Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 54374-2011 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)" (утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 5 августа 2011 г. N 219-ст)

Poultry meat, edible offal and ready to cook products. Methods for detection and quantity determination of coliform bacteria

Дата введения - 1 июля 2012 г.

Введен впервые

1. Область применения

Настоящий стандарт распространяется на мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы (далее - продукт) и устанавливает методы наиболее вероятного числа, посева в/на агаризованные селективно-диагностические среды для выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia) (далее - колиформные бактерии).

2. Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 7218-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ Р ИСО 11133-1-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории

ГОСТ Р ИСО 11133-2-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред

ГОСТ Р 50396.0-92 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям

ГОСТ Р 52816-2007 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

ГОСТ Р 53597-2009 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29184-91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Термины, определения и сокращения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 52816, а также следующие сокращения.

НВЧ - наиболее вероятное число;

КОЕ - колониеобразующие единицы;

БГКП - бактерии группы кишечных палочек.

4. Сущность методов

Метод выявления колиформных бактерий основан на высеве определенного количества продукта и (или) его разведения в жидкую среду с лактозой, термостатировании при температуре (37 1) °С в течение (48 2) ч, подтверждении принадлежности, при необходимости, выросших микроорганизмов по морфологическим, культуральным признакам и биохимическим свойствам к колиформным бактериям.

Метод определения количества колиформных бактерий методом НВЧ основан на высеве определенного количества продукта и (или) его последовательных разведений в жидкую селективную среду с лактозой; термостатировании, учете положительных пробирок, подтверждении принадлежности, при необходимости, по морфологическим, культуральным признакам и биохимическим свойствам выросших микроорганизмов к колиформным бактериям. Метод определения наиболее вероятного числа колиформных бактерий предназначен для проб, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1  жидкого продукта менее 15 клеток колиформных бактерий.

Методы определения количества колиформных бактерий основаны на высеве определенного количества продукта и (или) его последовательных разведений в/на агаризованную селективно-диагностическую среду с лактозой, термостатировании, подсчете типичных и атипичных колоний, подтверждении принадлежности по морфологическим, культуральным признакам и биохимическим свойствам выросших микроорганизмов к колиформным бактериям.

Метод определения количества колиформных бактерий посевом в агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для проб, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1  жидкого продукта более 15 колониеобразующих единиц колиформных бактерий.

Метод определения количества колиформных бактерий посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для проб, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1  жидкого продукта более 150 колониеобразующих единиц колиформных бактерий.

5. Общие положения

5.1 Общие требования к проведению микробиологических исследований - по ГОСТ Р ИСО 7218.

5.2 Требования безопасности

Требования безопасности при работе с микроорганизмами - по ГОСТ Р ИСО 7218, с химическими реактивами - по ГОСТ 12.1.007, с электрооборудованием - по ГОСТ 12.1.019.

Требования пожарной безопасности - по ГОСТ 12.1.004.

5.3 Требования к персоналу - по ГОСТ Р ИСО 7218.

6. Средства измерений, аппаратура, материалы, культуральные среды и реактивы

6.1 Средства измерений, аппаратура, материалы, культуральные среды и реактивы - по ГОСТ Р 50396.0, ГОСТ Р 53597, ГОСТ Р ИСО 7218, ГОСТ Р 52816.

6.2 Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также материалов, реактивов, по качеству не ниже указанных в 6.1.

7. Подготовка к проведению испытаний

7.1 Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб - по ГОСТ Р 50396.0, ГОСТ Р 53597, ГОСТ Р ИСО 7218.

7.2 Приготовление разведений из пробы для анализа - по ГОСТ Р ИСО 7218, ГОСТ 26669.

7.3 Подготовка средств измерений, аппаратуры, оборудования, посуды и материалов - по ГОСТ Р 50396.0, ГОСТ Р ИСО 7218.

7.4 Подготовка и приготовление культуральных сред, растворов реактивов

Общие указания по приготовлению культуральных сред - по ГОСТ Р ИСО 11133-1.

7.4.1 Селективная обогатительная среда (лаурил сульфат триптозный бульон) по ГОСТ Р 52816.

7.4.2 Бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью по ГОСТ Р 50396.0, ГОСТ Р 52816.

7.4.3 Селективная обогатительная среда (бульон Мак-Конки) по ГОСТ Р 52816.

7.4.4 Среда Кесслера с лактозой по ГОСТ Р 50396.0, ГОСТ Р 52816.

7.4.5 Среда Хейфица по ГОСТ Р 50396.0.

7.4.6 Кристалл виолет нейтральный красный желчный лактозный агар (VRBL-агар) по ГОСТ Р 52816.

7.4.7 Агар лактозный с бриллиантовым зеленым и феноловым красным по ГОСТ Р 52816.

7.4.8 Среда Эндо по ГОСТ Р 50396.0.

7.4.9 Среда Гисса с лактозой по ГОСТ Р 50396.0, ГОСТ 10444.1.

7.4.10 ГРМ-агар (сухой питательный агар на основе гидролизата рыбной муки для культивирования бактерий) по ГОСТ Р 52816.

7.4.11 Мясо-пептонный агар по ГОСТ Р 50396.0.

7.4.12 Реактивы для окраски по Граму по ГОСТ 10444.1.

7.4.13 Диски индикаторные бумажные для определения оксидазы.

7.4.14 Реактивы для теста Григорсена по ГОСТ Р 52816.

7.4.15 Допускается использование других культуральных селективно-диагностических сред, в том числе хромогенных, разрешенных и предназначенных для выявления и определения колиформных бактерий.

7.4.16 Приготовление и правила использования культуральных сред промышленного производства проводят по ГОСТ Р ИСО 11133-2.

