, введенного для

             калибровки хроматографа, нг,

     S     - площадь пика исследуемого компонента;

      обр

     S     - средняя площадь пика внешнего стандарта ДНС-амида, введенного

      ст.    для калибровки хроматографа;

     V     - общий объем анализируемой пробы, мл;

      общ

     V     - объем экстракта, взятый для анализа, мл;

э

     V     - объем, в котором растворен сухой экстракт, мкл;

      обр.

     V     - объем экстракта, введенный в хроматограф, мл;

     Р     - навеска пробы, г.

Вычисления проводят до первого десятичного знака. За результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 10% по отношению к среденеарифметическому значению.

Относительное стандартное отклонение при определении аминов составляет 0,06-0,1. Степень извлечения - 85,3-93,4%.

Предел обнаружения метода 0,03 мг/кг для тирамина и 0,1 мг/кг для гистамина.

V. Метод определения полициклических ароматических углеводородов (ПАУ)

Сущность метода заключается в экстракции углеводородов из неомыляемой фракции липидов гексаном с последующей хроматографической очисткой, идентификацией и количественным определением ПАУ с помощью ВЭЖХ и спектрофлуориметрии, а также хромато-масс-спектрометрии.

Область применения метода распространяется в основном на БАД на основе рыбопродуктов, рыбьего жира и на основе растительных масел. Рекомендуемая масса пробы для анализа - 25-50 г.

Приведенные в методике варианты хроматографического разделения экстракта неомыляемой фракции липидов позволяют в зависимости от поставленной задачи реализовать имеющиеся в распоряжении аналитика приборы и реактивы.

В методику также включен как арбитражный - метод хромато-масс-спектрометрии.

Схема выделения полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) включает переэкстракцию ПАУ из гексанового раствора неомыляемой фракции липидов комплексообразователем - диметилформамидом и хроматографическую очистку экстракта на колонке с сефадексом LH-20. Анализ ПАУ проводят с помощью ВЭЖХ или низкотемпературной спектрофлуориметрии. Ввиду того, что бенз(а)пирен рассматривают в качестве индикатора загрязнения ПАУ, в методику включены прописи его выделения и определения. Первый способ позволяет определить бенз(а)пирен в сумме ПАУ методом низкотемпературной спектрофлуориметрии, второй предполагает его выделение из суммы ПАУ в тонком слое ацетилированной целлюлозы и определение методом спектрофлуориметрии при комнатной температуре.

1. Специфические аппаратура, материалы и реактивы

Жидкостной хроматограф со спектрофотометрическим (фотометрическим) и флуориметрическим детекторами и колонкой с обращенно-фазовым сорбентом (силикагель ОDS или C18).

Хромато-масс-спектрометр с автоматической системой обработки данных, энергией ионизирующих электронов 70 eV, диапазоном массовых чисел 40-420 а. е. м., с капиллярной колонкой с неполярной или слабополярной жидкой фазой.

Спектрофотометр флуоресцентный с монохроматорами на линиях возбуждения и эмиссии.

Спектрофотометр флуоресцентный с приставкой для анализа флуоресценции и фосфоресценции при температуре жидкого азота (типа Hitachi-850, MPF-44B).

Спектрометр ДФС-12 или ДФС-24.

Облучатель с переменной длиной волны на 250 и 360 нм типа ОЛД ТУ 64-1-2242-77.

Пластины стеклянные 20 х 20 см3 для тонкослойной хроматографии.

Колонки стеклянные длиной 250-500 мм и внутренним диаметром 10-15 мм со стеклянным пористым фильтром ПОР 160 и шлифом 14

Целлюлоза микрокристаллическая для хроматографии.

Силикагель для хроматографии 40-100 мкм.

Алюминия окись 5/40 мкм.

Сефадекс LH-20, "Фармация", Швеция.

Стандарты: флуорантен, пирен, бенз(а)антрацен, хризен, бенз(b)флуорантен, бенз(k)флуорантен, бенз(а)пирен, бенз(е)пирен, дибенз(a,h)антрацен, бенз(b)хризен, бенз(g,h,i)перилен, коронен, дибенз(а,е)пирен ("Serva", Германия).

2. Подготовка к испытанию

2.1. Приготовление растворителей

Все используемые органические растворители перегоняют общепринятым способом.