7.4.17 Методы контроля культуральных сред - по ГОСТ Р ИСО 11133-1.

7.4.18 Сроки и условия хранения культуральных сред - по ГОСТ Р ИСО 11133-1.

8. Проведение испытаний

8.1 Метод выявления колиформных бактерий - по ГОСТ Р 52816 (подраздел 9.1).

8.1.1 Оценка и выражение результатов

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

Пробирки с посевами, в которых отмечен рост микроорганизмов (помутнение среды), образование газа (наличие пузырьков газа в поплавках) и кислоты (изменение цвета среды), считают положительными, и обнаруженные микроорганизмы относятся к колиформным бактериям.

При выявлении колиформных бактерий отмечают присутствие или отсутствие их в Х г или в Х продукта.

Результаты исследований записывают как "БГКП обнаружены или не обнаружены в Х г () продукта".

8.1.2 Дополнительное подтверждение принадлежности выявленных бактерий к колиформным бактериям

8.1.2.1 Выделение чистой культуры на дифференциально-диагностических агаризованных средах и идентификация

При необходимости для дополнительного подтверждения принадлежности выявленных бактерий, выросших на жидких средах с образованием газа, к колиформным бактериям проводят пересевы для получения изолированных колоний по ГОСТ Р 50396.0, ГОСТ 26670 штрихом на поверхность одной из селективно-диагностических сред: VRDL-arap (см. 7.4.6), агар лактозныи с бриллиантовым зеленым и феноловым красным (см. 7.4.7), среда Эндо (см. 7.4.8). Посевы инкубируют при температуре (37 1) °С в течение (24 2) ч и отмечают рост типичных и атипичных колоний.

Типичные колонии колиформных бактерий:

- на VRBL-arape - пурпурно-красные колонии диаметром не менее 0,5 мм, иногда окружены красноватой зоной преципитата (осадка) желчи;

- агаре лактозном с бриллиантовым зеленым и феноловым красным - зеленоватые колонии, окруженные яркой желто-зеленой зоной;

- среде Эндо - красные, розовые, бледно-розовые колонии, часто с металлическим блеском. Атипичные колонии отличаются от типичных по цвету и размеру колоний.

8.1.2.2 Для дополнительного подтверждения отбирают не менее чем по пять типичных и атипичных колоний из чашек Петри с посевами (см. 8.1.2.1).

Атипичные колонии отбирают только те, в которых подтверждено наличие колиформных бактерий посевом в жидкую подтверждающую среду.

Каждую отобранную колонию пересевают на поверхность скошенного питательного агара (см. 7.4.10, 7.4.11). Посевы инкубируют при температуре (37 1) °С в течение (24 2) ч.

Принадлежность выросших бактерий к колиформным бактериям определяют по отношению к окраске по Граму, по отсутствию оксидазы и по ферментации лактозы.

8.1.2.3 Окраска по Граму

Из подготовленных культур (см. 8.1.2.2) готовят мазки и окрашивают по Граму по ГОСТ 30425. Допускается окраску по Граму заменять тестом Грегорсена по ГОСТ Р 52816.

8.1.2.4 Определение отсутствия оксидазы

Определение отсутствия оксидазы проводят по ГОСТ 29184.

Допускается использование дисков промышленного производства для определения оксидазы (см. 7.4.13).

8.1.2.5 Определение ферментации лактозы

Определение ферментации лактозы проводят по ГОСТ Р 52816.

8.1.2.6 Оценка результатов дополнительного подтверждения принадлежности выявленных бактерий к колиформным бактериям

По результатам дополнительного подтверждения к колиформным бактериям относят аэробные и факультативно-анаэробные не образующие спор грамотрицательные оксидазоотрицательные палочки, способные ферментировать лактозу с образованием кислоты и газа.

8.2 Определение количества колиформных бактерий

8.2.1 Определение количества колиформных бактерий методом НВЧ - по ГОСТ Р 52816.

Результаты выражают как "НВЧ колиформных бактерий в 1 г () продукта".

8.2.2 Определение количества колиформных бактерий методом посева в/на агаризованные селективно-диагностические среды

8.2.2.1 Подготовка к проведению исследований - по разделу 7.

8.2.2.2 Отбор и подготовка проб - по 7.1.

8.2.2.3 Приготовление разведений - по 7.2.

8.2.2.4 Посев - по ГОСТ Р 52816.

8.2.2.5 Термостатирование - по ГОСТ Р 52816.

8.2.2.6 Подсчет количества колоний по ГОСТ Р 52816.

8.2.2.7 Подтверждение принадлежности выявленных бактерий к колиформным бактериям

Для подтверждения принадлежности выявленных бактерий к колиформным бактериям отбирают не менее чем по пять типичных и атипичных колоний. Каждую отобранную колонию пересевают в пробирку с одной из жидких питательных сред (см. 7.4.2 - 7.4.5). Проведение подтверждения принадлежности выявленных бактерий к колиформным бактериям - по 8.1.1.

Оценка и выражение результатов по проведенному подтверждению - по 8.1.2.

8.2.2.8 Подсчет и выражение результатов

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

В случае, когда не менее чем в четырех из пяти типичных и атипичных колоний подтвержден рост колиформных бактерий (не менее 80%) считают, что все колонии принадлежат к колиформным бактериям. В остальных случаях количество колиформных бактерий определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству колоний, взятых для подтверждения.

Расчет количества колиформных бактерий, определенного посевом в/на агаризованные селективно-диагностические среды, на 1 г () продукта проводят по ГОСТ Р ИСО 7218, ГОСТ 26670.

Результаты определения количества колиформных бактерий в пробе продукта выражают и записывают по ГОСТ Р ИСО 7218, ГОСТ 26670.