Диметилформамид перегоняют, добавив к 250 см3 растворителя 12 см3 воды и 30 см3 бензола.

Отбирают фракцию, выкипающую выше 153°C.

2.2. Подготовка сернокислого натрия безводного

1 кг сульфата натрия безводного заливают 2 дм3 перегнанного хлороформа или смеси хлороформа и метанола (1:1), оставляют на 3-4 ч или встряхивают в течение 1 ч на качалке в герметично закрытой колбе, суспензию отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывая осадок на фильтре 1 дм3 растворителя, высушивают осадок на воздухе до полного удаления растворителя, после чего прокаливают при температуре 400°C в течение 6 ч, хранят в колбе с притертой пробкой.

2.3. Приготовление адсорбентов для хроматографии

2.3.1. Приготовление ацетилированной целлюлозы для ТСХ

К 50 г микрокристаллической целлюлозы добавляют смесь 150 см3 бензола или толуола, 70 см3 уксусного ангидрида и 0,3 см3 концентрированной серной кислоты. Реакционную смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 6-8 ч, оставляют еще на 18 ч, после чего осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера и заливают 300 см3 этанола, оставляют на 24 ч. Отфильтровывают осадок, промывают его на фильтре 100 см3 этанола, дистиллированной водой до нейтральной реакции (5 х 300 см3) и сушат на воздухе. Для приготовления пластинки 5 г ацетилированной целлюлозы суспендируют в 15-20 см3 этанола и наносят ровным слоем на стеклянную пластинку 20 х 20 см. После полного испарения растворителя проверяют хроматографическую подвижность бенз(а)пирена в системе этанол-ацетон-вода, взятых в объемном соотношении 60:25:15. R_f бенз(а)пирена и бенз(k)флуорантена составляет 0,1 и 0,2, соответственно.

2.3.2. 10 г сефадекса заливают 50 см3 этанола и оставляют для набухания на 3-4 ч, после чего переносят на колонку. Над сорбентом до начала работы должен быть слой растворителя 0,5-1,0 см.

2.4. Приготовление растворов сравнения, внутренних стандартов

Для приготовления исходных растворов берут навески не менее 5 мг, растворяют в бензоле в мерных колбах объемом 50-100 см3 и хранят в холодильнике. Рабочие растворы готовят из исходных разведением в соответствующем растворителе. Концентрации рабочих растворов внутренних стандартов и растворов сравнения следующие.

Внутренние стандарты для хромато-масс-спектрометрического анализа:

- растворы сравнения и внутреннего стандарта для анализа ПАУ (ВЭЖХ)-100 мкг/см3.

Растворы сравнения для анализа ПАУ низкотемпературной спектрофлуориметрией:

- бенз(а)пирен - 1,0..,10..,100 нг/см3, перилен - 1..., 1,0 нг/см3, пирен, флуорантен, хризен, бенз(а)антрацен, бенз(b)флуорантен, бенз(k)флуорантен, дибенз(а,h)антрацен, дибенз(а,с)антрацен, бенз(е)пирен, бенз(g,h,i)перилен, дибенз(а,с)пирен, коронен - 1..,10..,100..,1000 нг/см3 (в бензоле).

Концентрация раствора сравнения для определения бенз(а)пирена спектрофлуориметрией при комнатной температуре: бенз(а)пирен - 20...100.., 1000 нг/см3.

3. Проведение испытания

3.1. Щелочной гидролиз и экстракция неомыляемой фракции липидов

50 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу вместимостью 1 000 см3, добавляют раствор 19,5 г гидроокиси калия в 250 см3 92%-ного этилового спирта, туда же помещают стеклянную трубочку-мешалку со впаянной стальной проволокой для перемешивания на магнитной мешалке. К реакционной смеси добавляют необходимые внутренние стандарты. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают при кипении реакционной массы и перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры и через холодильник добавляют 350 см3 воды. Полученный раствор переносят в делительную воронку на 1 000 см3 и экстрагируют трижды по 150 см3 гексана. Объединенные гексановые экстракты промывают в делительной воронке водой трижды по 50 см3, переносят в плоскодонную колбу, добавляют 30-40 г сульфата натрия и сушат экстракт в течение 24 ч. Полученный экстракт (экстракт А) - раствор неомыляемой фракции липидов, используют далее для выделения ПАУ.

3.2. Выделение ПАУ из неомыляемой фракции липидов (экстракта А)

3.2.1.Переэкстракция водным диметилформамидом

Экстракт А упаривают до объема 100 см3, переносят в делительную воронку емкостью 1 000 см3 и добавляют 100 см3 смеси диметилформамида и воды, взятых в объемном соотношении 9:1. Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 1 мин, отделяют нижний слой, а из верхнего гексанового экстрагируют ПАУ повторно, добавив в воронку новую порцию водного диметилформамида объемом 100 см3. Гексановый (верхний) слой отбрасывают, а объединенный диметилформамидный экстракт разбавляют 200 см3 воды и экстрагируют ПАУ из слоя разбавленного водой диметилформамида гексаном - трижды по 75 см3. Гексановые экстракты объединяют и промывают водой (4 раза по 50 см3), отделяют и сушат с 30 г безводного сульфата натрия в течение 1 ч. Обезвоженный экстракт упаривают до объема 1-1,5 см3, остаток растворителя удаляют в токе азота. Вещество в колбе (экстракт В) растворяют в 1-1,5 см3 этанола и очищают на колонке с сефадексом LH-20.

3.2.2. Хроматография на колонке с сефадексом LH-20

10 г сефадекса заливают 50 см3 этанола и оставляют для набухания на 3-4 ч, после чего гель переносят на стеклянную хроматографическую колонку, дают растворителю стечь и переносят на колонку раствор экстракта В, смывая его из колбы 2-3 раза небольшим количеством этанола, каждый раз давая растворителю полностью впитаться в слой геля. Элюируют вещество с колонки этанолом со скоростью 0,5 см3/мин, обеспечивая такой поток небольшим избыточным давлением тока воздуха или азота, подаваемого на колонку через насадку со шлифом, заполненную силикагелем и слоем ваты. Первую фракцию - 50 см3 этанола отбрасывают, вторую фракцию - 100 см3 этанола, содержащую ПАУ с числом циклов 4-7, собирают, упаривают растворитель и далее анализируют с помощью ВЭЖХ, низкотемпературной спектрофлуориметрии или используют для выделения бенз(а)пирена.

3.2.3. Выделение бенз(а)пирена из фракции ПАУ ТСХ на ацетилированной целлюлозе

Фракцию ПАУ растворяют в 1-1,5 см3 бензола и наносят вещество сплошной полосой на пластинку с ацетилированной целлюлозой размером 20 х 20 см, подготовленную, как указано в п. 2.3.1, оставляя снизу и с боков пластинки поля шириной 1,5-2,0 см. На стартовую линию бокового поля, отделенного от основного с помощью скальпеля, наносят в точку 1-2 мкл раствора бенз(а)пирена, с концентрацией 1 мкг/см3. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и проводят элюирование в смеси этанола-ацетон-вода (60:25:15). Камеру предварительно насыщают парами растворителя в течение 2-3 ч. Когда фронт растворителя достигнет 2 см от верхнего края пластинки, ее вынимают и отмечают зону бенз(а)пирена в УФ-свете с длиной волны 360 нм. Сорбент из зоны бенз(а)пирена (которая ниже зоны бенз(к)флуорантрена) собирают с помощью скальпеля на воронку Шотта и элюируют вещество бензолом (5 х 10 см3) в круглодонную колбу. Растворитель упаривают до небольшого объема, остаток отдувают в токе азота, затем добавляют 1 см3 бензола и анализируют с помощью спектрофлуориметрии при комнатной температуре.

3.3. Определение ПАУ с помощью ВЭЖХ

Рекомендуемые условия хроматографического разделения и детектирования ПАУ:

1) колонка Zorbax ODS 250 х 4 мм, подвижная фаза ацетонитрил-вода (84:16), скорость потока 1 см3/мин, детектор флуориметрический, длина волны возбуждающего света 280 нм, эмиссионного - 405 нм;

2) колонка та же, подвижная фаза метанол-вода (90:10), скорость потока 1,2 см3/мин, детектор спектрофотометрический при 254 или 290 нм.

3) колонка Supelcosil LC РАН 150 x 4,6 мм, подвижная фаза ацетонитрил-вода (80:20 или 85:15), скорость потока 1 см3/мин, детектор флуориметрический, длина волны возбуждающего света 300 нм, эмиссионного > 418 нм.

Объем анализируемой пробы определяют экспериментально. Он составляет не менее 200 мкл, объем вводимой пробы 10-20 мкл.

Расчет содержания компонентов суммы ПАУ (X) в образце проводят по следующим формулам:

а) по методу абсолютной калибровки:

                         М   x (S  - S  ) х 1000 x V

                          ст     х    хо            1

                    Х = ------------------------------, где

                              S   x 0,8 x G x V

                               ст              2

     M   - количество компонента, введенного в хроматограф со стандартным

      ст   раствором, мкг;

     S   - площадь пика компонента, введенного со стандартным раствором;

      ст

     S   - площадь компонента на хроматограмме "холостого опыта";

xo

     V   - объем раствора пробы, мкл;

     V   - объем раствора пробы, введенной в хроматограф, мкл;

     S   - площадь пика компонента на хроматограмме пробы;

     G   - масса образца, г.

б) по методу внутреннего стандарта (добавка бенз(b)хризена)

                      М   x (S  - S  ) х 1000 x V

                       ст     х    хо            1

                 Х = ------------------------------, где

                             S   x G x V

                              ст        2

     М   - количество введенного в образец внутреннего стандарта, мкг,

      ст

     К   - коэффициент      пересчета,    определяемый экспериментально в

           зависимости    от    выбранных   условий   детектирования   по

           хроматограмме стандартной смеси ПАУ, включающей бенз(b)хризен.

           При  длине  волны возбуждающего света 360 нм и эмиссионного  >

           418   нм,  этот коэффициент равен для:

         - бенз(b)хризена - 1,00;

         - пирена - 42,40;

         - бенз(e)пирена - 26,10;

         - бенз(b)флуорантена - 0,99;

         - бенз(k)флуорантена - 0,30;

         - бенз(a)пирена-3,00;

         - бенз(a)антрацена -19,20.

3.4. Определение ПАУ методом низкотемпературной спектрофлуориметрии

3.4.1. Определение бенз(а)пирена в сумме ПАУ методом добавки

Фракцию ПАУ, полученную по п. 3.2.2, растворяют в 5-10 см3 бензола, из этого раствора в пробирку емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 и добавляют к нему 2 см3 н-октана, получая таким образом раствор с нулевой добавкой бенз(а)пирена.

Спектры люминесценции получают на спектрометре дифракционном ДФС-12 или ДФС-24, а также на любом спектрофлуориметре с разрешением не менее 0,3 нм в области 380-450 нм.

При перекрытом потоке УФ-излучения закрепляют пробирку, опущенную в прозрачный сосуд Дьюара, перед щелью спектрометра; спустя 2 мин открывают доступ УФ-излучению к замерзшему раствору. Регулируя щели спектрометра, добиваются, чтобы интенсивность сигнала, создаваемого люминесценцией фона при длине волны 401,5 нм, не превышала 20% шкалы. Записывают на спектрометре спектрограмму люминесценции в области 401,5-410 нм. Наличие в квазилинейчатом спектре люминесценции раствора фракции ПАУ полос с максимумом 403,0 нм (более интенсивная) и 408,5 нм (менее интенсивная) свидетельствует о присутствии бенз(а)пирена в этой фракции. Запись повторяют не менее двух раз при воспроизводимости не ниже, чем 10% интенсивности сигнала при 403 нм. По интенсивности в максимуме люминесценции с длиной волны 403 нм в сравнении с интенсивностью этой линии в спектрах стандартных растворов бенз(а)пирена, записанных при тех же условиях возбуждения и регистрации, определяют концентрацию стандартного раствора бенз(а)пирена для анализа методом добавки. Если интенсивность линии 403 нм в спектре исследуемого раствора с нулевой добавкой несравнимо ниже, чем интенсивность этой линии в спектре стандартного раствора концентрации 1 нг/см3, исходный раствор фракции ПАУ концентрируют до меньшего объема и готовят новый раствор с нулевой добавкой, а затем повторно регистрируют его спектр и сравнивают высоту пика на спектрограмме с высотой пика той же линии в спектре стандарта. Если интенсивность линии 403 нм в спектре исследуемого раствора выше, чем в спектре стандартного раствора концентрации 100 нг/см3, то исследуемый раствор разбавляют в таком разведении, чтобы интенсивность линии 403 нм в получаемом растворе с нулевой добавкой не превышала интенсивности этой линии, даваемой указанным выше стандартным раствором.

Для определения концентрации исследуемого раствора далее готовят пробу с добавкой, соответствующей концентрации нулевого раствора. Для этого в пробирку на 10 см3 вносят 1 см3 исследуемого раствора в том же разведении, что и раствора с нулевой добавкой, а также 1 см3 н-октана и 1 см3 стандартного раствора с концентрацией, выбранной по результатам предварительной оценки, в диапазоне 0,1-100 нг/см3. Записывают спектрограмму исследуемого раствора с добавкой, как описано выше. При правильном выборе концентрации раствора-добавки высоты пиков полосы 403 нм исследуемого раствора и раствора с нулевой добавкой должны быть сравнимыми, при этом высота пика раствора с нулевой добавкой должна быть достоверно ниже. Если высота пика на спектрограмме раствора с добавкой на порядок выше, чем у раствора с нулевой добавкой, приготавливают новый раствор с добавкой меньшей концентрации. Если высоты пиков сравнимы для обоих растворов, в качестве добавки используется стандартный раствор большей концентрации (но не выше 100 нг/см3). Если высота пика на спектрограмме раствора с добавкой неизмеримо ниже высоты той же линии в спектре стандартного раствора той же концентрации, то это может быть связано с гашением люминесценции примесями. В этом случае раствор разбавляют н-октаном в 10-100 раз и повторяют запись спектров растворов с нулевой добавкой и с добавкой стандартного раствора соответствующей концентрации.

Измеряют на спектрограмме высоту спектральной линии в максимуме при 403 нм над уровнем фона, создаваемого люминесценцией примесей при 401,5 нм в растворе с нулевой добавкой (Y_0 абсолютная) и высоту фона при той же длине волны над уровнем темнового тока (Y_0 фона абсолютная) и вычисляют отношение:

                            Y абсолютная

                      Y' = ------------------- , где

                       0   Y       абсолютная

                            0 фона

     Y' - относительная интенсивность аналитической линии в растворе с

      0       0-добавкой.

Аналогично вычисляют Y''_0 для повторной спектрограммы раствора с нулевой добавкой и находят:

                                  Y' + Y''

                                   0    0

                           Y  = -----------.

                            0        2

Измеряют на спектрограмме высоту спектральной линии в максимуме при 403 нм над уровнем фона при 401,5 нм в растворе с концентрацией С_0 (Y_1 абсолютная) и высоту фона при 401,5 нм над уровнем темнового тока (Y_1 фона абсолютная) и вычисляют отношение этих величин:

                           Y  абсолютная

                     Y' = ------------------- , где

                      0   Y       абсолютная

                           1 фона

     Y  - относительная интенсивность   аналитической  линии  раствора  с

      1   добавкой С концентрацией С_0.

Аналогично вычисляют Y"_1 для повторной спектрограммы этого раствора и находят среднее значение:

                                  Y' + Y''

                                   1    1

                           Y  = -----------.

                            1        2

Вычисляют концентрацию бенз(а)пирена в исследуемой фракции по формуле:

                                  Y  x C

                                   0    0

                           C  = ---------- (г/см3).

                            x    Y  - Y

                                  1    0

     Вычисляют содержание бенз(а)пирена (X) в образце по формуле:

                   С  х V х 1000 х n х 10

                    x    1

              Х = ------------------------- мкг/кг, где

                         G x 0,8

     V   - объем раствора фракции в бензоле, см3;

     n   - степень разбавления раствора (n = 1, если фракцию не разбавляют

           и не концентрируют для окончательного анализа);

     0,8 - поправка на полноту извлечения;

     G   - масса образца, г.

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

4.7.2. Определение компонентов фракции ПАУ

Для количественного определения во фракции ПАУ 17 наиболее часто исследуемых соединений последовательно записывают спектры люминесценции раствора ПАУ при селективных для каждого из этих ПАУ длинах волн возбуждающего и эмиссионного света, приведенных в табл. 57

Таблица 57

Спектры люминесценции ПАУ

Соединение	ламбда_в	ламбда_эм	Соединение	ламбда_в	ламбда_эм
Пирен	338	372	бенз(k)флуорантен	310	403
бенз(a)пирен	298	403	дибенз(a,h)пирен	313	448
Коронен	307	444	бенз(e)пирен	334	388
Фенантрен	255	347	бенз(g,h,i)перилен	303	420
Перилен	414	444	флоурантен	362	436
дибенз(a,h)антрацен	301	394	бенз(b)флуорантен	304	392
Хризен	272	361	дибенз(a,c)антрацен	291	375
Инденопирен	362	463	дибенз(a,i)пирен	398	431
бенз(a)антрацен	292	384

При этом для каждого из 17 ПАУ готовят из исходного раствора фракции ПАУ серию из трех рабочих растворов, содержащих по 0,1 см3 исходного раствора, соответственно 0,1; 0,05 и 0,00 см3 н-октана и 0,00; 0,05 и 0,1 см3 эталонного раствора определяемого соединения с концентрацией, выбранной в зависимости от ориентировочно найденной его концентрации в исследуемом растворе. Для бенз(а)пирена диапазон концентраций эталонного раствора составляет 1-100 нг/см3 для перилена 1-10 нг/см3, для остальных ПАУ 1-1000 нг/см3. На полученных спектрограммах замеряют высоты спектральных линий в максимумах аналитических длин волн, приведенных в табл. 57, и определяют относительную интенсивность аналитических линий (аналогично п. 3.4.1). Расчет содержания компонентов фракции ПАУ в образце проводят по формуле, приведенной в разделе 3.4.1.

3.5. Определение бенз(а)пирена методом спектрофлуориметрии при комнатной температуре

Фракцию бенз(а)пирена, выделенную согласно п. 3.2.3, растворяют в 1 см3 бензола. В качестве раствора сравнения используют раствор, получаемый при добавлении 50-200 нг бенз(а)пирена к "холостому" опыту и разведенный в 1 см3 бензола. Записывают спектры флуоресценции этих растворов при длине волны возбуждающего света 388 нм в области 400-450 нм так, чтобы интенсивность в максимуме пика при 403-406 нм была не менее 25% и не более 90% шкалы. При необходимости изменяют разведение растворов и чувствительность прибора и снова записывают спектры в одном и том же режиме и при одинаковом разведении растворов.

Содержание бенз(а)пирена (X) в образце (мкг/кг) рассчитывают по следующей формуле:

                            Y  х C х 10000 х V

                       Х = --------------------, где

                              Y   x G x 0,75

                               ст

     С    - концентрация раствора стандарта, мкг/см3;

     Y    - интенсивность флуоресценции раствора пробы;

     Y    - интенсивность флуоресценции раствора сравнения;

      ст

     V    - объем пробы, см3;

     G    - масса образца, г;

     0,75 - поправка на полноту извлечения.

4. Метрологические характеристики

Таблица 58

Определяемый показатель	Метод анализа	Предел определения, мкг/кг	Rr, %	RR, %
Полициклические ароматические углеводороды (индивидуальные соединения)	ВЭЖХ с флуоресцентным детектором	0,2-2(1)	60	100
	Низкотемпературный люминесцентный	0,1-1(1)	45	90
Бенз(а)пирен	Спектрофлуориметрический	0,1	45	90

VI. Показатели окислительной порчи масел

1. Перекисное число

Метод основан на реакции взаимодействия продуктов окисления растительных масел и животных жиров (перекисей и гидроперекисей) с йодистым калием в растворе уксусной кислоты и хлороформа с последующим количественным определением выделившегося йода раствором тиосульфата натрия титрометрическим методом по ГОСТ Р (ИСО 3960-1998).

Специфические приборы и реактивы

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.

Колбы Кн-I-250-29/32 ТСХ по ГОСТ 25336.

Колба I (2)-1000-2 по ГОСТ 1770.

Стаканчики стеклянные цилиндрические для испытуемой пробы

Бюретки 1-1(2,3), 3-1(2)-5-0,02; 1 -1 (2,3)-1 (2)-10-0,05 по ГОСТ 29251.

Пипетки 2-2-1 (2)-1 по ГСТ 29297.

Цилиндры 1(3)-25, 1(3)-100 по ГОСТ 1770.

Кислота уксусная по ГОСТ 61 х.ч., ледяная, не содержащая кислорода.

Хлороформ по ГОСТ 20015 свежеперегнанный, не содержащий кислорода.

Калий йодистый.

Натрий серноватистокислый (тиосульфат натрия).

Стандарт-титры тиосульфата натрия 0,1 г-моль.

Крахмал растворимый.

Вода дистиллированная.

Проведение испытания

Готовят раствор крахмала: 5 г растворимого крахмала смешивают с 30 см3; воды, добавляют 1 000 см3 кипящей воды и кипятят в течение 3 мин.

Готовят раствор тиосульфата натрия из стандарт-титров (1 ампула на 1 дм3 дистиллированной воды). Для получения раствора тиосульфата натрия необходимых молярных концентраций 0,002 моль/дм3 и 0,01 моль/дм3 раствор разбавляют в 50 и 10 раз, соответственно. Разбавление проводят непосредственно перед использованием.

Раствор йодистого калия хранят в темном сосуде. Для приготовления 50%-ного раствора KJ нужно 12,5 г поместить в колбу на 25 см3 и долить до метки дистиллированной водой.

В колбу со взвешенной пробой приливают 10 см3 хлороформа, быстро растворяют пробу, приливают 15 см3 уксусной кислоты и 1 см3 50%-ного раствора йодистого калия, после чего колбу закрывают, перемешивают содержимое в течение 1 мин и оставляют на 20 мин в темном месте. Приливают в колбу 75 см3 воды, перемешивают и добавляют раствор крахмала до появления слабой однородной фиолетово-синей окраски. Выделившийся йод титруют раствором тиосульфата натрия до молочно-белой окраски, устойчивой в течение 5 сек.

Выполняют контрольное определение параллельно с основным определением.

Обработка результатов

Перекисное число вычисляют по формуле:

          X = 1000 x (V - V )x --- , ммоль акт. кислорода/кг, где

                           0     m

     V - объем    раствора     тиосульфата   натрия,  использованный  при

         определении, см3;

     V  - объем     раствора    тиосульфата  натрия,  использованный  при

      0   контрольном определении;

     С - действительная концентрация использованного раствора тиосульфата

         натрия,      вычисленная  с  учетом   поправки  к    номинальной

         концентрации;

     m - масса испытуемой пробы, г.

За определение принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений.

Расхождение между результатами двух независимых единичных определений, выполненных при использовании одного метода не должно превышать 10% от среднего значения перекисного числа для перекисных чисел менее 3 ммоль акт. кислорода/кг.

2. Кислотное число

Метод основан на реакции нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в маслах (ГОСТ 5476-64).

Специфические приборы и реактивы

Колбы конические вместимостью 250 мл по ГОСТ 10394-63.

ГАРАНТ:

См. ГОСТ 25336-82 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры", утвержденный постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670

Бюретки вместимостью 25 и 50 мл с делениями 0,1 мл по ГОСТ 1770-64.

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 1770-64 постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 18 ноября 1974 г. N 2547 с 1 января 1976 г. утвержден ГОСТ 1770-74

Микробюретки вместимостью 2 мл с делениями 0,01 мм.

Весы технические.

Баня водяная.

Фенолфталеин, 1%-ный спиртовой раствор.

Кали едкое, 0,1 Н водный раствор.

Эфир этиловый.

Спирт этиловый технический.

Проведение испытания

В коническую колбу на технических весах отвешивают 3-5 г испытуемого масла, приливают 50 см3 нейтрализованной смеси (спирта с этиловым эфиром) и взбалтывают. Полученный раствор при взбалтывании быстро титруют 0,1Н раствором едкого кали до получения слабо-розовой окраски, устойчивой в течение 30 сек.

Обработка результатов

Кислотное число испытуемого масла (X) в мг вычисляют по формуле:

KV

                            X = 5,61 х ----, где

V - объем 0,1 н раствора едкого кали или едкого натра, израсходованного на титрование, в см3;

К - поправка к титру 0,1 н раствора едкого кали или едкого натра;

G - навеска испытуемого масла;

5,611 - постоянный множитель, независимо от применяемой щелочи.

Конечный результат выражается как среднее арифметическое между двумя параллельными определениями: при испытании масел не более 0,06 мг.

<< Глава 4. Методы определения пищевых добавок в составе БАД		Приложение 1. >> Расчет метрологических характеристик методов и внутренний оперативный контроль качества результатов
	Содержание Руководство Р 4.1.1672-03 "Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище" (утв....

Глава 5. Методы исследований безопасности

ГАРАНТ:

ГАРАНТ:

ГАРАНТ:

ГАРАНТ:

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас